Unión covalente de BMP-2 en las superficies utilizando una monocapa enfoque de auto-ensamblada

Chemistry

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Summary

Se describe un método para llevar a cabo la inmovilización eficaz de BMP-2 en las superficies. Nuestro enfoque se basa en la formación de una capa monomolecular auto-ensamblada para lograr la unión de BMP-2 a través de sus residuos de amina libres covalente. Este método es una herramienta útil para el estudio de señalización en la membrana celular.

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Pohl, T. L., Schwab, E. H., Cavalcanti-Adam, E. A. Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach. J. Vis. Exp. (78), e50842, doi:10.3791/50842 (2013).

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Abstract

Proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) es un factor de crecimiento embebido en la matriz extracelular del tejido óseo. BMP-2 actúa como desencadenante de la diferenciación de células mesenquimales en osteoblastos, estimulando así la cicatrización y la formación de hueso novo. El uso clínico de la humana recombinante BMP-2 (rhBMP-2), en relación con los andamios ha suscitado controversias recientes, en base a la forma de presentación y la cantidad que se va a entregar. El protocolo presentado aquí proporciona una forma simple y eficiente para entregar BMP-2 para los estudios in vitro sobre las células. Describimos cómo formar una monocapa auto-ensamblado que consiste en un engarce heterobifuncional, y mostramos el paso de unión posterior para obtener la inmovilización covalente de rhBMP-2. Con este enfoque es posible lograr una presentación sostenida de BMP-2, mientras que el mantenimiento de la actividad biológica de la proteína. De hecho, la inmovilización de superficie de BMP-2 permite que las investigaciones dirigidas por la prevención de anuncios inespecíficosdesorción, mientras que la reducción de la cantidad de factor de crecimiento y, más notablemente, lo que dificulta la liberación no controlada de la superficie. Ambos eventos de señalización de corto y largo plazo provocados por BMP-2 se llevan a cabo cuando las células están expuestas a las superficies que presentan inmovilizado covalentemente rhBMP-2, por lo que este enfoque adecuado para los estudios in vitro sobre las respuestas celulares a BMP-2 estimulación.

Introduction

Proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) es un miembro del factor de crecimiento transformante (TGF-β) de la familia y actúa como inductor de la formación de novo de hueso, así como regulador de varios tejidos durante el desarrollo embrionario y adulto homeostasis 1-3. Cada monómero de la proteína biológicamente activa homodimérica BMP-2 contiene un motivo de "nudo de cisteína", que está altamente conservada en todas las BMP 4. Seis de los siete residuos de cisteína forman enlaces disulfuro intramoleculares que estabilizan cada monómero, mientras que la séptima cisteína está involucrado en la dimerización, formando un enlace intermolecular entre los dos monómeros 5,6. Este nudo de cisteína altamente conservados define la estructura tridimensional de la proteína BMP-2 y determina sus propiedades únicas, tales como resistencia al calor, desnaturalizantes y ácida de pH 7-9. BMP-2 se une a receptores transmembrana quinasa serina / treonina, induciendo de este modo la transducción de señales 12-14.

En el hueso, BMP-2 induce la diferenciación de células madre mesenquimales en osteoblastos, estimulando así la curación y la formación de novo de hueso. Actualmente, expresada de forma recombinante BMP-2 se aplica clínicamente para mejorar la curación de los sitios fracturados. Una estrategia común en ingeniería de tejido óseo es el uso de factores de crecimiento inyectables, que es menos invasiva en comparación con los sistemas de suministro locales. Sin embargo, estudios in vivo y aplicaciones clínicas han demostrado que la vida media biológica corta, loc inespecíficazación y rápida de domiciliación de BMP-2 puede dar lugar a varios problemas locales, ectópicos y sistémicos 15. Por lo tanto, para obtener una presentación eficaz, el atrapamiento o la inmovilización de la BMP-2 dentro o sobre materiales es necesario para su entrega local y sostenida en el sitio diana. La liberación sostenida se puede lograr con los enfoques de retención no covalentes, tales como atrapamiento físico, adsorción o de iones complejación 16. Sin embargo, se sabe que la adsorción no específica de proteínas a superficies puede resultados en la desnaturalización de las moléculas 17. Para la unión de factores de crecimiento covalente, diferentes tipos de soportes se han desarrollado en la última década. El uso de moléculas de unión bifuncional que se dirigen a grupos amino o carboxilo de la proteína, por ejemplo, es un tipo de enfoque que no requiere necesariamente la modificación de proteínas para lograr su inmovilización. De hecho, mientras que la modificación de proteínas ofrece la ventaja de controlar la orientación de proteína,la introducción de dominios artificiales, etiquetas de péptidos y cadenas específicas de sitio puede alterar la actividad biológica de factores de crecimiento 17. Por lo tanto, para eludir la desnaturalización debida a la interacción con el material de apoyo, las superficies se pueden funcionalizar de antemano, por ejemplo, con una capa monomolecular auto-ensamblada (SAM) de una molécula de unión, seguido por acoplamiento del factor deseado 18. Hemos utilizado un enfoque basado en el SAM para inmovilizar covalentemente BMP-2 en una superficie por la orientación de sus residuos amino libres y hemos demostrado que la proteína inmovilizada conserva tanto su actividad biológica a corto y largo plazo 19. Este protocolo proporciona una forma simple y eficiente para entregar BMP-2 a las células para estudios in vitro de los mecanismos que se producen en la membrana celular y regulan la señalización intracelular responsable de la señalización de osteogénico.

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Protocol

1. Síntesis de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroxisuccinimida éster (MU-NHS)

  1. Añadir gota a gota una solución de 500 mg de N-hidroxisuccinimida y 30 mg de 4 - (dimetilamino) piridina en 10 ml de acetona (PA) a 1 g de ácido 11-mercaptoundecanoico en 40 ml de diclorometano (PA) a temperatura ambiente (RT).
  2. Enfriar la reacción a 0 ° C y añadir gota a gota 1,1 g de N, N '-diciclohexilcarbodiimida en 10 ml de diclorometano (bajo atmósfera de nitrógeno). Mantener la reacción a baja temperatura durante 1 hora y después se agita a TA durante la noche.
  3. Se filtra el precipitado y se seca a presión reducida. El producto se purifica mediante cromatografía flash con benceno petróleo y acetato de etilo (pa) en una proporción de 1:1.

2. Preparación de capas de oro homogéneos

  1. Cubreobjetos de vidrio limpias con toallitas de precisión y sonicar ellos durante 5 minutos en una solución que contiene una mezcla 1:1 de acetato de etilo (pa) y metanol (pa). Rinse sustratos con metanol y se secan bajo flujo de nitrógeno.
  2. Coloca los sustratos limpios en el dispositivo de revestimiento por bombardeo iónico. Evacuar la cámara. Retire la capa de óxido de cromo superior de la meta de cromo mediante pulverización durante 60 segundos. Colocar las muestras por debajo de la viga de metal y recubrirlos con una capa de cromo de 10 nm, seguido por recubrimiento con una capa de oro de 40 nm.

3. Inmovilización de la superficie de la BMP-2

  1. Disolver MU-NHS en N, N-dimethlyformamide (DMF) a una concentración final de aproximadamente 1 mM y se incuba sustratos de oro en la solución MU-NHS a TA durante 4 h bajo atmósfera de nitrógeno.
  2. Superficies Someter a ultrasonidos en DMF durante 2 min, enjuague con DMF y MeOH y se secan bajo flujo de nitrógeno.
  3. Preparar una solución madre de rhBMP-2 en HCl 4 mM estéril con una concentración de 100 g / ml (almacenar alícuotas a -80 ° C). Para diluciones de trabajo (3,5 mg / ml), se diluye la solución madre en PBS / NaCl (PBS que contenía 1 M de NaCl) y unJUSTE a pH 8,5 inmediatamente antes del uso.
  4. Incubar superficies funcionalizadas MU-NHS en la solución de trabajo de rhBMP-2 a 4 ° C durante la noche. Aspirar el sobrenadante de la incubación. Superficies Sonicar en PBS / NaCl durante 2 minutos y se lavan 3 veces con PBS estéril / NaCl.

4. Caracterización de superficies

  1. Para bloquear la adsorción no específica del anticuerpo, se incuban las superficies con un 5% de BSA (w / v) en solución de PBS durante 1 hora a TA, seguido de incubación con un anticuerpo anti-BMP-2 (1:100 en 1% (w / v ) solución de BSA / PBS) durante 1 hora a TA. Lave las superficies dos veces con PBS y déjelos en remojo durante 30 seg.
  2. Incubar sustratos con anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:1000 en 1% (w / v) de solución de BSA / PBS) durante 30 min a TA, a continuación, lavar dos veces con PBS.
  3. Utilice ensayo de rojo Ampliflu para medir la actividad enzimática de HRP a 570 nm con un lector de placas.

5. Análisis de la Actividad Biológica

  1. Seed 1 x 10 5 ratón mioblastos C2C12 por pocillo en 6 pocillos plAtes en medio de crecimiento, que consisten en un DMEM de alta glucosa que contenía piruvato suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina y se incuba durante 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2.
  2. Morir de hambre las células en DMEM libre de suero durante 3-5 horas antes de la siembra en las superficies decoradas con inmovilizada BMP-2.
  3. Para la investigación de la inducción de la señalización de corto plazo, sustituir el medio por 200 l DMEM libre de suero y colocar los inmovilizados BMP-2 superficies superiores a las células. La superficie debe ser manejado con pinzas de punta fina para evitar que se raye.
  4. Retire suavemente las superficies y aspirar el medio con una pipeta, se lavan las células dos veces con PBS. Continúe con el análisis de las respuestas de células.
  5. Para el análisis de la actividad biológica a largo plazo, células de la placa en las superficies y la cultura ellos a 37 ° C / 5% de CO 2 en condiciones de suero bajas (2% de FBS) durante seis días.

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Representative Results

En nuestra configuración, el oro fue elegido como excipiente, ya que proporciona un sistema biológico no específico pero químicamente sintonizable. Además, la aplicación de las monocapas de autoensamblaje implica muchos beneficios: SAM adsorber de forma espontánea a través de sus "cabeza-grupos" en metales y forman monocapas con pocos defectos, mientras que sus grupos terminales funcionales se pueden modificar adicionalmente. Por tanto, proporcionan una plataforma para adaptar las propiedades de la interfaz de una manera todavía muy adaptable controlado 20.

Para la inmovilización de la BMP-2 en las superficies recubiertas de oro, se utilizó un enfoque de dos pasos: 1) unión del enlazador MU-NHS para la capa de oro, y luego 2) hacer reaccionar el enlazador con la proteína (véase la Figura 1). Para demostrar la unión de la rhBMP-2, se utilizó un inmunoensayo enzimático. En este ensayo, las superficies de presentación de inmovilizado de rhBMP-2 se incubaron con un anticuerpo específico de BMP-2 y un anticuerpo secundario conjugado con HRP. La unión de este último puede ser Determined utilizando una solución Ampliflu rojo. En presencia de peróxido de hidrógeno, el HRP cataliza la conversión de la incoloro Ampliflu rojo (10-acetil-3 ,7-dihidroxifenoxazina) en el compuesto fluorescente resorufina. No se detectaron superficie inmovilizada de rhBMP-2 (IBMP-2) antes y después de acercarse a las células adherentes desde arriba con superficies funcionalizadas. Por favor, tenga en cuenta que para la detección de rhBMP con el ensayo Ampliflu Red, las muestras están sujetas a varias etapas de incubación y los tratamientos. Por lo tanto, no es factible para investigar la misma superficie antes y después de la estimulación celular. Figura 2A muestra el éxito de unión de la rhBMP-2 a la superficie en una conformación reconocida por el anticuerpo anti-BMP-2 de IgG. Figura 2B muestra un IBMP- 2 de superficie que se utilizó para estimular las células durante 30 min antes de la inmunoensayo HRP. Incluso después de la estimulación de células se detecta la proteína en la superficie.

Las respuestas celulares a las superficies que presentan rh inmovilizadoBMP-2 se evaluó y se comparó con el efecto de sustratos de oro no tratados (control negativo). Con el fin de minimizar la influencia del proceso de adhesión en el análisis de la señalización de corto plazo, una especial configuración fue desarrollado para la estimulación de células. En este caso, las células C2C12 fueron estimulados durante 30 min por rhBMP-2 superficies funcionalizadas se acercan desde la parte superior. La línea celular de mioblastos de ratón C2C12 es una línea de células precursoras mesenquimales pluripotentes, que es ampliamente utilizado como un sistema modelo para estudiar la etapa temprana de la diferenciación osteogénica durante la formación de hueso en los tejidos musculares. En este modelo, la BMP-2 inhibe la diferenciación de las células en miotubos multinucleados y osteoblastos induce fenotipos 21. La activación de Smad 1/5/8, que son reporteros de aguas abajo de la vía de señalización de BMP-2, es analizada por Western Blot. Como se muestra en la Figura 3A, la fosforilación de Smad se observa después de 30 min de estimulación por IBMP-2, mientras que no se produce la fosforilación de Smad 1/5/8en las células expuestas a las muestras de oro no tratados. Este resultado indica que el proceso de inmovilización no altera BMP-2 la actividad a corto plazo y desencadena los primeros pasos en la señalización Smad.

Para determinar si IBMP-2 afecta a la diferenciación osteogénica a largo plazo, el nivel de expresión de la fosfatasa alcalina (ALP), un marcador de osteogénico, fue investigado por un ensayo colorimétrico. La actividad de ALP de las células C2C12 se midió después de incubar las células durante 6 días en oro liso (de control) y IBMP-2 superficies. La actividad de ALP en lisados ​​de células cultivadas en IBMP-2 superficies muestra una absorción significativamente mayor en comparación con el control (Figura 3B). Este resultado revela que IBMP-2 induce la expresión de la ALP marcador osteogénico en las células C2C12. Esta línea celular se sabe diferenciar a una confluencia de llegar en condiciones de bajo suero, formando así miotubos y expresar proteínas miogénicos característicos. Sin embargo, el tratamiento con BMP-2 provoca un cambio enla vía de diferenciación de mioblástica a osteoblástica, por lo tanto, suprimir la formación de miotubos. Para investigar el efecto de IBMP-2 en la miogénesis, células C2C12 se sembraron directamente en el oro (control) o superficies funcionalizadas y se cultivaron bajo condiciones de diferenciación (bajo en suero). Después de 6 días, se realizó tinción de la cadena pesada de miosina (MHC). Como se muestra en la Figura 3C, las células C2C12 fallan para formar miotubos MHC positivas en presencia de IBMP-2, pero no sobre sustratos de oro.

Figura 1
Figura 1. Esquema del proceso de inmovilización de rhBMP-2 sobre superficies de oro. Cubreobjetos de vidrio se recubre con una capa de oro y posteriormente se incubaron con un enlazador heterobifuncional (MU-NHS) que resulta en una capa monomolecular auto-ensamblada funcionalizado-NHS (SAM). Las aminas primarias de la BMP-2 reaccionan con el enlazador lo que coproteína valently inmovilizada sobre el sustrato. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2. Unido a la superficie de rhBMP-2 se puede detectar por inmunoensayo enzimático antes (A), así como después (B) los experimentos de estimulación de células inmovilizadas. RhBMP-2 se cuantificó mediante el uso de ensayo colorimétrico Ampliflu rojo. La absorción se midió a 570 nm y los datos se normalizaron para controlar (superficies de oro no tratado) valores. Las barras de error representan la desviación estándar de la media n> 3.

Figura 3
Figura 3. Inmovilizado rhBMP-2 sigue siendo biológicamente activa e induce a corto plazo,así como eventos de señalización a largo plazo. (A) células C2C12 se estimularon durante 30 min por la exposición a superficies de oro (de control) y las superficies con inmovilizado covalentemente rhBMP-2 (IBMP-2) se aproxima desde la parte superior. Después de la lisis de células, las muestras se sometieron a inmunotransferencia para p-Smad1/5/8 y β-actina. (B) La actividad enzimática de la fosfatasa alcalina (ALP) indica la diferenciación osteogénica de las células C2C12 y se midió a partir de lisados ​​de células después de una incubación de 6-día periodo en el control o IBMP-2 superficies, respectivamente. Actividad de la ALP se midió como absorbancia a 405 nm. Gráfico de barras muestra los datos obtenidos después de una reacción de 60 min. Las barras de error indican la desviación estándar, n = 3, * p <0,01. (C) células C2C12 fueron sembradas en superficies indicadas y se cultivaron durante 6 días bajo condiciones bajas de suero para permitir la miogénesis. Las imágenes muestran la cadena de miosina pesada (MHC) tinción de miotubos multinucleados (verde) y la tinción de los núcleos con DAPI (azul). Imagen magnificación de 20x.

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Discussion

En este protocolo se describe la preparación de superficies funcionalizadas con rhBMP-2 bioactivo. Este enfoque comprende dos etapas: 1) la formación inicial de una monocapa auto-montaje (SAM) de un conector bifuncional en la superficie de oro, 2) la inmovilización covalente de la proteína rhBMP-2. En trabajos anteriores, hemos validado la unión efectiva del enlazador bifuncional y el factor de crecimiento, y demostramos que superficie inmovilizada rhBMP-2 mantiene su actividad biológica 19. La bioactividad de los factores de crecimiento que se presentan en una forma inmovilizada también se ha demostrado en otros estudios, lo que indica que la liberación de las proteínas y su posterior internalización no son esenciales para la estimulación de células 24,25. De hecho, la inmovilización covalente de factores de crecimiento permite la estimulación sostenida de las células diana, mientras que el mantenimiento de una dosificación eficaz debido a una mayor tasa de ocupación de los diferentes tipos de receptores en la membrana celular 22,23,26-28.

Para la preparación de las superficies que presentan inmovilizada rhBMP-2, se debe tener cuidado en el manejo de las superficies a lo largo de todo el procedimiento y en la preparación de la solución de rhBMP-2. Los cubreobjetos de vidrio deben estar limpios y secos y no hay señales de defectos o impurezas deben ser visibles. Rayar la superficie con unas pinzas y pipetas deben ser evitados. Para la etapa de funcionalización de la superficie utilizando la rhBMP-2, es esencial utilizar una proteína recombinante libre de soporte, es decir, sin la adición de albúmina de suero bovino en la preparación, para evitar la inmovilización no deseada de la portadora en la superficie. El rhBMP-2 de stock (100 g / ml) se disolvió en HCl 4 mM. Cuando las superficies se incuban con la solución de rhBMP-2, el pH debe ser ajustado a la posición neutra a una ligera pH alcalino para mejorar la reacción del grupo amino de la proteína con el grupo NHS del enlazador unido a la superficie. Si el pH es demasiado bajo, el grupo NHS puede ser hidrolizado antes de que pueda reaccionar ingenioh los grupos amino de la proteína. Utilizamos PBS que contenía 1 M NaCl 29 y añadimos rhBMP-2 en stock y luego ajustar el pH con KOH (10 mM).

Con este protocolo se logró la inmovilización exitosa bioactivo rhBMP-2 en las superficies debido a que: 1) se estableció un enfoque de dos pasos; 2) se utilizó un enlazador adecuado para obtener la distancia de la superficie y de obligar a la proteína sin mayores interferencias en su interacción con el receptor. El alcanotiol-amina reactiva, éster de 11-mercaptoundecanoyl-N-hidroxisuccinimida (MU-NHS), fue atado al sustrato de oro en la primera etapa. Como alcanotioles auto-ensamblan en metales como el oro, la formación de una monocapa altamente ordenada, que facilitan la decoración de superficies con una variedad de moléculas conectoras 30-32. El SAM protege biomoléculas del contacto directo con la superficie sólida, minimizando de este modo el riesgo de desnaturalización 32. Además, la longitud del enlazador también determina el REActividad del SAM. Los grupos de NHS de enlazadores que consisten en al menos once átomos de carbono, como el MU-NHS, son más accesibles, lo que resulta en un aumento de la inmovilización de proteínas en comparación con la unión a enlazadores más cortos 34. La inmovilización de rhBMP-2 se produce a través del desplazamiento del grupo NHS por los residuos de lisina de la proteína 34. Considerando sólo el medio ambiente estérico, la reacción de los grupos NHS superficie inmovilizada más probable tiene lugar en los residuos N-terminales flexibles 35. Sin embargo, como se muestra para otros ligandos, la longitud y la flexibilidad del enlazador pueden permitir la interacción con otro modo estéricamente impedido sitios de unión, compensando así la orientación desfavorable 36,37. En trabajos no publicados se comparó la de un solo paso con una estrategia de inmovilización de dos pasos. La comparación entre el uso de una solución que contiene tanto proteínas y enlazadores, y la superficie secuencial de unión del enlazador y la proteína, mostró que sólo los dos-estrategia de paso dio como resultado la inmovilización del ligando bioactivo. Esto podría ser debido a un efecto de protección de la SAM, lo que dificulta la desnaturalización de proteínas que de otro modo podría tener lugar en el oro. Además, puesto que el enlazador ya está anclada a la superficie, la reticulación entre las proteínas a través de los grupos terminales del enlazador y su inactivación resultante se eluden 38.

Para los experimentos con las células estimuladas con inmovilizada en la superficie de rhBMP-2, es crucial para determinar de antemano que C2C12 no forman miotubos en el matraz de cultivo antes de la siembra ellos sobre el sustrato. Por lo tanto, las células tienen que ser mantenidos subconfluent en la cultura. El lote de suero fetal bovino utilizado para el cultivo y para los experimentos tiene que ser probado para asegurar que no hay estímulos osteogénicas están presentes. Esto se lleva a cabo usando el ensayo Quantikine para la detección de las proteínas morfogenéticas del hueso y mediante pruebas de las células para marcadores de diferenciación osteogénicas, por ejemplo Alkal la expresión de fosfatasa ine. Al manipular los sustratos para la estimulación de la parte superior de las culturas, de nuevo es importante evitar cualquier rasguño con las pinzas. El secado de la cultura y la compresión de las células se debe evitar en cualquier caso, de lo contrario la distorsión y la muerte celular se produce una alteración de la respuesta a BMP-2 estimulación. Recomendamos pipeteado aproximadamente 100 l de DMEM en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, donde las células se cultivan antes de aplicar el sustrato sobre las células. Las células deben ser observadas en el microscopio para asegurar que no hay cambios morfológicos son provocados por la presencia de las superficies en la parte superior de las culturas. Por último, al retirar los sustratos, un lado se alza cuidadosamente con las pinzas y el sustrato se despega suavemente. Una comprobación inmediata para cualquier daño de las células con un microscopio de campo brillante se debe realizar, así como una comprobación de los sustratos para determinar si cualquier correas de células o de las impurezas principales están presentes.

_content "> En conclusión, el procedimiento de dos etapas presentado proporciona una herramienta útil para inmovilizar la rhBMP-2 sobre sustratos a través de sus residuos de amina para estudiar su impacto en las respuestas celulares. La estrategia descrita combina muchas ventajas. Por un lado, no es restringida a BMP-2, pero puede ser también aplicado a otros factores de crecimiento de la familia BMP, ya que presentan una estructura de aminoácidos muy conservadas. Por otra parte, mediante la prevención de la adsorción no específica, este enfoque permite la investigación de la BMP-2 dirigido , mientras que la reducción de la cantidad de factor de crecimiento y, más notablemente, lo que dificulta una liberación incontrolada de la superficie.

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Disclosures

Los autores tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al Prof. JP Spatz (Departamento de Química Biofísica, Universidad de Heidelberg y el Departamento de Nuevos Materiales y Biosystems, Instituto Max Planck para Sistemas Inteligentes, Stuttgart) por su amable apoyo. El apoyo financiero de la Max-Planck-Gesellschaft y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 a EAC-A.) También se reconoce en gran medida.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 130672  
4-(dimethylamino)pyridin Sigma-Aldrich 522805  
Acetone AppliChem A2282  
11-mercaptoundecanoic acid Sigma-Aldrich 674427  
Dichlormethane Merck 106050  
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Sigma-Aldrich D80002  
Petroleum benzene Merck  
Glass coverslips Carl Roth M 875  
Ethylacetate AppliChem A3550  
Methanol Carl Roth 4627  
N,N-dimethylformamide Carl Roth T921  
rhBMP-2 R&D Systems 355-BM Carrier-free; expressed in E.coli
PBS PAA H15-002  
NaCl Carl Roth HN00.2  
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) Dow Corning  
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning  
Anti-rhBMP-2 Sigma B9553  
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005 Secondary antibody
Ampliflu Red assay Sigma 90101  
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid Gibco 41966 High glucose
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 Sterile filtered, cell culture tested
Pen/Strep Gibco 15140  
Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na Gibco 25300  
Glycine (0.1 M) Riedel-de Haën 33226  
IGEPAL CA-630 (1%) Sigma I8896 Lysis buffer (ALP assay)19
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) Carl Roth HNO3.2  
Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) Carl Roth 3533.1  
p-nitrophenylphosphate (pNPP) Sigma S0942 Phosphatase substrate
Anti-mysin heavy chain (MHC) Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa MF20 Monoclonal antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A11001  
DAPI Sigma D9542  
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz BANDELIN electronic GmbH Co. KG  
MED 020 Sputtercoating system BAL-TEC AG Coating conditions
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate reader Tecan  

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References

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