전자 레인지를 이용한 폴리의 기능화 (에틸렌 글리콜) 및 체인 중합 및 하이드로 겔 형성에있는 사용을위한 온 수지 펩티드

Chemistry
 

Summary

이 비디오는 연쇄 중합 및 하이드로 겔의 합성을 가능하게, 폴리 (에틸렌 글리콜) 메타 크릴 레이트 신속하고 효율적인 방법을 도시한다. 그것은 유사하게 작용의 효율성을 평가하는 문제 해결 및 고급 수정에 대한 제안을 제공하고, 일반 하이드로 겔의 특성 기술을 설명하는 펩티드, 세부 일반적인 분석 방법으로 메타 크릴의 기능을 소개하는 방법을 보여줍니다.

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Van Hove, A. H., Wilson, B. D., Benoit, D. S. Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation. J. Vis. Exp. (80), e50890, doi:10.3791/50890 (2013).

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Abstract

폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 하이드로 겔 형성 마크 로머를 사용하는 주요 이점 중 하나는 합성 다양성이다. PEG 분자량과 구성의 큰 다양성에서 그릴 수있는 기능 (팔 수, 길이, 팔 및 분기 패턴) 하이드로 겔의 구조와 탄성 계수와 메쉬 크기 등의 속성을 결과를 통해 연구자 엄격한 제어를 제공한다. 이 비디오는 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 메타 크릴 레이트 (PEGDM)에 PEG 전구체를 메타 크릴 레이트에 신속하고 효율적으로, 무용제, 전자 레인지를 이용한 방법을 설명 할 것이다. 이 합성 방법은 약물 전달 및 재생 의료에 대한 응용 프로그램에서 많이 필요한 원료를 제공합니다. 이 시약 및 용매의 적은 양을 사용하여, 속도가 매우 빠르고 간단뿐만 아니라,보다 경제적이고 환경 친화적으로 입증 된 방법은 기존의 메타 크릴 화 방법에 우수합니다. 우리는 또한 온 - 수지 methacr이 기술의 적응을 설명 할 것이다펩티드의 일 아마이드 작용. 여기에 수지 방법은 펩타이드의 N-말단 이전 수지의 탈 보호 및 분열에 메타 크릴 그룹으로 기능화 할 수 있습니다. 반응성 측기 (라이신 차 아민, 세린의 일차 알코올, 트레오닌의 이차 알코올 및 티로신의 페놀)과 아미노산 등이 작용을 방지, 보호 된 상태로 유지하면서이 펩티드의 N-말단에 메타 크릴 기의 선택적 첨가 허용 여러 사이트에서. 이 글을 자세히 설명 할 것입니다 일반적인 분석 방법, 관능 화의 효율성을 평가하기 위해 (양성자 핵 자기 공명 분광법 (H-NMR)와 매트릭스 비행 질량 분석의 레이저 탈착 이온화 시간 (MALDI-TOF)을 보조). 일반적인 함정과 문제 해결 방법을 제시하여 추가 조정 로머 기능을 사용할 수있는 기술과 생성 된 하이드로 젤의 의지 수정으로 해결 될 것입니다 물리, 화학,속성. 특히주의가 하이드로 겔 강성 및 약물 방출을 제어 메쉬의 크기에 영향을 하이드로 겔 조성물을 수정 지급과 약물 전달 및 세포 물질의 상호 작용 연구를위한 하이드로 젤의 형성을위한 합성 제품의 사용은 입증 될 것입니다.

Introduction

폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 하이드로 겔은 재생 의학 및 약물 전달 응용 프로그램 1-3에서 사용되는 일반적인 생체 물질이다. 이러한 하이드로 겔은 다른 생체 재료에 비해 상당한 이점을 제공합니다. PEG 하이드로 겔은 자연 생체 적합 물질 대응 1에 비해 탄력과 분해 속도 계수 등의 기술 특성에 대해 높은 수준의 제어 기능을 제공하고, 합성이다. 그들은 합성 파생 된 바와 같이, PEG 자연 유래 소재 4 대 훨씬 적은 배치 별 변화가 있습니다. PEG의 화학 조성으로 인해,이 하이드로 겔은 높은 친수성 단백질 흡착에 저항하고, 3 생체 적합성이다. 단백질 흡착이 저항은 PEG 하이드로 겔 특정 생물학적 또는 화학적 요인 (약물, 생체 분자, 세포 접착 펩타이드 등) 및 특정 역할이 사실상 심문하고 연구하는 연구원을 가능하게 '백지'로 작동 할 수 있습니다RS 세포 및 / 또는 조직의 행동을 제어에서 재생.

그림 1
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그림 1.... 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 아키텍처와 헥사 글리세롤 코어 D) 8 - 아암 PEG와 펜타 에리트 리톨 코어 C) 8 - 아암 PEG와 A) 선형 PEG B) 4 - 아암 PEG의 예 코어를 리톨. N은 PEG의 수는 각 팔에 반복합니다. 각 반복 따라서, 44g / 몰의 분자량을 갖는 N 전체적인 분자량 및 구조 / 팔 번호로부터 계산 될 수있다.

PEG 전구체 구조 및 분자량의 다양한 사용할 수 있습니다 (그림 1 ). 아키텍처 (팔 위) 변화와 PEG의 에틸렌 글리콜 반복 (n)은 이러한 로머로부터 형성된 하이드로 겔 네트워크의 특성을 제어하기 위해 사용될 수있다. 수정되지 않은 PEG는 중합 전에 하이드로 겔 네트워크 형성에 PEG 하이드로 겔, 가장 일반적으로 사용되는 가교 전략을 통해 공유 가교 결합을 용이하게하기 위해 다른 기능으로 대체해야합니다 말단 히드 록 그룹이 포함되어 있습니다. 중합 및 가교 네트워크 (아크릴 레이트, 메타 크릴 레이트, 비닐 에테르, 노르 보르 넨 등)을 촉진하기 위하여 PEG 로머로 혼입 될 수있는 화학적 기의 다양한있다. 스텝 - 사슬 성장 (또는이 혼합 모드의 혼합물) : 가교 결합을 촉진하기 위하여 사용할 터미널 기능의 다양성에도 불구하고, 중합이 발생할 수있는 두 개의 메커니즘이있다.

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그림 2 :.. 지역과 같은 루프, 미 반응 전구 물질, 영구 얽힘으로 증가 네트워크 비 이상성 (nonideality) 가교 밀도 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)를 포함하는 이종 네트워크의 이론적 인 하이드로 겔 네트워크 회로도 A) 전통적인 연쇄 성장 중합 결과 B) 단계 성장 중합 결과 훨씬 더 균일 한 네트워크 구조는 (확장하지 말 것).

연쇄 성장 중합 반응을 통해 가교 결합 작용기는 추가로 가교제의 존재를 필요로하지 않는다. 그러나, 연쇄 중합 하이드로 겔은 조밀 한 가교 영역 (그림 2A) 1을 포함하는 이기종 네트워크 구조를 생성한다. 반면, 단계 성장 중합 requi에PEG 로머의 말단 관능기와 반응하는 가교제 또는 코 모노머의 사용을 입술. PEG의 말단 관능기는 가교 결합제와 반응 할 수 있고, 가교제는 PEG의 말단 관능기와 반응 할 수있는 바와 같이, 이는 더 큰 네트워크 구조의 균질성 (도 2B) 결과 1. 단계 성장 중합은 일반적으로 수용성, 비법 인 로머 1에 의한 면역 / 염증 반응에 대한 반응 전구 물질과 잠재력의 양을 감소, 작용기의 높은 변환을 초래할. 혼합 모드의 중합 방법은 (사슬 성장을) 자기 반응 가교제 (단계 성장)과 반응 할 수있는 두 로머의 사용을 통해 두 단계 및 연쇄 성장 중합을 결합하여 개발되었다. 이것은 각각의 중합기구의 특성 하이드로 겔을 생성하고,보다 복잡하고 다양한 네트워크 구조를 생성하기 위하여 사용될 수있다 하나보다단계 또는 단독으로 1 사슬 성장 네트워크.

PEG를 기능화 및 하이드로 겔 형성을 촉진하는데 사용될 수있다 작용기의 과다가 있지만, 메타 크릴 레이트 및 노보 넨은 각각 일반적인 사슬 - 단계 성장 중합 잔기의 일부이다. 이러한 기능은 모두 네트워크 중합에 우수한 시공간 제어를 제공하고, 세포를 캡슐화하는 데 사용하는 경우, 이러한 네트워크는 전반적으로 높은 세포 생존 5-7를 지원합니다. 연쇄 중합 반응을 통해 기능화 PEG (PEGDM) 가교를 메타 크릴 레이트 및 아크릴 레이트, 메타 크릴 레이트, 또는 이와 유사하게 기능화 된 생체 분자 5,6와 공동 중합을 통해 생체 분자 또는 다른 요인의 결합을 허용합니다. PEGDM의 히드로 겔은 아크릴 레이트 작용 PEG (PEGDA)로 대체 연쇄 성장 중합 시스템에 비해 상당한 장점이있다. 전통적인 방법을 사용하여, PEGDA가 PEGDM보다 빠르게 합성 될 수있다; 호Wever에게이 전자 레인지를 이용한 합성을 사용하여, PEGDM 합성이 더 효율적입니다. PEGDA 종종 하룻밤 8 또는 24으로 15 시간 반응에서 합성되고, 또한 고온에서 사시간 합성 할 수있다. PEGDM은 또한 전통적으로 어떤 방법 사일 (12)로, 반응 시간을 연장하여, 하룻밤 (11)의 반응에 의해 또는 24 시간 5 위해 합성된다. 여기서 설명 마이크로파를 이용한 방법을 사용하여,이 PEGDM 5 분간 반응에서 제조 될 수있다. PEGDM가 PEGDA 13보다 느린 반응 속도를 가지고 있지만, PEGDM위한 가교 반응은 분에서 발생 여전히 신속하고, 이에의 확률을 증가 크릴 기 용액 중의 관능기 응집을 증가 증가 소수성으로 PEGDA보다 로머 변환을 달성 급진적 전송 및 메타 크릴 레이트 변환 14. PEGDM의 히드로 겔은 증가 된 세포의 생존과 성장 등과 관련된때문에 급진적 인 농도와 14 현재 미 반응 로머을 감소 주어진 시간에서 반응 속도의 감소에 대한 가능성이 PEGDA 하이드로 겔에 비해. 이러한 단계 성장 중합 통해 노보 넨 기능화 PEG (PEGN) 형태를 사용하는 하이드로 겔 및 PEGN의 사용이보다 큰 평균 작용기를 포함하는 가교 결합제를 필요로하기 티올 - 엔 중합. 티일 라디칼은 시스테인 아미노산 작용기 7 펩티드의 손쉬운 혼입 허용 넨 탄소 - 탄소 이중 결합, 멀티 티올 함유 가교제 일반적 PEGN 하이드로 겔을 가교 결합하는 데 사용된다,와 반응하기 때문이다. 단계 성장 중합 반응을 통해 반응하는 수많은 다른 화학이 있지만 (예 : 싸이 - 아크릴 레이트 (15)와 티올 - 비닐 술폰 16 마이클 - 부가 반응, 같은 알킨 - 아 지드 (17) 등의 반응을 "클릭"), 티올 - 노보 넨 하이드로 겔은 매우 일반적인, 변형 등의노르 보르 넨 고리는 크게 반응 속도를 증가시키고 넨 이중 결합 겪고 사슬 중합 (7)의 기회를 감소시킨다.

하이드로 겔 형성을 촉진하는 메타 크릴 레이트, 노르 보르 넨, 또는 대체 작용 간의 결정은 큰폭 접근법에 기초한다. 예를 들어, 연쇄 성장 중합의 PEGDM 네트워크뿐만 아니라 입증 조직 공학 골막 18, 19의 개발에 세포의 현지화를 제어에 적합하고 있습니다. 단계 성장 중합 PEG 네트워크 인해 티올 (시스테인) 펩티드를 함유하여 효소 기질 서열의 혼입의 용이성, 효소 반응하는 하이드로 겔 열화를 촉진하는 펩티드 서열의 혼입에 더 적합하며 기능화 로머 (20)를 노르 보르 넨. 연구 질문은 최고의 단계 성장 하이드로 젤의 사용에 의해 해결 될 경우, 페어 뱅크스 등이. norbor에 대한 자세한 설명을 제공합니다PEG 7 네네의 작용 전략. 이 논문의 의지 세부 방법 PEG와 펩타이드 서열 (PEG에 대한 메타 크릴 레이트로, 펩티드의 메타 크릴) 관능 연쇄 중합 반응에 대한 수 있습니다.

전통적 PEGDM 디클로로 메탄 메타 크릴로 일 클로라이드 및 트리 에틸 아민과 PEG를 반응시켜 제조된다. 반응물을 여과, 디 에틸 에테르에 침전 및 수거 전에 사일 (12)로, 반응 시간을 연장하는 몇 가지 방법으로, 실온에서 밤새 11 또는 24 시간 5 경과하는 것이 허용된다. 이 방법의 많은 변형이 존재하지만, 모든 시간 소모적이다 화학 합성 장치의 큰 어레이를 필요로하고, 그들이 고순도 시약 및 용매의 상대적으로 많은 양의 사용을 포함 같이, 환경 친화적 않는다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 린 깁슨 등. 테와 PEG를 기능화 할 수있는 전자 레인지를 이용한, 무용제 방법을 개발 rminal 메타 크릴 레이트 그룹 (그림 3A) 12. 이 반응에서, PEG의 말단 알콜 기는 카르복실기를 형성하는 메타 크릴 산 무수물의 카본 원자 중 하나와 반응. 이 부산물로서 메타 크릴 산, PEGDM 생성물을 생성한다. 이 합성은 감소 된 반응 시간 및 무용제 합성 방법 (21)을 포함하여 마이크로파 합성 특징적 장점을 많이 갖는다. 마이크로파 합성은 상당히 빠른로, 앞에서 설명한 방법에 바람직하다 덜 광범위한 합성 장비 (예를 들어, 유리, 반응 판)을 필요로하고, 용매 만 제품 정제 / 수집 및하지 않는 필요로 적은 전체 시약 및 용매 양을 사용 합성,보다 경제적이고 환경 친화적 인 만들기.

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도 3 :.. 기능화 개략도 A) 폴리 (에틸렌 글리콜)을 형성하는 폴리 (에틸렌 글리콜) 메타 크릴 레이트 B)이 같은 방법은 펩티드 서열의 N-말단을 기능화하는데 사용될 수를 생성하기 위해 10 배 몰 과량의 메타 크릴 산 무수물과 반응 기능화 펩타이드를 메타 크릴. 종래 수지로부터 펩티드를 클 리빙이 절차를 수행하여, N-말단의 선택적인 작용은 아미노산 측 개 보호 유지로 수행 될 수있다. N : PEG의 수는 (2, 각각 = 45.5, 227, 455 N 10, 20 kDa의 선형 PEG 사용) 로머에 반복합니다. R1 RN 행 : 아미노산 측쇄. PGN에 PG1 : 그룹을 보호하는 사이드 체인. TFA : 트리 플루오로 아세트산. 팁 : 트리 이소 프로필 실란. DODT : 3,6 - 디 옥사 -1,8 - octanedithiol. H 2 O : 물.

마이크로파를 이용한 메타 크릴 화의 방법은 최근 중합체 및 중합체의 다양한 네트워크에 펩티드 결합을 용이하게하는 메타 크릴 기 (도 3b)와 함께 펩티드의 N-말단을 기능화하는 단체에 의해 채택되었다. 이 반응에서, 펩티드의 N-말단의 차 아민 아미드를 형성하는 메타 크릴 산 무수물에 카본 원자와 반응한다. 이 부생 메타 크릴 산, 메타 크릴 관능 펩티드를 생성한다. 펩티드 서열의 N-말단을 기능화이 절차를 사용할 때, 반응성 측쇄 (급 아민 (리신), 알콜 (세린, 트레오닌) 및 페놀 (티로신))를 포함하는 아미노산은 기능화 도중 보호하는 것이 중요하고, 보호 그룹은 메타 크릴 설립 후 절단됩니다.

이 문서에서는 이러한 전자 레인지, 모두를 설명 할 것이다PEGDM를 합성하고 온 수지 펩타이드 서열을 기능화, 일반적인 함정을 강조하고 문제 해결 방법을 제안하는 방법 번가 보조. 이 기사에서는 일반적으로 제품의 작용을 평가하기 위해 사용되는 분석 화학 기술을 수행 할 수있는 방법을 상세하게 설명하고, 고급 수정을 수행하기위한 제안과 자원이 주어집니다. 전형적인 결과, 하이드로 겔 네트워크를 형성하기 위해 합성 PEGDM을 사용하여 모델 약물의 방출을 제어하기 위해 형성된 하이드로 겔을 이용하고, 휴대 하이드로 겔의 상호 작용을 촉진하기 위하여 기능화 된 펩티드를 이용하는 포함하는 입증 될 것이다. 특별한주의 하이드로 겔 메쉬 크기의 특성 및 하이드로 겔 조성물이 차례로 같은 강성 약물 방출 프로파일과 대량 재료의 특성을 제어이 기본 물리적 속성을 영향을 튜닝 할 수있는 방법을 논의에 지급됩니다.

Protocol

1. PEGDM의 마이크로파를 이용한 합성

  1. 물 오염을 방지하기 위해, 사전에 건조 모든 유리 제품은 1 시간 동안 오븐 (> 60 º C)에서 사용된다.
    참고 : 필요한 유리 제품은 다음을 포함한다 : 두 개의 100 ㎖의 비커, 250 ㎖의 비커, 3 주걱, 250 ㎖ 흐너 플라스크, 7 cm의 흐너 깔대기, 10-CM 시계 유리.
  2. 이후, 비커에 붓는 시계 유리 비커를 덮고, 얼음 가득 재결정 접시에 비커를 배치하여 단계 1.6에서 수행 침전 사전 오한 100 ~ 150 ㎖의 무수 디 에틸 에테르 (74.12 g / 몰). 화학 흄 후드에 전자 레인지와 vortexer를 이동합니다.
    주 : 디 에틸 에테르를 또한 화학적 냉동고 비커를 놓고 prechilled 될 수있다. 냉동실 얌전 달성 하부 다이 에틸 에터 온도는 침전 속도 및 효율을 증가시킬 것이다.
  3. 작은 무게 보트, molecu의 폴리 5g (에틸렌 글리콜) (PEG)를 달아당신의 선택 (1,000 ~ 100,000 다)의 LAR 무게.
    1. 존재하는 경우, 섬광 유리 병의 뚜껑에서 플라스틱 조각을 제거합니다. 유리 병 용기를, 그리고 후드 식 1 당 유리 병 (MA, 154.16 g / 몰)에 무수 메타 크릴 산의 10 몰 초과 분배. 섬광 유리 병에 PEG를 추가합니다.
      식 (1) (1)
      어디에 식 1.1 g의 PEG의 질량이고, 식 1.2 g / 몰에서 PEG의 분자량, 식 1.3 PEG의 말단 OH 기의 수는이고, 식 1.4 molecu입니다g / 몰에서 MA의 LAR 무게.
  4. 느슨하게 섬광 유리 병에 뚜껑을 비틀어. 최대 전력에 5 분에 전자 레인지를 설정합니다. 내열 장갑을 끼고, 전자 레인지에서 매 30 초를 유리 병을 제거합니다.
    1. 완전 30 초 모자와 소용돌이를 조입니다. 이 솔루션은 전체 5 분 동안 레인지 될 때까지 반복합니다. 캡으로 인해 균열이 절차를 수행하는 동안 교체 할 필요가 있습니다.
  5. 뚜껑을 느슨하게, 실온 PEGDM 식힌다. 디클로로 메탄 (DCM, 84.93 g / mol)를 소량 (15 ml)에 녹여 PEGDM.
    참고 :이 PEGDM 인해 여열에 DCM (발암 물질로 의심)의 비등을 방지하기 위해, 크게 (~ 5 분) 전에 DCM 추가로 냉각하는 것이 좋습니다. PEGDM는 주걱을 사용하여 작은 조각으로 부서지고 용해에 도움이 와동 할 수 있습니다.
  6. 20 분 동안 10 배 과량의 얼음처럼 차가운 다이 에틸 에테르에 침전 PEGDM.
    참고 : 사우스 캐롤라이나 할 필요가있다저 분자량의 PEG (2500 다)를 침전 결정 형성을 시작 주걱으로 비커 측 ratch하지만, 1000 다 이하의 분자량을 갖는 PEG 긁힘에도 불구하고 침전되지 않습니다.
  7. 흐너 깔때기 및 플라스크를 사용하여 진공 여과에 의해 수집 PEGDM. 이 PEGDM 물 흡착을 촉진하므로, 건조를 완료하기 위해 필터링하지 않습니다.
    주 : 사용중인 특정 진공 시스템, 진공 트랩 여과 셋업 및 용제 증기에 의해 손상으로부터 진공 펌프를 보호하기 위해 진공 원 사이에 배치 될 수있다 필요한 경우.
  8. 환기 캡을 통해 피어싱 큰 게이지 바늘로 50 ML 원뿔 튜브에 여과 PEGDM를 전송합니다. 건조 진공 챔버에서 하룻밤 보관합니다.
  9. DCM과가 침전에 재용 PEGDM 반응 MA를 제거하는 마지막 단계 (단계 1.5-1.7에서와 같이). 단계 1.8에서와 같이 다시 건조.

2. PEGDM 작용 화의 특성

  1. 용매로 클로로포름 (120.38 g / 몰)를 사용하여, 1 H-NMR을 위해 샘플을 준비하고 있습니다. 용매 (≈ 1.0 ml)에 소량의 섬광 유리 병에 PEGDM (≈ 10 ㎎)의 작은 샘플을 놓습니다. 목표 농도는 10 ㎎ / ㎖이다.
    1. 시료가 용해되면, 청소 NMR 튜브에 옮긴다. 이 샘플은 NMR 튜브의 바닥 4~5센티미터을 채워야합니다.
  2. 양성자 NMR 스펙트럼을 수집합니다. 우리의 데이터는 400 메가 헤르츠 분광기를 사용하여 데이터를 수집합니다. 충분한 데이터의 해상도를 얻기 위해 최소 64 스캔 상온에서 샘플을 실행합니다.
  3. NMR 분석 (도 4) PEGDM 작용 화는 90 % 미만이다 나타내면, 메타 크릴 화의 과정을 반복한다. MA의 질량이 작용 화되지 않은 PEG의 감소량을 고려하여 사용할 조정.

참고 : PEGDM로 기능화 PEG의 퍼센트는 관찰로부터 계산 될 수있다 : 단말 methacr의 이론적 비율ylate 양성자 (A, B 및 C) 중앙 PEG 양성자 (d) (도 4)이다. 선형 PEG의 경우, 중앙 PEG 양성자의 이론적 개수는 수학 식 2에 의해 계산된다 :

식 2 (2)
어디에 식 2.1 분자 g / 몰에서 PEG의 무게입니다 식 2.2 하나의 PEG 반복 (44 G / 몰)의 분자량이다. 비선형 PEG의 경우,이 방정식은 특정 분기 구조 (그림 1)을 반영하도록 수정해야합니다. %의 작용은 다음 수학 식 3을 이용하여 계산 될 수있다 :
식 3 (3)
어디에 식 3.1 메타 크릴 프로톤 피크 하에서 관찰 영역 (a, δ = 1.94 PPM, B 및 C, δ = 5.57 및 6.12 ppm)를, 그리고 식 3.3 메타 크릴 양성자 이론적 개수 (a = 3은 * 식 1.3 , B = 1 * 식 1.3 및 C = 1 * 식 1.3 - 선형 PEG에 대한 각각 6, 2, 2). 퍼센트 기능화 계산 봉우리에게 A, B를 사용하여 수행 및 C 별도로하고 평균화되어야전체 %의 작용을 얻기 위해 에드.

참고 : 충분하게 작용 PEGDM 다음 (물에 대하여, 물) 투석 및 잔류 무수 메타 크릴 산 및 메타 크릴 산을 제거하는 동결 건조에 의해 수집 될 수 있습니다. 최종 제품은 구연산 또는 비타민 C와 같은 억제제의 미량 (0.01 중량 %)와 혼합하고 -20 ° C까지 사용에 방습제와 함께 보관한다. 최종 PEGDM 상품의 Khetan 및 버딕 22 조브 문서에 설명 된대로, 하이드로 겔의 제조에 사용될 수있다.

3. 온 수지 펩티드​​의 마이크로 웨이브를 이용한 기능화

주 : 우리의 펩티드 UV 모니터링과 자동화 된 펩티드 합성기를 사용하여 고체상 합성의 Gly-왕 레진을 이용하여 합성하고, N-메틸 피 롤리된다 (NMP, 99.1 g / mol)을 0.2 M 아미노산 용액. 5 % 피페 디메틸 포름 아미드 (86.1 g / 몰) (DMF, 73.1 g / mol)을 탈 보호를 위해 사용되고, 0.5 M O-벤조 트리아 졸-N, N, N ', N'-테트라 메틸 우로 늄 - hexaflDMF의시 백색 포스페이트 (HBTU, 379.3 g / mol)를 활성화 제로서 사용되며, NMP 2 M 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIEA, 129.3 g / mol)을 활성제베이스로서 사용된다. 펩티드는 또한 상업적 펩티드 공급자로부터 얻을 수있다. 상업적인 소스를 사용하는 경우의 표준 상태로는, 펩티드의 아미노산 측쇄 오히려 완전히 쪼개진보다 그대로 보호기로 온 수지 조달되는 것이 중요하다.

주의 : 이것은 반응성 측쇄 어떤 아미노산은 해당 메타 크릴 기능화는 시퀀스의 N-말단의 차 아민에서 발생되도록 보호되는 것이 중요하다. 아미노 반응성 측면 그룹과 산, 그리고 일반적인 보호 그룹에 대한 표 1을 참조하십시오. 보호기를 가진 아미노산 비보호 된 아미노산과 동일한 방법으로 펩타이드 합성 중에 시퀀스에 도입하고, 동일한 아미노산 딜러로부터 수시로 사용할 수있다.

아미노산 반응기 그룹을 보호
라이신 주 아민 급 - 부틸 옥시 카르 보닐 (BOC)
세린 차 알코올 tert-부틸 (tBu에)
트레오닌 2 급 알코올 tBu에
티로신 페놀 tBu에

표 1 : 반응성 아미노산 및 일반적인 보호기.

  1. 표준 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 펩티드를 합성하고, 사용 준비가 될 때까지 DMF에 4 ° C에서 수지에 저장합니다.
  2. 여과지를 250 ㎖의 플라스크와 7cm의 흐너 깔때기를 사용하여 여과를 통해 DMF에서 펩타이드 수지를 수집합니다.
  3. 현재는 섬광 유리 병의 뚜껑에서 플라스틱 조각을 제거합니다. 섬광 유리 병에 수지를 전송합니다. 일회용 피펫을 사용하여 섬광 유리 병에 수지를 충당하기 위해 충분한 MA를 추가합니다.
  4. 느슨하게 섬광 유리 병에 뚜껑을 놓습니다. 최대 전력 3 분에 전자 레인지를 설정합니다. 내열성 장갑을 착용, 전자 레인지에서 모든 15 ~ 20 초를 유리 병을 제거합니다.
    1. 완전 15 초 모자와 소용돌이를 조입니다. 용액 가구용 레인지 될 때까지 반복3 분 LL.
  5. 뚜껑을 느슨하게 실온에 펩타이드 솔루션 식힌다. DMF 소량 여과지 및 플라스 흐너 깔때기를 사용하여 바이알로부터 펩티드 수지를 수집한다.
  6. 신선한 섬광 유리 병에 펩타이드 수지를 전송하고 펩타이드를 절단 및 탈 보호.
    1. 0.25 수지 밀리몰 당, 우리는 (TIPS, 158.36 g / mol)을 0.5 ml의 트라이 아이소 프로필 실란 각각과 18.5 ml의 트리 플루오로 아세트산 (TFA, 114.02 g / 몰)의 절단 칵테일을 사용하여, 회전 2 시간 상온 반응을 사용 3,6 - 디 옥사 -1,8 - 옥탄 (DODT, 182.30 g / mol) 및 탈 - 이온수 (18.02 g / 몰).
      주 :이 칵테일은 대부분의 펩타이드에 충분하지만, 2,2,4,6,7 - 펜타 메틸 디 하이드로 벤조 퓨란 -5 - 설 포닐 (통상적 아르기닌 측쇄를 보호하는 데 사용) (PBF) 보호 된 아미노산을 탈 보호하지 않을 것이다. 순서는 어떤 PBF 보호 그룹을 포함하는 경우, TFA 0.5 ㎖를 0.5 ㎖ 티오 아니 솔 (124 교체해야합니다.20g / 몰) 및 절단 시간은 4 시간으로 증가했다.
      참고 : 절단 칵테일 흐린, 결정 성 물질의 형태, 펩타이드 가능성이 솔루션과 분열 칵테일의 볼륨 중 충돌하는 경우 두 배가되어야한다.
  7. 시계 유리로 덮여 비커에 얼음에 400 ㎖의 무수 디 에틸 에테르를 풀어.
  8. 배 과량의 디 에틸 에테르에 펩티드를 침전, 4 개의 50 ㎖ 원추형 튜브 사이에 균일 용액을 나눈다. 펩타이드를 수집하는 10 분 동안 3,200 XG에 원심 분리기.
    1. 에테르를 경사 분리하고, 디 에틸 에테르 신선한 두 50m 원추형 튜브에 나뉘어 100 ㎖에 재현 탁 펩티드. 4 에테르 세척 총 두 번 신선한 에테르 50 ㎖에 재현 탁, 원심 분리 과정을 반복합니다.
      주의 : 이것은 절단 칵테일에 사용되는 화학 물질을 제거하고 고체 펩타이드로부터 보호기 절단.
  9. 마지막으로 원심 분리 단계 후, 폐기물 등을 가만히 따르다그녀의 진공에서 밤새 펩타이드를 건조.

4. 펩타이드 작용 화의 특성

  1. 펩티드 샘플의 MALDI-TOF 분석에 용매로서 아세토 니트릴 (41.05 g / 몰) + 0.1 % TFA : 50:50 H 2 O를 사용한다. 작은 샘플 플레이스 - 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 펩타이드 (1 ~ 2 ㎎) 및 MALDI 용매 1 ㎖에 시료를 용해.
  2. 매트릭스 솔루션을 준비합니다. 행렬로서 일반적으로 사용되는 행렬은 α-시아 노 -4 - 히드 록 시신 남산 (CHCA, 189.2 g / 몰). 스톡 매트릭스 용액을 형성 MALDI 용매 중에서 10 ㎎ / ㎖의 매트릭스를 용해.
    주 : 매트릭스 원액 추가 분석을위한 최대 1 주일 동안 실온에서 저장 될 수있다.
  3. 1:1 비율의 펩타이드 및 매트릭스 솔루션을 결합합니다. 1 μL / 지점을 추가, MALDI 샘플 접시에 세 개의 분리 된 위치에이 결합 된 솔루션을 발견.
    1. 반점, 공기 건조하거나 히트 건을 이용하여 어느 재 건조. Respot 건조 각샘플.
      참고 : Respotting는보다 균일 한 펩타이드 / 매트릭스 샘플을 생산하고 명확한 신호를 얻는 데 도움이됩니다. 표준 펩타이드 믹스는 1:1의 비율로 매트릭스 솔루션과 결합하고, MALDI 판에 (한 번)을 발견한다.
  4. MALDI-TOF 데이터를 수집합니다. 인해 펩티드의 N-말단에 메타 크릴 기의 첨가로 단독 펩타이드 분자량의 상기 분자량 68g / 몰의 증가가 있어야한다.
    주 : PEGDM 합성 달리 반응성 측쇄를 가진 아미노산의 보호기가 제거되어 절단시로서 펩티드, refunctionalized 수없고, N-말단의 선택적인 작용이 더 이상 보장 될 수 없다.
    1. MALDI 분석 (그림 5) 펩타이드가 제대로 작용되었음을 나타냅니다 모든 보호 그룹이 적절하게 절단하는 경우, 펩타이드 (물에 물에) 투석 및 remov하는 동결 건조에 의해 수집 될 수있다전자 잔류 오염 물질 (절단 칵테일, 에테르 등의 그룹을 보호 절단). 고체 펩타이드는 작은 에펜 도르프 튜브에 옮겨 -20 ° C에서 사용할 때까지 보관해야합니다.

Representative Results

각 스펙트럼 피크 아래의 면적이 허용 샘플의 해당 양성자의 상대적 수준에 비례로서 프로톤 핵 자기 공명, 화학 반응의 효율성을 평가하는 가장 일반적인 분석 기술 중 하나의 제품 및 반응물의 비율의 결정 샘플. 단말 크릴 양성자의 이론적 비율 (A, B 및 C) (d) 중앙 PEG의 양성자 :이 반응의 경우, 1 H-NMR 분석 (도 4) 관찰에서 % 기능화를 계산하는데 사용될 수있다. 그림 4의 PEGDM 이전 작용에 2,000 다했다, 따라서 N = 2,000 다 / (44 다 / PEG 반복) = 45.5 = 4 * (N-1) = 178 그래서 D, 양성자 만들기 : NMR 장치 비율 178 / = 1.74 102.16. 샘플에서 물의 존재하에 인공적 피크 면적을 증가이 경우, %는 기능화를 평가하는데 사용될 수 없다 피크. 피크 B를 사용하여, % 기능화는 1.00 * 1.74 / 2 * 100 % = 87.1 %이다저기서G 피크 C, %의 작용은 1.08 * 1.74 / 2 * 100 % = 94.1 %이다. 따라서 전체적인 % 기능화는 91 %이며,이 PEGDM 적절히 하이드로 겔 합성에 사용하기 위해 작용한다. 일반적으로, 약 90 %의 작용은 메타 크릴 화의 단일 라운드 후에 이루어집니다.

인해 펩티드의 1 H-NMR 분석에서 발생하는 양성자 피크의 무리로, 펩티드 작용은 더 쉽게 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용하여 조사된다. 이것은 펩티드 GKRGDSG 합성과 작용을 메타 크릴 하였다 그림 5에서 보여줍니다. 펩티드의 작은 분획은 관찰 분자량 피크는 펩티드 서열의 정확한 합성을 나타내는 676g / 몰, 펩티드의 예상 분자량에서 발생 하였다 prefunctionalization 분자량 평가 (도 5a)에 대해 절단 하였다. 펩티드의 나머지는 메타 크릴 기능적 시행이전의 분열에 화. 이 펩티드는 PBF가 R 아미노산을 보호 포함하기 때문에, 절단은 4 시간 동안 티오 아니 솔을 함유하는 칵테일을 수행 하였다. 메타 크릴 기능화 후에 관찰 분자량 피크는 744g / 몰 (도 5b)에서 발생하는, 메타 크릴 기능화 펩티드 (676 68g / mol) 및 예상 중량 작용 화되지 않은 펩티드의 예상 분자량에서, 정확한 지시하지 작용.

PEG와 메타 크릴 작용 펩타이드 모두의 기능을 설명하기 위해, PEGDM의 히드로 겔은 GKRGDSG (그림 6) 작용 메타 크릴로 및 0.5 ㎜없이 생산되었다. 하이드로 겔은 0.05 중량 %의 리튬 페닐 -2,4,6 - trimethylbenzoylphosphinate (LAP) 광개시제와 PBS의 10 중량 %의 선형 10 kDa의 PEGDM로 제조 하였다. 하이드로 겔 전구체 용액을 두 개의 유리 슬라이드 유리 슬라이드 스페이서에 의해 분리하고 바인더 클립 조여져 사이에 주입시켰다. 전구체 용액을 직경 8mm 겔은 원통형 펀치를 사용하여 수집 된 후에, 가교 결합을 유도하기 위하여 10 분 동안 2 mW의 / cm 2에서 365 nm의 UV 광에 노출시켰다. 젤은 PBS에 세척 및 평형 팽윤 조건이 16, 20을 달성 하였다 보장하기 위해 2 일 동안 팽창 할 수 있었다. 인간 중간 엽 줄기 세포 (유로 3) 80 %의 포화 상태로 성장하고 15,000 세포 / cm 2의 하이드로 겔에 씨앗을 품고 있었다. 세포를 사용하여 10 배 배율 0.5 μL / ㎖ 칼 세인 AM 2 μL / ㎖ 에티 디움 동종이 량체 (인비 트 로젠에서 LIVE / DEAD 생존 키트)를 포함하는 새로운 미디어에 전송 및 위상 콘트라스트와 형광에 따라 이미지가되기 전에 48 시간 동안 부착시켰다 니콘 이클립스 티 2000. 중간 엽 줄기 세포는 작용 화되지 않은 PEG 하이드로 겔 (그림 6A)을 준수 할 수 없습니다 만, 세포 접착 펩타이드 RGD의 포함에 그들은 준수 및 하이드로 겔 표면 (그림 6B)에 확산 할 수 있었다. LIVE / DEAD 이미지중간 엽 줄기 세포가 죽음에 따라 겔 표면으로부터 분리와 시드 세포 생존의 인공 팽창의 결과로, 미디어 전송 프로세스 동안 제거 될 것이다 접착 의존성 세포이기 때문에, 시드 MSC 집단의 생존 능력을 나타내지 않는 선보였다. 오히려, 형광 이미지는 혼자 위상차에 따라 어려울 수 있습니다 하이드로 겔 토폴로지에 부착 세포와 작은 변화 사이의 경계 설정하기위한 것입니다. 흥미롭게도, nonspread 세포는 세포 이미징의 시간에 죽어 가고 있음을 나타내는 칼 세인의 AM 및 에티 디움 호모 다이머 모두에 대한 긍정적 인 얼룩 PEG 전용 젤에 시드.

PEG 하이드로 겔의 많은 장점 중 하나는 매우 조정할 수있는 성격입니다. PEG 하이드로 겔의 특정 메이크업을 수정하는 것은 연구자에게 같은 탄성 계수와 같은 속성을 통해 높은 수준의 제어를 제공한다. 도 7에 도시 된 바와 같이, PEG 분자량 (도 7A) 및 중량 백분율 (둘 (도 8)을 조사하여 입증되었다. 모든 하이드로 겔은 광개시제 0.05 중량 % LAP으로, PBS에 10 중량 %의 선형 PEGDM로 제작되었다. 하이드로 겔 전구체 용액 40 μL 원통 형상 직경 약 5mm, 높이 2mm의 제조, 하이드로 겔을 형성하는 조건에 차단하고, 10 분 동안 2 mW의 / cm 2에서 365 nm의 UV 광에 노광과 1 ㎖ 주사기에 참여 . 젤은 기계적 시험 전에 2 일 동안 PBS에서 팽창하는 것이 허용되었다. 하이드로 겔의 모듈러스는 0.1 mm / 초의 속도로 초기 하이드로 겔의 높이의 4.0 내지 10 %를 압축하면서 5 N 로드셀 MTS QT / 5를 사용하여 측정 하였다. 기계적 시험 종료 후, 메쉬 크기가 하이드로 겔 MAS를 측정함으로써 결정 하였다의 사전 (M 초)과 후 (M의 D) MATLAB에서 수행 계산을 토론 섹션에 설명 된대로 플로리-Rehner 보낸 방정식을 통해 동결 건조의 24 시간. 가정 된 바와 같이, 하이드로 겔 메쉬 크기의 증가 (도 8a) 및 하이드로 겔 강성의 감소 (도 8b)을 발생 로머 PEG의 분자량을 증가시킨다. 하이드로 겔 메쉬 크기 및 얻어진 겔 강성은 또한 중량 % PEG를 변경함으로써 제어 될 수있다. 히드로 겔은 선형 10 kDa의 PEGDM 다양한 중량 %로 제작되었으며, 이전에 (그림 9) 기술로 하이드로 겔 강성과 메쉬 크기가 결정되었다. 으로는 PEG가 중요한 메쉬 크기의 감소 (그림 9A) 및 하이드로 겔 강성 (그림 9B)의 증가의 원인이 중량 % 증가, 그림 (b)에 도시 하였다.

캡슐화 된 소 혈청 알부민 (BSA)를 함유하는 하이드로 겔은 다양한 molecula을 사용하여 형성했다R 중량 PEG (2, 10, 및 20 kDa의). 도 6에서 기술 한 바와 같은 다양한 하이드로 겔은 50 ㎍ / ㎖의 BSA를 함유하는 PBS에서 10 중량 % PEGDM로 제조 하였다. 젤은 37 ° C에서 1 ㎖ PBS에서 배양하고, 각 시점에서 신선한 PBS로 전송했다. 출시 BSA는 온도 과학에서 브래드 분석을 사용하여 정량 하였다. 하이드로 겔 메쉬 크기는도 8에서 기술 한 바와 같이 결정 하였다. 도 7a에 도시 된 바와 같이, BSA 릴리스는 하이드로 겔 내에서보다 큰 메쉬 크기 (도 10)의 결과로서, 고 분자량 PEGDM을 사용하여 형성된 하이드로 겔로부터보다 신속하게 발생한다.

그림 4
그림 4. 2 kDa의 선형 PEGDM의 대표 1 H-NMR은 전자 레인지를 이용한 방법을 사용하여 기능화. 퍼센트의 작용은 캘리포니아이 될 수 있습니다에 따라 lculated 관찰 :. 터미널 메타 크릴 레이트의 양자 이론 비율 (A, B 및 C) 중앙 PEG 양성자 (D)으로는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 5
그림 5. 펩티드 GKRGDSG (A) 전에 및 (B) 마이크로파를 이용한 방법을 이용하여 기능화 후에. 기능화 후에 관찰 분자량 피크는 744g / 몰 발생 유의, 메타 크릴 기능화 펩티드의 예상 중량 (676의 주제 MALDI-TOF 68g / 몰)과하지 않은 작용 펩타이드 (676g / 몰)의 예상 분자량에. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .


그림 6. 대표적인 위상 콘트라스트 (왼쪽)와 (그린 / 레드) DEAD / 혼자와 B) PEG 젤에 배양 된 중간 엽 줄기 세포의 형광 이미지 (오른쪽)) 0.5 ㎜를 포함하는 PEG 젤이 작용 GKRGDSG를 메타 크릴. 중간 엽 줄기 세포를 준수 할 수없는과에 확산 혼자 PEGDA 젤은 있지만, 세포 접착 펩타이드 RGD의 설립시 준수 및 하이드로 겔 표면에 확산 할 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 7
그림 7. A) 하이드로 겔 네트워크를 형성하는데 사용되는 PEG의 분자량 및 B) 중량 백분율은 PEG (_ 하이드로 메쉬 크기에 영향8 ;) 및 결과 하이드로 겔 강성과 캡슐 약의 속도를 놓습니다.) 일정한 무게 비율에서 왼쪽에서 오른쪽으로 PEG 분자량 ()의 증가는 체중 감소) 하이드로 겔 강성을 감소 및 약물 방출 속도. B를 증가, 하이드로 겔 메쉬 크기를 증가 (왼쪽에서 오른쪽) PEG 비율은 유사 하이드로 겔 강성을 감소 및 약물 방출 (확장하지 말 것)의 속도를 증가, 하이드로 겔 메쉬 크기가 증가 하이드로 겔을 형성하는 데 사용합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 8
그림 8. A) 메쉬 크기 증가 및 B) 하이드로 겔 강성 PEG 로머의 분자량이 증가함에 따라 감소한다. N = 10, 오차 막대 = SEM, *** P &# 60; 0.001 편도 Tukey의 HSD 사후 테스트와 ANOVA. 모든 통계 분석은 프리즘 5를 사용하여 수행되었습니다 것은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 9
그림 9. A) 증가 중량 % PEG와) 하이드로 겔 강성 증가 크기 감소 및 B 메쉬. N = 9-10, 오차 막대 = SEM, ** P <0.01, *** P <0.001 Tukey의 HSD의 한 일원 분산 분석에 의한 포스트 특별 시험. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 10
그림 10. ENCA의 릴리스이 kDa의 10 kDa의 20 kDa의 분자량의 PEG를 사용하여 형성된 하이드로 겔로부터 psulated 모델 약물 소 혈청 알부민 (BSA). BSA 릴리스는 하이드로 겔 내에서보다 큰 메쉬 크기의 결과로서, 고 분자량 PEGDM을 사용하여 형성된 하이드로 겔로부터 더 빨리 발생 . N = 6, 오차 막대 = SEM. 발표 %의 BSA는 Bonferroni와 양방향을 반복 측정 ANOVA로 2, 10 kDa의 젤에서 방출은 동일 t = 1, 2.5 시간을 제외하고 모든 시점에서 세 그룹 사이에 (p <0.0001) 유의 한 차이가있다 사후 테스트. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Discussion

이전에 설명 된 방법은 PEGDM의 합성 펩티드 또는 다른 아민 함유 화합물의 메타 크릴 작용에 대한 귀중한 있습니다. 이들 재료는 재생 의학 및 약물 전달 애플리케이션에 사용될 수있다. 인해 PEG의 친수성 특성으로 PEG 로머로부터 형성된 하이드로 겔은 몸이 많은 조직과 유사한 높은 물 함량이. 이 품질은 PEG는 단백질 흡착에 매우 저항하는 몸 3 따라서 불활성 있습니다. 그러나 PEG의 흡습성이 작용하는 동안 성가신 증명할 수 있습니다. 물을 메타 크릴 화 절차 중에 PEG 샘플에서 존재하는 경우, 메타 크릴 산 무수물, 메타 크릴 산을 생산하는 물과 우선적으로 반응하고, PEG의 불량 작용이 발생할 것이다.

그러므로, PEG 또는 메타 크릴 화 펩티드의 성공을 보장하기 위해 취할 수있는 가장 중요한 단계 중 하나는 무수물을 유지하는 것이다루스 반응 조건. 사용 전에 모두 유리를 건조 추천 단계는 수질 오염을 방지하기위한 것이다. 샘플에서 물의 존재는 1.7 ppm 이하 브로드 피크 (도 4)로, NMR 분석에서 볼 수있다. 별로 메타 크릴 화 심지어 모든 유리 제품을 건조 후 관찰되는 경우, 화학 물질을 황산나트륨 또는 사용하기 전에 다른 건조제 (분 자체 등)상에서 건조 될 수있다. 증류로는 사용하기 전에 물을 제거 및 메타 크릴 산 무수물을 정화하는 데 사용할 수 있으며, 공비 증류는 PEG (23)를 건조 할 수있다. 극단적 인 경우, 합성은 더욱 적절히 무수 조건을 위해 글로브 박스에서 수행 될 수있다. 동일한 절차에 따라, 메타 크릴 화의 두 번째 라운드는 또한 작용을 높이기 위해 수행 될 수있다. 작용의 추가 라운드가 요구됩니다 가능성이 항상 있기 때문에, 치료는 신속하게 진공 여과에 의해 PEGDM를 수집하는 단계 1.7 및 1.9에주의해야한다. 이상 진공 여과 물 흡착을위한 기회를 증가하고, 공기 PEG의 절대적으로 필요한이 증가 노출입니다.

하이드 록시 작용기에 무수 메타 크릴 산의 비율 초과가 PEG 전구체에 PEG의 작용 (예를 들어, 암 #)를 증가, 변경되지 않은 상태로 유지하더라도 일반적으로 달성 %의 작용의 감소 (게시되지 않은 결과 브누아 연구소)와 연결되어 있습니다. 특히 어려움이 충분히 높은 기능화 달성 발생하는 경우 선제 작용 효율의 감소를 해결하기 위해, 또는, 마이크로파 반응의 지속 기간이 증가 될 수 있고, 마이크로파 간격이 30 초를 유지하는 것을 조건. 10 몰 과량 일반적 충분하지만, 반응에 사용 된 메타 크릴 산 무수물의 양은도 12를 달성 퍼센트 작용을 증가시키기 위해 증가 될 수있다.

그것은 중요하다추가 침전 단계 (1.9)는 양호한 NMR 신호를 얻기 위해 수행 될. 그것은 재침 과잉 메타 크릴 산 무수물과 메타 크릴 산의 제거를 돕기 위해 발견되기 전에 밤새 샘플을 건조, 합성으로 당일 제 침전을 수행하도록 유혹된다. 시료 준비는 깨끗 NMR 스펙트럼을 달성하는데 중요하며, 따라서 샘플이 추천하는 조건을 사용하여 제조. 4 올바르게 작용 PEGDM위한 대표적인 1 H-NMR 결과를 보여도한다. 중앙 P​​EG의 양성자 단자 크릴 양자의 비율을 분석함으로써 PEGDM 적절히 작용로 측정되었다. MALDI 샘플 준비는 명확한 독서를 달성하기위한 마찬가지로 중요합니다. MALDI는 염 및 높은 샘플 농도의 존재에 특히 민감하다. (하이 신호 50 임의 단위 (AU 상기 강도) : 노이즈 비율) 판독 클리어 MALDI이 경우 얻을 수없고, 샘플의olution 매트릭스 솔루션과 결합하고 다시 분석하기 전에 MALDI 용매에서 1:100으로 희석해야한다. 5 올바른 펩타이드 작용, 절단 및 샘플 준비 후 대표 MALDI-TOF 결과를 보여줍니다 그림. 종래 기능화 (도 5a)에 대한 수지의 작은 샘플의 단리는도 5b에 도시 된 펩타이드의 올바른 크릴 기능화와 펩티드 GKRGDSG의 정확한 합성을 나타낸다.

온 수지를 펩티드의 작용은 비교적 견고 절차 동안, 각 시퀀스에 필요한 절단 조건은 종종 조정을 필요로한다. 많은 아미노산 측쇄 (긴> 30 아미노산 또는 보호기를 가진> 15 아미노산)를 보호 한 긴 서열의 경우, 절단의 기간이 한 시간이 증가되어야한다. 절단 시간이 너무 많이 확장 된 경우에는, 펩타이드 결합의 절단으로 인해 장기 산성 노출 될 수 있습니다. MALDI 아나 용해는 펩타이드 합성 또는 분해에서 발생한 오류를 공개에 매우 도움이 될 수 있습니다. 예상 분자량 아래의 관찰 감소는 아미노산 (들) 몇 제대로하지 않았다 표시 할 수 있습니다, 또는 그 펩타이드 분획은 (분자량이 일반적으로 관측 된 변화의 소스에 대한 표 2 참조)가 발생했습니다. 관찰 된 분자량 사용한 보호기의 무게에 의해 예상보다 높은 경우에, 절단 및 탈 보호가 불충분하고 펩티드 추가적인 시간 recleaved되어야한다는 것이다.

X; "> MW 변화 (g / 몰) <TD 스타일 = "너비 : 64px;"> +24 DTH : 64px; "> -113 03px; "> 프로 103px; "> 티르 : 폭 20 픽셀 : 높이 20"= 스타일 "
아미노산 삭제 MW 변화 (g / 몰) Uncleaved 보호 그룹 일반적으로 존재하는 이온 MW 변화 (g / 몰)
알라 -71 아세틸 +42 CL - +35
인수 -158 알릴 +40 K + +39
ASN -114 할당 +85 MG 2 +
미루 나무 -115 BOC +100 + +23
CYS -103 고체상 합성 +223
GLN -128 OtBu +56
글루 -129 PBF +252
GLY -57 tBu에 +56
그의 -137 TRT 242
-113
레우
리스 -128
만난 -131
반페 -147
-97
SER -87
THR -101
TRP -186
-147
-99

표 2. 일반적으로 펩타이드의 분자량의 변화를 관찰했다.

전자 레인지를 이용한 메타 크릴 화 방법을 사용하여 생산 로머는 재생 의학, 약물 전달 응용 프로그램의 숫자에 사용할 수 있습니다. 여기에 합성 작용 펩티드 및 PEGDM는 질산화물 매개 중합 (NMP), 원자 이동 라디칼 중합 (ATRP) 또는 가역 Addi의를 사용하여 폴리머에 통합 할 수 있습니다기 - 분할 전송 (RAFT) 방법 24. 이전의 Khetan 및 버딕 22 조브 문서에서와 같이 겔 네트워크는 또한, 세포의 존재하에 제조 할 수있다. 단독 PEG 몇몇 세포 유형 (25)의 생존과 기능에 중요한 세포 물질의 상호 작용을 제공하지 않기 때문에 이것은 종종 그러한 RGD 또는 세포 외 매트릭스 분자와 같은 세포 접착 펩타이드의 결합을 필요로한다. 펩타이드는, 예를 들어, 기존의 고체상 펩티드 합성을 사용하여 합성 및 하이드로 겔 네트워크에 내장 할 수 있도록 여기에 설명 된 것처럼 작용 될 수있다. 도 6, 하이드로 겔 (0.5 ㎜)가 부착 된 수와 확산 셀 (도 6b의 증가, PEG 하이드로 겔 표면에 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)의 부착을 용이하게 소재 크릴 기능화 세포 접착 펩타이드 GK RGDS G의 포함 된 바와 같이 ), PEG 비교 (세포 접착 펩타이드없이 하이드로 (26) 인테 매개로 상호 작용을 통해보다 펩타이드에 흡착 특이 단백질을 통해 PEG 하이드로 겔와 상호 작용을 할 수있다. 이 PEG 스페이서를 통합하고 비특이적 상호 작용을 방지하기 위해, 펩티드는 왜가리와 허벨 (26)에 의해 설명 된대로, N-히드 록시 숙신 활성화 에스테르를 통해 PEG를 monofunctionalized에 접합 될 수있다.

하이드로 겔 네트워크의 응용 프로그램은 재료의 특성에 엄격한 제어를 필요로합니다. PEG 하이드로 겔에 중요한 이점은 이러한 속성을 제어 높은 수준이다. 예를 들어, 분자량은, 수, 팔 및 PEG의 중량 %는 하이드로 겔 네트워크의 형성에 사용은-술통 미세하도록 변경 될 수있다특정 응용 프로그램에 대한 전자 속성. 이 하이드로 겔 메쉬 크기에 엄격한 제어 하이드로 겔 팽윤 율 (Q)과 강성 (탄성 계수, E)을 제어 (ξ)를 할 수 있습니다. 이는도 7a에 도시 된도 8, 정량화 곳 하이드로 겔 메쉬 크기의 증가 (도 8a) 및 하이드로 겔 강성 (도 8b)의 감소 PEG 로머 분자량 결과를 증가시킨다.

이러한 하이드로 겔 네트워크에서 대량 동작을 제어하는 기본 물리적 특성은, 메쉬 크기는 플로리 - Rehner 보낸 식 (16)을 사용하여 계산됩니다. 이 계산을 수행하기 위해, 체적 팽윤 율 (Q)는 우선 수학 식 4로부터 계산된다 :
식 4 (4)

ρ의 물의 밀도 (1 ㎍ / ㎖)이고, ρ (P)는 PEG의 밀도 (이다1.12 ㎍ / ㎖), M의 하이드로 겔 및 M D의 부어 질량 (자주) 동결 하이드로 겔의 동결 건조 후 측정 된 하이드로 겔의 건조 질량입니다. 가교 (M ℃, 소재 g / 몰) 사이의 분자량은 다음 수학 식 5로부터 계산된다 :
식 5 (5)

M은 N (g / 몰 소재) PEG의 수 평균 MW이고, 식 5.05 중합체의 체적이다 식 5.1 , V 1은 물의 몰 부피 (18 ㎖ / 몰)이고, V 2는 하이드로 겔의 평형 중합체 체적 분율
( 식 5.2 ) 및 X 1 16. 가교 (N) 사이의 결합의 수는 다음 식 (6)으로부터 계산된다 :
식 (6) (6)

N B는 PEG 반복 채권의 번호입니다 (3)과 M의 R은 PEG 반복 (44 G / mol)을 27 MW이다. 이를 통해 고분자 사슬의 제곱 평균 종단 간 거리 식 6.1 (뉴 멕시코에서) 식 (7)로부터 계산한다 :
식 (7) (7)

난 (CC 및 CO의 결합 길이를 기준으로 계산 0.146 nm의)의 평균 결합 길이와 C의 n은 폴리머 (PEG에 대한 4.0) (28)의 특성 비율입니다. 인터넷nally, 하이드로 겔의 메쉬 크기는 수학 식 8로부터 계산 될 수있다 :
식 8 (8)

하이드로 겔 성질은 유사 하이드로 겔의 형성에 사용되는 PEG의 양을 조정함으로써 조정될 수있다. 이어서 하이드로 겔 강성을 감소 하이드로 겔 메쉬 크기가 증가 PEG 로머 결과의 중량 백분율을 감소.도 7b는 예시 및도 9는 PEG의 중량 %가 메쉬 크기를 제어하는 데 사용될 수있는 하이드로 겔 형성에 사용하는 방법을 정량화 (도 9a) 및 결과 하이드로 겔 강성 (그림 9B). 기판의 강성이 같은 줄기 세포의 분화 29과 같은 세포 행동에 영향을 도시 한 바와 같이, 단단하게 강성을 제어 할 수있는 능력은 하이드로 겔의 제조에있어서 중요한 특성이다.

히드로 겔은 CONTR에 이용 될 수있다올 약물 전달. 도 7a에 도시이어서 캡슐 형 약물, 소 혈청 알부민 (BSA)의 방출을 증가 하이드로 겔 네트워크의 메쉬 크기를 증가 PEG 로머의 분자량이 증가하는,도 10에서와 같이. 이 연구에서 하이드로 겔 샘플 메쉬 크기 계산을위한 하이드로 겔 습식 및 건식 질량의 측정을 할 수 있도록 T = 1백95시간에 파괴되었다 있지만, 그것은 샘플이 긴 시간 동안 배양했다 BSA의 방출이 발생합니다 계속 우리의 경험이다. 다른 그룹은 또한 BSA는 PEG 하이드로 겔 네트워크 (30) 내에서 확산에 내성이 있음을보고 한대로 그림 10에서 관찰 BSA의 불완전한 버전은, 예상하지 못한 것입니다. 캡슐화 된 단백질의 불완전한 출시로 인해 단백질과 PEG 로머, 또는 PEG와 BSA 31 라이신 잔기에 차 아민 그룹의 메타 크릴 레이트 그룹 사이에 공유 결합과 수소 결합에 발생할 수 있습니다 (그림 2A) 네트워크 비 이상성 (nonideality) 및 이종 하이드로 겔 메쉬 크기 경향이있다, 그것은 캡슐화 된 BSA의 일부가 훨씬 작 메시가 하이드로 겔의 영역에 포함하는 것도 가능하다 그것의 방출을 방지 젤 내에서 전체 평균보다 크기입니다. 캡슐화 된 BSA의 불완전 nonFickian 동의서 (데이터가 표시되지 않음)이 경우에 관찰 있지만, 인슐린, 알부민 등의 수많은 다른 모델 약물의 제어 Fickian 릴리스 유사한 PEGDM 30을 하이드로 겔 사용하여 증명되었다. 또한, 왓킨스와 Anseth 비슷한 하이드로 겔의 형광 분자의 방출을 보여주기 위해 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용했다가 Fickian 확산과 수용 가능한 모델로 나32 thods.

이 연구에서 형성된 하이드로 겔은 비 분해성 있지만, 네트워크 열화에 혼입하고 이러한 네트워크 내에 동조 될 수있는 또 다른 파라미터이다. 제어 하이드로 겔 저하에 제공하는 것은 세포 행동 (33), 조직의 성장 또는 호스트 조직 내 성장의 촉진, 또는 편의 적출 (34)의 필요성을 제거에서 변경 될 수 있습니다. 분해 PEG 하이드로 겔은 일반적으로 35 메타 크릴 화 이전에 PEG 내 수산기 상 개환 가수 분해 D, L-락 타이드 글리콜 라이드, 또는 ε-카프로 락톤 그룹에 의해 합성된다. 이들 세 개 글리콜 에스테르 인해 그들의 다양한 소수성에, 최대 락 티드 이어 분해 감수성, 및 카프로 락톤 에스테르를 갖는, 에스테르 작용기의 가수 분해에 의해 분해. 가수 분해성 기의 혼입 후, PEG는 또한 메타 크릴 화 절차를 이용하여 작용 화 detaile 수이후 라디칼 개시 사슬 중합 (36, 37)를 통해 하이드로 겔 네트워크 형성을 가능하게이 문서에서 D. 하이드로 겔 네트워크의 열화의 속도는 가수 분해성 기 (글리콜 라이드, 락 티드 등)의 신원을 변화시킴으로써 및 구조에 통합 35,38 분해성 반복의 수를 변경함으로써 제어 할 수있다.

이론적으로, 여기에 설명 된 방법은 각각의 단계 1.3 및 3.3에 아크릴 무수 메타 크릴 산 무수물을 대체하여 PEG와 펩타이드의 아크릴화에 사용될 수 있습니다. 그러나, 아크릴 무수물은 훨씬 적은 매력 전자 렌지를 이용한 메타 크릴 화보다 전자 레인지를 이용한 아크릴화를하고, 무수 메타 크릴 산 39, 40의 20 배 이상 비용입니다.

우리는이 절차의 효율성을 평가하는 방법을, PEG와 펩티드를 기능화하는 간단한 신속한 방법을 설명하고, U에 대해 그 준하이드로 겔 네트워크를 형성하도록 합성 재료를 부른다. 이러한 합성 도구는 응용 프로그램에서 매우 다양한 있으며, 약물 전달 및 재료 연구 실험실의 수의 주식을 증명해야합니다.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 / 로체스터의 대학과 정형 외과 연구 및 교육 재단 / 근골격계 이식 재단 (OREF에서 박사 다니엘 벤와에게 제공 시작 펀드, 하워드 휴즈 메드 -에 - 졸업생 교제 (AVH)에 의해 부분적으로 투자되었다 MTF). 저자는 자신의 장비의 사용에 박사 제임스 L. 맥그래스에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol Tokyo Chemical Industry Co, LTD D2649 CAS 14970-87-7
Acetonitrile J.T. Baker UN1648 CAS 75-05-8
Amino Acids AAPPTech Glycine: AFG101 CAS 29022-11-5
Arginine: AFR105 CAS 154445-77-9
Asparagine: AFD105 CAS 71989-14-5
Serine: AFS105 CAS 71989-33-8
Anhydrous diethyl ether Fisher Scientific UN1155 CAS 60-29-7
Citric acid Sigma Aldrich C1857 CAS 77-92-9
Deuterated chloroform Cambridge Isotope Laboratories Inc. DLM-7-100 CAS 865-49-6
Dichloromethane Fisher Scientific UN1593 CAS 75-09-2
Diisopropylethylamine Alfa Aesar A1181 CAS 7087-68-5
Dimethylformamide Fisher Scientific D119-4 CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang resin Peptides International RGF-1301-PI 100-200 mesh size
Methacrylic anhydride Alfa Aesar L14357 CAS 760-93-0
N-Methylpyrrolidone VWR BDH1141-4LG CAS 872-80-4
On-resin peptides Synthesized in-house On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate AnaSpec Inc 510/791-9560 CAS 94790-37-1
Peptide Calibration Standard Care 206195
Piperazine Alfa Aesar A15019 CAS 11-85-0
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear Alfa Aesar B22181 CAS 25322-68-3
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear Alfa Aesar B21955
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear Sigma Aldrich 81300 JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG
Thioanisole Alfa Aesar L5464 CAS 100-68-5
Trifluoroacetic acid Alfa Aesar A12198 CAS 76-05-1
Triisopropylsilane Alfa Aesar L09585 CAS 6485-79-6
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Tokyo Chemical Industry Co, LTD C1768 CAS 28166-41-8

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