Biyomedikal Uygulamalar için İpek-ipek Protein Alaşım Materyalleri Tasarlama

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Karıştırma özellikleri ve kombine özellikleri geniş bir yelpazesi ile biyomalzemeleri oluşturmak için etkili bir yaklaşımdır. Farklı doğal ipek proteinleri arasındaki moleküler etkileşimlerin tahmin eden, ayarlanabilir mekanik dayanıklılık, elektriksel tepkinin, optik saydamlık, kimyasal işlenebilirliği, biyolojik olarak ya da bir termal stabilitesi olan yeni bir ipek-ipek proteini alaşım platformları tasarlanabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hu, X., Duki, S., Forys, J., Hettinger, J., Buchicchio, J., Dobbins, T., Yang, C. Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (90), e50891, doi:10.3791/50891 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lifli proteinler, biyosensörler, nanotıpta, doku rejenerasyonu ve ilaç dağıtım gibi biyomedikal alanlarda çeşitli uygulamalar için kullanılmaktadır farklı dizileri ve yapıları görüntüler. Bu proteinler arasındaki moleküler ölçekli etkileşim dayalı materyal tasarımı ayarlanabilir özelliklere sahip yeni çok fonksiyonlu bir protein alaşım biyomalzemeleri oluşturmak yardımcı olacaktır. Bu alaşım malzeme sistemleri, aynı zamanda, vücut içinde biyolojik olarak malzeme, biyolojik uyumluluk ve Tutulabilirlik geleneksel sentetik polimerler ile karşılaştırıldığında avantajlar sağlamaktadır. Bu makalede, protein alaşımı üretmek için nasıl hesaplama yöntemleri, protein-protein etkileşimleri tahmin nasıl dahil olmak üzere bu konularda, ilgili yararlı protokolleri sağlamak için bir örnek olarak yabani tussah ipek (Antheraea pernyi) ve yerli dut ipek (Bombyx mori) protein karışımları kullanılır çözeltiler, ne kadar termal analiz ile alaşım sistemlerini doğrulamak ve nasıl değişken alaşımlar imal edilmesi içinkırınım mazgallar ile optik malzemeler, devreler kaplamalar ile elektrik malzemeleri ve ilaç salımı ve teslimat için ilaç malzemeleri dahil. Bu yöntemler, farklı protein alaşımları dayalı yeni nesil çok fonksiyonlu biyomalzemelerinin tasarımı için önemli bilgiler sağlayabilir.

Introduction

Nature, yapısal proteinlerin sınırlı bir miktarı kullanılarak ayarlanabilir ve çok fonksiyonlu biyolojik matrisler oluşturmak için stratejiler yaratmıştır. Örneğin, elastinler ve kolajenler her zaman belirli dokular için gerekli olan 1,2 ayarlanabilir güçlü ve işlevleri sağlamak üzere in vivo olarak birlikte kullanılır. Bu stratejiye anahtarı karıştırma olduğunu. Karıştırma belirli oranlarda karıştırılarak proteinleri içerir ve ayarlanabilir ve çeşitli özellikleri 3-5 ile basit malzeme sistemleri üretmek için teknolojik bir yaklaşımdır. Sentetik mühendislik stratejileri 6,7 ile karşılaştırıldığında, karıştırma aynı zamanda malzeme tekdüzelik nedeniyle operasyon 8-16 kolaylığı malzemeyi işlemek için yeteneğinizi artırabilir. Bu nedenle, çok fonksiyonlu, biyouyumlu protein alaşımlı malzeme tasarımı tıbbi araştırma gelişmekte olan bir alandır. Bu teknoloji aynı zamanda hücre ve doku fonksiyonlarının vit hem de doğal protein matrislerin etkisini sistematik bilgi sağlayacaktırro ve in vivo 10,17 olarak. Farklı proteinler arasında molekül arayüzleri optimize ederek, protein bazlı alaşımlar ve termal farklı sıcaklıklarda stabilite, değişken organlarda çeşitli dokulara elektrik duyarlılık desteklemek için elastikiyet, ve korneal doku rejenerasyonu 3 optik özellikleri gibi fiziksel fonksiyon, bir dizi kapsayabilir 18-27. Bu çalışmaların sonucu ayarlanabilir doku onarımları ve hastalık tedavileri ve yeni tedavi ve tanı özellikleri 3 tasavvur edilebilir, biyobozunur implant cihazlar için daha fazla kurşun ile doğrudan ilgili biyomedikal bilim alanında yeni bir protein malzemeler platform sağlayacaktır.

Birçok doğal yapısal proteinler biyomalzeme matrisler adaylar olarak istismar edilebilir kritik fiziksel ve biyoaktif özelliklere sahip. Farklı kurtlara ipekler, farklı dokulardan tüyleri ve yünler, elastinler ve kollajenler gelen keratinlerden veÇeşitli bitki proteinleri (Şekil 1) 18-27 değişken protein bazlı malzemeler dizayn etmek için kullanılan en yaygın yapısal proteinler arasında. Genel olarak, bu proteinler dolayı eşsiz tekrarlanan primer amino asit dizilerine 3,28-35 ancak farklı bir molekül ikincil yapılar (örneğin ipek, beta yaprak veya keratinlerden için sarılmış bobinler) oluşturabilir. Bu özellikler biyopolimer malzeme değerli bir kaynak olarak kullanımları isteyen biyolojik arayüzlerde benzersiz işlevleri ile kendinden düzenlenen makroskopik yapıların oluşumunu teşvik eder. Burada, yapısal proteinlerin iki tür kullanılmıştır (yabani tussah ipek ve örnek olarak evcil dut ipek protein B proteini A), çeşitli protein biyo materyaller alaşım üretilmesi genel protokoller göstermek için. Göstermiştir protokolleri bölümünü 1 şunlardır: protein etkileşim tahminler ve simülasyonları, bölüm 2: Protein alaşımlı çözümleri üretimi ve parçası 3: Protein alaşımın imalatısistemleri ve optik, elektrik ve ilaç uygulamaları için.

Şekil 1
Şekil yaygın, protein bazlı materyal tasarımı farklı solucan türlerin ipek dahil olmak üzere laboratuvarda kullanılan çeşitli yapısal proteinlerin 1. Hammadde, tüyleri ve yünler, farklı dokulardan elastinler ve çeşitli bitki proteinlerden keratinlerden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protein Etkileşimleri 1. Tahmin

  1. Protein Moleküllerin Bioinfomatics Analizi
    1. Biyoteknoloji Bilgi web sitesi için Ulusal Merkezi (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) ziyaret edin ve alaşımlı çalışma için kullanılacak protein adları arama. Not: Bu örnekte, iki protein kullanıldı: vahşi tussah ipek fibroin, Protein A, ve iç dut ipek fibroin olan proteini B,. Protein A için, amino asit dizileri "[Antheraea pernyi] GenBank fibroin: AAC32606.1" bulunabilir (Antheraea pernyi Çince (Meşe) Tussah güve). Protein B için, amino asit dizileri bulunabilir "Fibroin ağır zincir öncüsü [Bombyx mori] NCBI Referans Dizini: NP_001106733.1" ve "hafif zincir öncü Fibroin [Bombyx mori] NCBI Referans Dizini: NP_001037488.1", birlikte (Bombyx mori) dut ağacının evcil ipekböceği olduğunu.
    2. Seç ve saveritabanından protein A ve protein B'nin amino asit dizilerini ettik.
    3. EXPASY web sitesi (SIB Biyoinformatik Kaynak Portalı) (www.expasy.org) ziyaret edin veya dahil olmak üzere dizilere dayanan temel bioinfomatics proteinlerin verileri hesaplamak için diğer ticari yazılım kullanmak, ancak molekül başına toplam ücret, hidrofobikligi indeksi, bunlarla sınırlı olmamak vb Bu bilgi molekül, farklı pH değerlerinde moleküllerin titrasyon eğrisi, protein etkileşimleri hesaplama simülasyonu için temel unsurları olarak kullanılacak ve bu iki proteinin güçlü etkileşimler olup olmadığını anlamak için yardımcı olacaktır. [Not: Bu adım özellikle küçük peptitler veya fonksiyonel proteinler bilim kullanılanlar gibi protein etkileşim her detayını tahmin için değil. Bu bölümün amacı, bir "alaşım" malzeme denilen olamaz bariz makrofaz ayrımları ile bir protein karışımı üreten önlemek için sadece. Bu nedenle, tahmin yaklaşık fakat inci olabilirE proteini alaşım sistemi] kesin termik analizi kullanılarak aşama 3.1 'de tarif edilen bir deney yöntemi ile kontrol edilebilir.
  2. Protein Alaşım sistemi Hesaplamalı Simülasyonu
    Aşağıda protein alaşım sistemini simüle etmek için bir prosedür açıklanmıştır. Bir simülasyon programı, tek veya çok işlemcili bir bilgisayar sistemi üzerinde kullanılabilir C programlama dilinde yazılmıştır. Bir kafes-yay-kütle (LSM) modeli alaşım proteinleri 36-39 simüle edilmesi için kullanılmıştır. Bir yay bağlı ve her biri kitle için hareket anlamak için kuvvet denklemi çözmek zaman LSM model kütlesi üzerinde net kuvvetin basit bir açıklamasını verir. Aşağıdaki gibi basit bir program algoritması verilen EKK modeli kullanarak bu proteinin alaşım sistemi modellemek için:
    1. M kütleye sahip iri taneli parçacık gibi tek bir proteini Temsil.
    2. Bir bağ 38,39 temsil eden bir Hookyen veya neo-Hookyen yayı kullanın. Yaylar partikül sonlu sayıda birbirine bağlayarak, tek bir teneke kutu malaşımlı proteinlerin stabil bir yapı bloğu temsil eden bir alt etki alanı alaşım AKE. Içi bağlantı tahvil farklı türlerini temsil etmek için, farklı yay sabitleri / sertlik kullanın.
    3. Usulüne, çapraz-bağlanmış alt alaşımları oluşan bir madde olarak bir protein alaşım sistem modeli. Burada tekrar, farklı sertlikteki yaylar alt alaşımlar arası bağlantıları arasında farklı bağları temsil etmek için kullanılır.
    4. Zayıf bağlar reforme edilmesi için izin hangi aracılığıyla Bell Modeli 40,41 ile bağ kırılmasını ve reform sürecini modellemek ama onlar kırık kez güçlü bağlar reform olamaz. Sistem yeterince (içi suballoy ve inter-suballoy tahvillerin hem de) stresli olduğunda, tahvil kırık ve reforme edilebilir.
    5. Da yüke zaman alaşım proteinleri üzerinde deformasyon etkilerini incelemek için, sisteme harici kuvvetler uygulanır. Kuvvet denklemini (Newton Kanunları) çözerken her parçacığa eşit bu güçleri dağıtın.
    6. Etkileşimi modellemek için(su molekülleri gibi) çözeltisi ve proteinler arasında, her bir parçacık için ek bir sürtünme kuvveti ve sürtünme kuvveti uygulanır.
    7. Her bir kuvvet (bağ harici kuvvet ve sürtünme kuvvetinden yay gücü) eylemleri ile her bir parçacık için güç denklemi çözün.
    8. Hesaplayın ve zamanın bir fonksiyonu olarak protein taneciklerinin konumlarını ekstrakte edin.
    9. Parçacıkların pozisyonlarından alaşım proteinleri karakterize fiziksel miktarları hesaplanır.
    10. Farklı proteinler arasındaki etkileşimleri anlamak için programda tahvil sertlik değiştirin. (Ortalama bağ sertliği protein materyallerinden Young modülü hesaplanır. Farklı elyaflı protein materyallerinden Young modülü Universal Çekme Testi 18 ile ya da doğrudan bir önceki Literatüre 2-4,18 ikinci ya da elde edilebilir).

Protein Alaşım Çözümleri 2. Üretim

Vahşi tussah ipek (Protein A) ve iç dut ipek (proteininin, B) proteininin alaşım sisteminin, burada örnek olarak seçilmiştir. Bu protokol, ilk olarak vahşi tussah ipek (Protein A), çözelti elde etmek için nasıl sunar.

  1. 3 g ağırlığında ham yabani tussah koza veya lif kesin.
  2. , Sodyum dikarbonat ya da sodyum karbonat ve 3 g ölçün (Not: sodyum karbonat kullanılarak, protein zincirlerinin molekül ağırlığı, kaynatma işlemi sırasında 42 azaltacaktır durumunda).
  3. Saf su ile 2 litrelik bir cam beher doldurun (H2O). Ardından, sıcak bir sahnede cam kabı koyun kaynar alüminyum folyo ve ısı ile örtün.
  4. Alüminyum folyo kapağı çıkarın ve tamamen çözünmesi için izin, kaynar suyun içine yavaş yavaş ölçülen sodyum dikarbonatı ekleyin. (Not: Sodyum dikarbonat rolü yabani ipek liflerinin yüzeyi üzerine bağlanabilir çözünür serisin proteinlerin ve diğer safsızlıkların temizlemek için "sabun" olduğu Oth kullanılıyorsa.er doğa protein lifleri) literatüre göre ilgili kimyasal maddeler seçiniz.
  5. Kaynar suyun içine çiğ protein lifleri (yabani ipek lifleri) ekleyin ve 2-3 saat (Not için kaynamaya bırakın:. Kaynama süresi protein zincirlerine 26,43 moleküler ağırlığı kritik bir etkiye sahip biri göre uygun bir zaman seçmelisiniz Literatüre ve kontrol deneyleri 26,43 gerçekleştirerek. kaynama sıcaklığı aynı zamanda, protein zincirlerinin 26,43,44) 'nin moleküler ağırlığı etkilemesi ayarlanabilir.
  6. Kaynatıldıktan sonra dikkatle çözeltiden bir spatula ile, protein lifleri çıkarır ve fazla suyu çıkarmak için onları sıkın. (DİKKAT: lifleri çok sıcak!)
  7. Daha sonra, soğuk damıtılmış su ile bir 2 L'lik bir kap içinde elyafların sokmak ve tamamen lif yüzeyinden katışık lekeleri çıkarmak için 30 dakika her biri için iki kez lifleri yıkayın. En az 12 saat süreyle bir çeker ocak içinde elyafların kurutun.
  8. Kalsiyum sirke içinde 45,784 gr eritinoranı (Ca (NO 3) 2), bir cam beher içinde, vahşi ipek proteini liflerin eritilmesi için 65 ° C sıcaklıkta bir sıvı oluşturmak üzere. (Not: diğer doğal protein lifleri kullanıyorsanız, bir proteinleri çözmek için çözücü tekabül seçin Burada da 9.3 M LiSCN veya LiBr çözüm, ya da farklı ipek lifleri çözülmesi için 85% fosfat çözümü kullanabilirsiniz.).
  9. Çözücü 10 ml 1 g elyaf oranında lifler ve solvent birleştirin. Lifler, 5-12 saat boyunca 95 ° C 'de çözünmeye bırakılır. (Not: eritilmesi zaman 26,43-45 proteinlerinin moleküler ağırlığına bağlıdır)
  10. Şırınga kullanarak, (kesme boyutu en fazla 1000 MW) 12 mi diyaliz kaseti içine yabani ipek çözeltisini ya da sızdırmaz diyaliz boruların (kesme boyutu en fazla 1000 MA) enjekte edilir ve damıtılmış su, 2 L karşı dializ. (: Enjeksiyon 35 ° C'de çözeltiyi muhafaza ise daha etkilidir, aksi protein çözeltisinin viskozitesi, oda sıcaklığında büyük ölçüde artacaktır Not). (NO 3) çözeltisi içinde 2 çözücüler (30 dakika, 2 saat, 6 saat sonra ve daha sonra her 12 saat için 3 gün. Toplamda, yaklaşık 8 su değişimi olacak) Ca kaldırmak için sık sık damıtılmış su değiştirin.
  11. 3 gün sonra, diyaliz kaset veya tüp protein çözeltilerinin toplamak ve 13.000 rpm yüksek tüpler içine yerleştirin.
  12. Artıkları çıkarmak için 4 ° C'de 3 x 3,500 rpm'de 1 saat için çözümler santrifüjleyin. Her santrifüj çalıştırmak sonra, hızla yeni tüpler içine süpernatant çekin. 4 ° C'de buzdolabında son çözüm saklayın.
  13. (Bu, genellikle en fazla 12 saat sürer) bir polidimetilsiloksan (PDMS) bir alt tabakadan veya diğer yassı hidrofobik alt-tabaka üzerine protein çözeltisi 5 ml dökün ve tamamen kurumasına izin verin. Kalan katı protein filmini tartılır ve (ml) ağırlık (% hacim / ağırlık) yüzde = (mg) Ölçülen Ağırlık ÷ 5, 10 ÷ tarafından nihai çözüm konsantrasyonunu hesaplamak.
  14. Bu cas başka seçilmiş doğal protein lif (toplayınE, evcil dut ipek) protein B olarak kullanılmıştır, ve ölçülen konsantrasyon ile son protein su çözelti elde edilene kadar, uygun bir "soap" ve çözücü madde ile çözülmesi işlemi tekrarlayın. [Not: protein malzemeleri, toz halinde ise, "sabunlama" işlemi sırasında numune tutmak için uygun olan gözenekli bir tüp veya membranlar kullanılır. Protein daha önce saflaştırılmış olan, doğrudan tozu çözmek üzere 2,8 adıma gidin. Protein önceden saflaştırılmış ve suda çözünür ise, ilk önce bir istenen konsantrasyonuna sahip olan sulu bir çözelti yapmak ve daha sonra karışım, protein solüsyonlar yapmak için aşağıdaki 2,15 adıma gidin.]
  15. Yavaş yavaş 1.0 ağırlıkça% Protein A sulu çözeltisi oluşturmak için, 4 ° C'de damıtılmış su içinde Protein çözeltisi (on yaban ipek çözeltisi) seyreltin. Protein B (burada evcilleştirildiği ipek) için aynı işlemi yapın.
  16. 4 ° C'de yavaş yavaş 1 ağırlıkça% protein Protein B çözeltisi ile bir çözeltisini ° C arasındadır önlemek için bir pipet kullanılarakKarıştırma sırasında toplanmasını rotein. (Not 1: Bazı proteinler (örneğin, ipekler) vibrasyon 46,47 sırasında hidrojeller oluşturacak beri proteinleri karıştırmak için bir vorteks aleti kullanmayın Not 2:. Mümkünse, karıştırma hızı ve karıştırma boyut verme kontrol etmek için ek cihazları kullanmak toplanmasını önlemek için mümkün olduğunca yavaş karıştırın emin olun. hızlı karıştırma sırasında çözüm pipetle etmeyin).
  17. Nihai karıştırma çözeltiler belirli bir kütle oranını ya da Protein A mol oranında olmalıdır: Protein B Tipik olarak, elde etmek için, kütle oranının 90:10, 75:25, 50:50, 25:75 ile 10:90 karıştırın alaşım çözümleri geniş bir spektrumu. Kontrolleri gibi saf protein A ve protein B solüsyonları kullanın. Protein B = R: (100-R), Protein A molar oranı olan bir karışım için, çözelti. Hacim A: Hacim B = R · (A MW): (100-R) · (B MW) tarafından (aynı ağırlıkça% 1 çözüme dayalı) karıştırma hacmi oranını hesaplayın.
  18. Hemen filmler ya da diğer desi oluşturmak için PDMS yüzeylere kesin çözümler üzerinde dökümgned malzemeler. (Not: Uzun süre yüksek konsantrasyon protein alaşımlı çözüm tutmayın fazla agrega nedeniyle su, protein-protein etkileşimleri daha sonra meydana gelebilir.). Gerekirse, iyon içermeyen saf su ile karışım seyreltik çözeltiler ve çözeltiler ilave proteinin toplanmasını önlemek için, 4 ° C'de buzdolabında saklayın.

Değişken Protein Alaşım Malzemelerin 3. Fabrikasyon

  1. Termal Analiz ile Alaşım Tahmin onaylayın 3,9,31-35
    1. PDMS malzemenin hazırlanması ve distile su iliklerine bunları temizleyin.
    2. PDMS substratlar üzerine farklı karıştırma oranlarında ile, protein karışımı çözüm döküm.
    3. Filmler oluşana kadar hava akımı olan bir kimyasal başlığı içinde en az 12 saat boyunca çözüm kurutun (Not: filmlerin kalınlığı sabit olabilir, böylece farklı çözümler için aynı hacim kullanma).
    4. PDMS alt tabakalardan protein alaşım filmi çıkarın ve temiz yemekler üzerine koyun.
    5. Birçok Diferansiyel Tarama Kalorimetrisi (DSC) alüminyum tava ve kapak DSC çalışma için tartılır. Eşit ağırlığa sahiptir için tava ve kapak çift maç (kapağın tavaya artı ağırlığının, ağırlık olarak sabit bir ağırlık eşittir). Örneğin, burada toplam ağırlığı kapağın ve 22,50 mg kaydırma kullanıldı ve bu, toplam ağırlığı ile, kapak ve tava kombinasyonları sekiz setleri hazırlanmıştır.
    6. Alüminyum DSC tava içine kurutulmuş protein her tür karışımları 6 mg saklanması ve süreç 3.1.5 eşleştirilmiş kapaklarla onları mühür. DSC bu genel bir referans tava + Kapak ısı kapasitesinin karşılaştıracaktır: kendileri termal analizleri (Not sırasında kaydedilir örnekler sadece ısı kapasitesi ve böylece boş tava ve kapak çiftini mühür referans olarak numune ile kullanılacak numune + tava + Kapak. eşit ağırlıkları nedeniyle bir, tava ve kapak gelen plan ısı kapasitesi tavada örneklemin sadece ısı kapasitesi) terk hesabına olacaktır.
    7. Ile, bir DSC aracı haline mühürlü referanslar ve örnek tava koyun50 ml / dakika, kuru bir azot gaz akışı temizlenmiş ve bir soğutma sistemi ile donatılmış. Örnek ölçümler önce, DSC alet sırasıyla birinci ısı akışı ve sıcaklık için safir ve indiyum ile kalibre edilmelidir.
    8. 150 ° C de 2 K / dakikalık bir ısıtma oranında DSC önceden çalıştırılmış ve daha sonra, numuneler (toplam ağırlığının tipik olarak yaklaşık% 3-10) herhangi bir geri kalan su moleküllerini çıkartmak için 15 dakika boyunca bu sıcaklıkta tutun. Hızlı bir şekilde 25 ° C (10 K / min) soğutun.
    9. 300 2 K / dakikalık bir ısıtma hızında DSC yeniden çalıştırın ° C ya da protein harmanların bozulması tepe 34 görünene kadar. Bu işlem sırasında, farklı sıcaklık, protein, numunenin ısı kapasiteleri kaydedin. DSC soğumasını ve farklı karıştırma oranı ile yeni bir numune için eski örnek olarak değiştirin.
    10. Hesaplayın ve DSC yazılımı 31-35 kullanarak her bir protein karışımı numune için sıcaklık eğrilerinin vs Isı Kapasitesi arsa.
    11. M Judge, şu yöntemle de protein karışımlarının iscibility (Şekil 4 ve Şekil 5 Isı bak) ve iki proteinin tam olarak karışabilir, onlar "Protein alaşımlar" olarak adlandırılabilir. Aksi takdirde, bu terim "Protein bileşik," polimer betimleyici kuramlar 48,49) göre uygun bir ad şu şekildedir:
      1. Tek tek proteinlerin A ve B ayrı ayrı tek bir cam geçiş sıcaklığı, T g (A), ve T g (B) (Şekil 5, yeşil ve mavi eğrileri bak) 3,48 sahip olmalıdır;
      2. Bu tek bir cam geçiş sıcaklığı iki ayrı protein bileşenlerine, T g, (A) ve T g (B) arasında, normal olarak, bu ara ürün olan 3,48 (Şekil 5'e bakınız);
      3. Karışmayan faz ayrılması, her iki T g, (A) ve T g, (B), orijinal pozisyonda (Şekil 5) ortaya çıktı halinde elde edildi ve her bir Tg adımda KARIŞIMLARIbileşime orantılı olarak yüksekliği, iki proteinin tam olarak 3,48 ile karışmayan bulunmaktadır.
      4. Yarı-ile-karışabilir bileşik karışımı tipi, bir çok geniş bir camdan geçişe sahip olacaktır, ya da yine iki cam geçişler vardır, fakat her saf protein bileşenleri, T g, (A) ve T g, (B), (göre birbirlerinin yakın göç etmiş ) Şekil 5'e bakın. Bu durumda, bu iki protein bileşenleri arasında oluşan mikro heterojen faz yapısı olabilir ve bileşim, bölgeden bölgeye değişir.
    12. (3.1.11.1) DSC gösterilen durumda olduğunu ve protein AB bir alaşım sistemi olduğunu teyit edilebilirse, daha sonra protein alaşımlı malzemelerin imal geçmek.
  2. Protein Alaşımlarında tarafından Optik Malzemelerin İmalatı
    1. (Fabrikasyon laboratuar) üretin veya döküm için tasarlanmış topografik yüzeye satın. Bu özel örnekte, dört kırınım desenleri olan bir cam kullanılır (Şekil 4Optical) kullanılmıştır.
    2. Bir çanak içine kırınım desenleri ile cam yerleştirin ve desenli yüzey yukarı karşı karşıya olduğundan emin olun.
    3. Cam yüzeyi üzerinde eşit PDMS çözüm yaymak, ve tam yüzey desenleri kapak (: kullanıcı talimat 23,44 göre 1 karışım oranına PDMS çözüm çömlekçilik ve 9 katalizör çözeltisi ile yapılır).
    4. En az 2 saat boyunca 65 ° C fırında döküm çanak yerleştirin düz bir yüzey üzerinde iken. PDMS çözeltisi, bu işlem sırasında bir katı madde halinde kuru olmalıdır.
    5. Camdan PDMS alt tabakayı çıkarın. Kırınım paternleri PDMS yüzeye transfer edilmelidir.
    6. Uygun bir delik yumruk kullanarak difraksiyon desenleri ile PDMS kalıplar dışarı Punch.
    7. Kırınım desenleri ile PDMS yüzeylerindeki protein alaşım çözümleri Bırak, ve kırınım desenleri ile filmler elde etmek için en az 12 saat boyunca onları kurutun.
    8. Çözünmeyen bir protein alaşım malzeme elde etmek için, dr bütün set yerleştirinodasının altındaki bir su çanağı ile 60 ° C'lik bir vakumlu fırın (25 kPa) içine PDMS küfler dahil olmak üzere y filmler. Fırında havayı Pompa, ve en az 2 saat boyunca su buharları tavlama örnekleri sağlar. (Bu işlem yaygın olarak kullanılan metanol yöntemi ile karşılaştırılması. Sıcaklık kontrollü su buharı tavlama 45 denir, o ipek malzemelerin 45 benzer beta-tabaka içerik üretebilir). Vakum bırakın ve forseps kullanarak PDMS alt tabakadan suda çözünmeyen filmi soyulabilir. Bu örnek için, yabani ipek-evcilleştirilmiş ipek alaşımları kullanılır.
    9. Camına orijinal desenleri ile karşılaştırarak filmlerinde Difraktogramların kalitesini test (; genel desen kalitesi için lazer kırınım desenleri toplamak gibi, mikro ölçekli detaylar için SEM görüntüleri toplamak).
  3. Protein Alaşımları Materyalleri Elektrik Devreleri Fabrikasyon
    1. Cam substrat üzerinde bir elektrik devresi desenin için, ilk olarak CleaBazı yağ giderme kullanılarak na cam slayt, metanol içinde 5 dakika süre ile, aseton içinde, 5 dakika, ardından 5 dakika boyunca ultrasonik temizleme, içinde Alconox gibi bir çözücü. Daha yavaş aseton böylece tabakayı ziyade kuruma ve bırakarak kalıntılarını havaya uçabilir daha buharlaşır beri metanol son kullanılır.
    2. 180 litre sıvı azot Dewar kaynatmayla çıkan tarafından oluşturulan kuru bir azot gazı kullanılarak cam slayt, kuru püskürtün.
    3. Depozisyon odasına alt-tabaka malzemelerinin tanıtılması. (Bu kılavuzlar bir püskürtme sistemi için, ancak diğer kaplama teknikleri de kullanılabilir.) Içindeki hazne bir loadlock ile tasarlanmış ise, depozisyon odasındaki vakum önemli ölçüde etkilenmez. 30 mTorr basıncında için loadlock tahliye edin.
    4. Loadlock ve ana depozisyon odası arasında ana valfi açıp bölmenin içine alt-tabakanın getirmektedir.
    5. İstediğiniz depositio için baskı Ar gaz ve basınç regülatörü açın ve kontroln basıncı. Daha düşük basınçlar daha hızlı çöken filmler kalarak elde edilirken yüksek basınçlar daha düşük enerji serpilmiş metal atomlarını ve daha düzgün bir film verir. Basınçlarının aralığı 20 mTorr'dur iyi çalışma ile, genellikle 3 mTor ve 60 mTor arasındadır.
    6. Metaller daha sonra, bir ayar devresi metal hedefe yönlendirmek RF gücü için gerekli olan 100 W'lık bir RF gücünü kullanarak kaplanmasını, alt tabakanın üzerine koruyan bir kapak öngörülmüştür. DC güç metalik hedeflerin yerine RF kullanılabilir. Hedeften oksit tabakasını ve kirleri çıkarmak için, bir kaç dakika için önceden saçılırlar.
    7. Deklanşöre açın ve alt tabaka üzerine metal saçılırlar. Tarif edilen yapılandırma için Depozisyon hızı dakika başına yaklaşık 10 nm'dir. Bu oran, magnetron katot hedef kalınlık ve püskürtülmüş metal mesafesi, basınç, mıknatıs gücü çalışma bağlıdır. Istenilen kalınlıkta kaplamanın elde edilmesi için yerleştirme zamanı ayarlayın.
    8. Kaplanmış cam slayt kaldırodası.
    9. Bir değer değiştirici kullanarak, film yüzeyi üzerine bir fotorezist kaplama dönerler. Pek çok dayanıklıdır kullanılabilir. Bu durumda, pozitif fotorezist kullanıldı.
    10. Karşı kurutmak için 5 dakika boyunca 90 ° C 'de, film, yumuşak fırında üzerine bükülmüş sonra karşı.
    11. Sıkıca karşı karşı cihazın bir görüntü ile bir temas maske yerleştirin. UV ışık kaynağı fotorezist ortaya çıkarmak için kullanılır. 10 sn pozlama ama ışık kaynağının gücüne bağlı olarak farklılık gösterir ve ikinci karşı direnç gösterirler.
    12. Yansıtılan görüntü belirene kadar fotorezist geliştirici filmi yerleştirin. Geliştirici yıkar uzakta olduğu, polimer bağlarının kopmasına sebep UV ışığına maruz bırakılmıştır karşı. Hemen görüntü görüntülendikten sonra, maruz kalmayan fotodirenç üzerinde çalışırken geliştirici durdurmak için DI su filmi batırın.
    13. Kuru azot gazı ile kuru filmler üfleyin.
    14. Fotoğrafı "sert fırında" için 15 dakika boyunca 120 ° C'de bir fırın içine yerleştirin filmlerkarşı.
    15. Filmleri serin sonra fotodirenç tarafından korunmayan metal kapalı kalkana kadar, bir dağlama çözeltisi koyun. Su Dip aşındırma durdurmak için.
    16. Sertleştirilmiş photoresist'i çıkarmak için aseton ile durulayın.
    17. Metanol ile durulayın ve kuru azot ile kuru darbe.
    18. Kaplamalı camlar hazır olduğunuzda, gözlük, protein alaşım filmler elde etmek için en az 12 saat boyunca onları cam yüzeylere farklı bir protein alaşım çözümler bırakın ve kurutun. (İlk kalın proteini alaşım filmler elde etmek için ağırlık itibariyle% 5 konsantre alaşım çözüm önerilmektedir.)
    19. Hidrofobik-hidrofilik etkileşimler, ince metal filmi filmler 51 yüzeyleri bağlı protein, alaşım için cam yüzeylerden aktarılacaktır. Forseps kullanarak cam taban ince metal desenleri ile protein alaşım filmleri soyulabilir.
    20. Aw ile 60 ° C'de vakumlu bir fırında (25 kPa) içine kuru filmler yer, çözünmeyen bir protein elde etmek için alaşımlar, bölmenin alt ater yemek. Fırında havayı Pompa, ve en az 2 saat boyunca su buharları tavlama örnekleri sağlar. Yapılan vakum uygulaması durdurulur ve forseps kullanılarak substrattan suda çözünür olmayan, film soyulabilir.
    21. Gibi elektriksel direnç gibi protein alaşım filmlerde metal kalıplarının elektrik nitelikleri test ve camına orijinal desen bunları karşılaştırmak.
  4. Protein Alaşımlarında tarafından İlaç Malzemelerin İmalatı
    1. Adım 3.2 'de tarif edildiği gibi farmasötik bileşikler ile bir protein alaşım filmler imal etmek için, ilk olarak bir alt-tabakanın hazırlanması PDMS. Damıtılmış su ile oluşturulan tabakayı PDMS temizleyin.
    2. Çözülen ya da bir sulu çözelti içine, farmasötik bileşikler içinde dağıtılır. Homojen su ile farmasötik bileşikleri karıştırmak için ultrasondan veya girdap kullanın. Bileşikler, suda çözünür değilse, iyon içermeyen damıtılmış su içinde homojen bir şekilde dağılır tozlar dağıtılır.
    3. İstediğiniz kütle oranını hesaplamakBileşik çözeltisi bileşiği çözeltisi x ağırlık yüzdesinin hacim: ile protein alaşımlarına bileşiklerin bileşik çözeltisinin protein çözeltisi alaşım x ağırlık yüzdesi hacimle (burada ağırlıkça% 1 çözelti alaşım kullanılmıştır). Protein alaşım filmde İstenen bileşik yoğunluğu sahip bir film elde etmek üzere bir oranını seçin.
    4. Yavaşça bölüm 2 işleminde 2.16 aynı yönergeleri izleyerek protein alaşım çözeltisi ile bileşik çözüm karıştırmak. (Not: jelleşmeyı önlemek için, ultrasonicate veya karıştırma sırasında çözüm vorteks yok).
    5. PDMS substrat üzerine karışımın hesaplanan hacim dökün ve farmasötik bileşiklerin bir dizayn oranını ihtiva eden bir protein, bir alaşım elde etmek filme, bir kimyasal başlığı içinde en az 12 saat kurutulur.
    6. Fiziksel Kısım 3.2 süreçte 3.2.8 de aynı talimatı aşağıdaki filmi çapraz bağlanabilir. Düşük bir yoğunluklu (LD) veya yüksek (HD) yoğunluk modeli çözünmeyen ilaçlarla alaşım filmlerin bir örneği Şekil 4'te görülebilir

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

(Protein A ve B arasında, protein, örneğin) Tipik protein-protein etkileşimleri şarj yükü (elektrostatik) konumlar, hidrojen bağlama oluşumu, hidrofobik-hidrofilik etkileşimler, dipol olarak, çözücü, bir karşı iyonu, ve belirli etkiler arasında entropik içerebilir Her iki protein alanları (Şekil 2) 3. Bu nedenle, temelde, biz hesaplama simülasyonları ile bu etkileşimlerin etkilerini tahmin edebilirsiniz.

Şekil 2
Şekil protein A ve protein B arasında 2. Etkileşimleri Tipik haliyle, bu etkileşimler şarj şarj (elektrostatik) konumlar, hidrojen bağı oluşumu ya da bu iki proteinin belirli alanlar arasındaki hidrofobik-hidrofilik etkileşimlere dayanabilir.

Protein alaşımlıSistem bu alt alaşımların Her kararlı olduğu düşünülmektedir çapraz bağlanmış protein alt alaşımlı etki, oluşan bir malzeme olarak modellenebilir. Proteinler (A ve B) arasındaki etkileşimleri farklı sertlikte tahvil olarak kabul edilebilir (bu çalışma için, biz Şekil 3'te zayıf ya da kuvvetli bağların sadece iki tür düşünün). Zayıf bağlar, Şekil 2'de tarif hidrojen bağları ve diğer bağları temsil edebilir. Protein alaşımı bir bütün hem güçlü hem de zayıf bağlar ile birlikte sınırlı sayıda alt alaşımları arasında çift çapraz bağlantılar yoluyla oluşturulduğu gibi. Alt alaşımlar güçlü bağlar kullanarak oluşturulur ve alt alaşımı olan, daha zayıf bağlarının oluşumunu sağlar. Bir bütün olarak, protein alaşımlı çeşitli güçlü ve zayıf bağlar ile birbirine bağlanmış bir çok alt-alaşımları arasında çift çapraz bağlantılar yoluyla oluşturulur. Sistem yeterince stresli olduğunda, zayıf ve güçlü hem de bağlar yırtılır. Doğru koşullar altında, zayıf bağlar için izin verilirTekrar bağlantıları reform. Bununla birlikte, daha güçlü bağlar geri dönüşümsüz kopacaktır. Zayıf bağlar varlığı dış stres 36-41 altında yapısal bütünlüğünü korumak için alaşım-proteini sağlar. Bu sayısal simülasyon kafes-yay modeli 36-41 ile sonlu elemanlar metodu dayalı aşağıdan yukarıya yaklaşımı ile geliştirilen matematiksel bir model kullanır.

Şekil 3,
Şekil 3. Sayısal simülasyon uzanan Simülasyon sırasında. Germe sırasında bir protein alaşım sisteminin, mekanik bir avantaj göstermek için protein (mavi renk) bir tip malzemeler için süper elastikiyet veren yay gibi elastik bir ağ oluşturacak başka bir tipi ise Protein (yeşil) malzeme ağı stabilize edilmesi için güçlü bir fiziksel çapraz bağlayıcı sağlayabilir. Dinamik şekillictural geçişler (örneğin, hidrojen bağ oluşumları ve deformasyonlar) depolamak ve enerjiyi serbest veya germe sırasında ek mekanik destek sağlamak için farklı alanlarda kaynaklı olabilir.

Şekil 3, germe sırasında (protein A ve protein B gibi evcil dut ipek gibi yabani tussah ipek) bir protein alaşım sisteminin, mekanik özellikleri tipik bir hesaplama simülasyonunu gösterir. Protein (yeşil renkte) bir başka tip malzeme ağı için güçlü bir fiziksel çapraz bağlayıcılar olan parçacıklar olarak hizmet edebilmekte iken, germe Simülasyon sırasında protein (mavi renk) bir tip malzemeler için süper elastikiyet sağlayan yaylar ile elastik bir ağ oluşturabilir. Dinamik yapısal geçişler (örneğin, hidrojen bağı oluşumu ve deformasyon) depolamak ve enerjiyi serbest veya streç sırasında ek mekanik destek sağlamak için farklı alanlarda teşvik edilebilir. Simülasyon çalışmaları verinsa genel teorik resim proteinlerin yararlı çiftleri gibi olağanüstü mekanik elastikiyet gibi güçlü etkileşimler ve spesifik özellikleri, protein alaşımlı malzeme üretmek için aldı edilebildiği gibi farklı yapısal protein molekülleri arasındaki etkileşimleri anlamak için.

Protein A ve B (burada yabani ipek ve evcil ipek) seçilmesinden sonra Genel olarak, bir protein çözeltisi alaşım birkaç adımda (Şekil 4) olarak üretilebilir. İlk olarak, doğal elyaflar ya da tozlar gibi protein kaynakları temizlenmeli veya arındırılmalıdır. Örneğin, bir gam giderme işlemi çok ipek fibroin lifler 20 üzerine kaplanmış proteinleri Serisin ipek çözünür çıkarmak için kullanılabilir. İkinci olarak, uygun bir çözücü çözümler çözünmeyen protein kaynakları olarak eridiği gerekir. Örneğin, yüksek yoğunluklu LiBr solüsyonu farklı ipek, beta-plakalı ikincil yapıları parçalayarak çözümler elyafların erimesi için iyi bir çözücüdür.Üçüncü olarak, bir diyaliz yöntemi, bir sulu çözelti içinde protein moleküllerini çözülmesi çözücünün ayrılması ve kurtarmak için kullanılabilir. Ek santrifüj çözelti içindeki yabancı maddeler ve çözünmeyen birikimlerin çıkması için gerekli olabilir. Son olarak, farklı proteini sulu çözeltiler çeşitli oranlarda ile hafifçe bir arada karıştırılabilir. Iki protein çözüm makrofaz ayırma yok, bu nedenle, bu sayelerinde harmanlanır ve farklı biyomedikal uygulamalar için yeni bir protein alaşım sistemi oluşturmak olacaktır. Vücutta protein alaşımlar çözünmeyen hale getirmek için, farklı fiziksel veya kimyasal çapraz bağlama işlemler uyarlanabilir. Örneğin, yüksek sıcaklık ve yüksek basınçlı su buharı tavlama olabilir derece çapraz bağlanma ya da farklı ipek, elastin malzeme 6,52 olduğu bulunmuştur. Farklı malzemeler, keratin protein yan zincirlerinde 53 içinde, doğal, disülfid bağları ile çapraz bağlanabilir çıkarabilirler.

P kezrotein alaşım çözeltiler üretilir ve kontrol edilmektedir, bunlar, termal, mekanik, optik, elektrik, kimyasal veya biyomedikal uygulama (Şekil 4) da dahil olmak üzere malzemeden kalıpların ayarlanabilir özelliklere sahip biyomalzeme geniş bir yelpazede halinde oluşturulabilmektedir. Bu makalede, bu malzemeler için üç yeni gelişen uygulamalar protein alaşım biyomateryallerin benzersiz bir avantaj (Şekil 4) seçilmiştir göstermek için. Modern mikro-fabrikasyon teknikleri sayesinde, farklı yüzey desenleri proteini alaşımlı malzemelerin mikro ya da nano-terazi (Şekil 4 optik uygulama) de oluşturulabilir. Bir optik kırınım paterni film yüzeyinde üretilir, örneğin, bu film, farklı optik desen 22,23 içine lazer ışınlarını aktarmak için bir ortam olarak kullanılabilir. Protein alaşım malzemesi bir enzim çözeltisi içinde ortaya ise, filmlerin degradasyon profili filmden gerçek zamanlı sapması modelini karşılaştırmanın anlaşılabilirorijinal desen (yerine ileri ve geri yıkanması ve hava bozulmuş filmleri inceleyerek) ile. Bir başka gelişmekte olan bir tekniktir kat farklı mikro ölçekli devreler ve protein alaşımlı malzemelerin (Şekil 4 elektrik uygulama) kablosuz rezonatörlerin etmektir. Kablosuz sinyalleri doğrudan doktor 24,51 transfer edilir, bu teknik sayesinde, in vivo olarak hasar gören doku veya organlarda mikro akımlar, izlenebilir. Ve vücut içinde malzeme mekanik dayanıklılık ve biodurability kolayca yayılır oranlarının ve kullanılan malzemelerin spesifik protein bileşenleri tarafından kontrol edilebilir. Son olarak, farklı çözünür ya da çözünmez kanser ilaçları, doğrudan protein alaşımlı malzeme (Şekil 4 kimyasal uygulama) içine dahil edilebilir. Kanser ilaçları genellikle çok toksik olan ve kanser hücrelerini değil, aynı zamanda normal insan bağışıklık sistemini değil, sadece zarar verir. Bu nedenle bölge ve gövdesi için günde kanser ilaç uygulama dozu kontrol t biridiro ilaç biliminde en önemli konular. Protein alaşım malzemelerine kanser ilaçları içeren sayesinde, sadece kanser dokular ya da organlar malzemesi aşılamak için ve protein bileşenlerini kontrol etmek ve karışım oranları ile protein alaşım ağ günde kanser ilacın serbest bırakılma oranını kontrol eder. Protein matriks tamamen biyolojik olarak bozunur olduğu için, protein alaşımlar otomatik olarak ilacın serbest bir süre sonra vücut enzimleri ile kaldırılır. Protein alaşımlı malzeme kalıntıları, doğal olarak sadece daha fazla in vivo olarak diğer gerekli proteinleri üretmek üzere vücut tarafından absorbe edilebilir amino asit vardır. İmplante edilmiş Protein alaşım malzemelerden kanser ilaçlarının kontrollü olarak verilmesi ile tedavi olsun hastalar en sonunda vücut içinde katkı maddesi olmadan geri edecek ve proteinin doğal alaşım matrisler, kanser ilaçları, bu da etkili bir şekilde kürleme işlemi sırasında vücut içinde emilir.

"Şekil , Bir protein sulu çözeltiden çözünmesi solventi çıkarmak için dianalysizing, solüsyonlar çözülebilen bir protein maddeleri eritilerek santrifüj ve değişik oranlarda karıştırılarak bir temizlik de dahil olmak üzere veya protein malzeme kaynaklarını saflaştırılması bir protein alaşım malzemenin üretilmesi için Şekil 4. Genel adımlar ve fiziksel veya kimyasal çapraz tedaviler. proteini alaşım solüsyon daha sonra termal, mekanik, optik, elektrik, kimyasal veya biyomedikal uygulamalar için malzeme matrisler olmak üzere ayarlanabilir özelliklere sahip biyomalzeme geniş bir aralığı içine oluşturulabilir. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın.

Burada, biz prote üzerinde elektrik malzemeleri imal nasıl kritik prosedürleri gösterdiŞekil 5'te ayrıntıları ile alaşımları. örneğin elektrik devrelerindeki gibi ince metal filmler buharlaştırma, darbeli lazer birikimi, veya püskürtme dahil olmak üzere birçok farklı biriktirme teknikler kullanılarak oluşturulabilir. Bu gaz basıncı ve katot boyutu ayarı ile katot olarak yerleştirme muntazamlığı uygulanan gaz basıncı püskürtme ve gücün düzenlenmesi yoluyla püskürtülen türlerin enerji için önemli esneklik sunduğu için, püskürtme, mevcut çalışma için seçilmiştir. Püskürtme biriktirme ile bir cam substrat (Şekil 5A) üzerine Metalik bir film yansıtmak için kullanılabilir. Bu durumda, Ag, devre filmler, yaklaşık 1 x 10 -7 Torr bir basınç taban yüksek bir vakum odasına çökelmiştir. Ar, püskürtme gazı 20 mTorr basıncında bölmeye ilave edildi ve Ag, alt katman yüzeyinde 8 cm, 2-inçlik düzlemsel bir manyetik katottan 20 dakika boyunca 100 W bir RF jeneratörü kullanılarak biriktirilmiştir. Cihazlar def vardırmuhafaza etmiştir ıslak kimyasal aşındırma cama filmler yaygın bir fotolitografik teknikler kullanılarak (Şekil 5A'da ayrıntılı bir prosedür bakınız). Cihazlar, doğrudan protein filmleri üzerine fiziksel bir maske ile çöktürme sayesinde tanımlanabilir. Protein filmlerinin üzerinde yer alan elektrik devrelerinin oda sıcaklığı elektrik direnci her iki ucu ve dört bağlantı teknikleri kullanılarak ölçüldü. Dört terminal yaklaşımın avantajı ölçümünden temas direncini ortadan kaldırmak için ama biz temas direnci böylece iki uç ölçüm yeterlidir önemli olmadığını bulmak. Uç taraftaki iki ölçüm metal telin her iki ucunda (şematik olarak Şekil 5B'de gösterilmiştir) bir film ile ohm ölçek yapma teması ayarlanmış iyi kaliteli multimetre kullanır. Bu ölçümde, multimetre bir akım kaynağı ve bir voltmetre ve ölçülen direnç de akımına bölünmesi voltajı olarak hizmet vermektedir. Direnç kullanılarak hesaplanırρ = R, direnç RA / L, bir telin enine kesit alanı, l problar arasındaki mesafedir. Burada oluşturulan için, R (burada R = ΔVoltage / ΔCurrent), l 4.45 x 10 m -2 Şekil 5B'de akım-gerilim eğrisinin eğimi ile 23,5 Ω olduğu ölçüldü ve A, 6.685 x 10 olduğu bulunmuştur -10 m 2. Bu sayıları kullanarak, 3,6 x 10 -7 Ω · m direnci toplu gümüş metal (1.6 x 10 -8 Ω · m) için daha yaklaşık 20x daha büyük filmler için bulundu. Dökme filmler ile karşılaştırıldığında, ölçülen bir yüksek direnç nedeniyle zaten kısıtlı akım yolu ve hatalarından kaçınmak üzere, yük taşıyıcıların yetersizlik tipiktir. Bir ısı tabancası ile metal ısıtma metalik iletim karakteristik fononların tarafından elektron saçılma oranında bir artış gösteren direnişini yükseltmiş.

"Şekil Şekil 5. (A) Prosedür protein alaşım filmler (yabani tussah ipek ve bir örnek olarak dut ipek karışımı filmlerde burada gümüş devreleri) elektrikli devreler yapmak için: (a) Kaplanmamış mikroskop lamı; (B) 2 ayak çapında hedeften püskürtmeyle çökeltilmesi sırasında gümüş plazmadan izole edilmesi; (C) gümüş kaplı bir cam slayt; (D) fotorezist eklemeden önce vakum mandreli ile döner parçaya gerçekleştirilen gümüş kaplanmış numune; (E) fotorezist ile kaplanmış gümüş slayt 120 ° C de yumuşak fırında fırın için konulmuştur; (F) ışığa polimer bağları kırmak için UV ışınına maruz kalmaktadır (G) photoresist'i geliştirin; (H) Sabit fırında asit içinde aşındırma hazırlanmak için direniyor; (I), bir su banyosu içinde durulanması ile bir iz durdurun asit Etch; (J) slayt kurulayın; (K) slayt üzerine Oyuncular protein alaşımlı çözüm; (L) kurutulan protein, gümüş filme Aktarım kalıpları. (B) ' -7 Ω, etrafında ölçülür. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. Termal analiz modeli harmanlanmış bir protein sistemi karışabilirliği doğrulamak için kullanılır., Protein A ve B ayrı ayrı tek bir cam geçiş sıcaklığı, T g, sırası ile (A) ve T g, (B) (yeşil ve mavi eğrileri) tamamen karışabilir, varsa Protein alaşım sistemi A ve B (kırmızı eğri) T g s farklı sadece bir bardak geçiş gösterecektir. Aksi takdirde, proteinins karışmayan kaydırılmış T g (A) ve T g (B) (siyah eğri) ya da iki yarı-karışabilen kompozitlerin karışımlar cam geçişleri (turuncu eğrisi) bulunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

"Alaşım" Protein sisteminin üretiminde en kritik prosedürlerin biri harmanlanmış proteinlerin karışabilirliği doğrulanmasıdır. Aksi takdirde, kararlı ve ayarlanabilir özellikleri olmayan, ancak, bir karışmayan bir protein ya da protein karışımı, bileşik sistemidir. Deneysel termal analiz yöntemi, bu amaç için kullanılabilir ve bunların alaşım özelliklerini teyit etmek için. Protein-protein etkileşimleri Flory-Huggins en kafes "çözücü" (protein bileşeninin baskın) arasındaki etkileşim ile model 48 ve "çözünen" (minör protein bileşeni) göre görüntülenebilir. Bu modele göre, "çözücü" ve "çözünen" arasında karıştırma esnasında serbest enerji değişimi harmanın 48 karışabilirliğinin yönetir. Genel olarak, bir karışırlık gösteren üç farklı dereceleri vardır: (a) tamamen karışabilir (makroskopik şekilde tek fazlı bir malzeme), (b) yarı dengeli (formunda yarı-karışabilen bir malzeme faz), ve (c) karışmayan (bireysel protein A ve B alanları) 3,48 ile orijinal iki evrelerini kalır. Buna uygun olarak, bu farklılıklar göstermektedir ve ideal olarak bir iki protein sistemin cam geçiş davranışları, bir faz diyagramı modeli (Şekil 6) ile ifade edilebilir. Protein A ve B, bağımsız tek bir cam geçiş sıcaklığı, T g, (A) ve T g (B), sırası ile (Şekil 6, yeşil ve mavi eğri) varsa, örneğin, tamamen karışabilir, berrak bir protein alaşım sistemi tek bir cam geçiş göstermelidir ısıtma esnasında. Bu tek bir cam geçiş Tg ait A ve B (Şekil 6) arasında, normal olarak bir ara maddedir. Aksi takdirde, proteinler karışmayan bir noktayı teşkil edebilir, burada Tg hem (A), ve T g (B) kendi orijinal pozisyonlarına (Şekil 6) görünür. Proteinler, ayrıca yarı-karışabilen iki ile gösterilen sistemin cam tran kaydırılır oluşturabilmektedirkonumlarına (Şekil 6). Tamamen karışabilir, berrak bir protein "alaşım" sistemi (bir şekilde bir cam geçiş) bir uygulama örneği, Şekil 4 (termal uygulaması) 9 ipek-tropoelastin karışımı numunelerin DSC taramalarından bulunabilir. Ipek muhteviyatının azaltılması ile birlikte, harmanların cam geçiş sıcaklıkları (Tg) 190 ° C (saf tropoelastin) 9 178 ° C (saf ipek) giderek artmıştır, ancak sürekli olarak her türü için, homojen tek bir cam geçiş tutmak karıştırır. Flory-Huggins modeline göre, bu çeşitli karıştırma oranlarındaki her ipek tropoelastin karışımları olarak stabil olan ve tam olarak herhangi bir makrofaz ayrışmalar karışabilen proteini alaşım olduğunu gösterir.

Sonuç olarak, protein, alaşım malzemelerin yeni nesil elde edilebilir ve kontrollü ve ton farklı tıbbi cihazlar (örneğin, filmler, dikişler, vidalar, levhalar, mikro-iğne, jeller), üretildiklerible, optik, elektrik, kimyasal, termal ve mekanik özellikleri. Karıştırma bileşenleri ve oranları, bu esneklik, mukavemet, yüzey pürüzlülüğü, yüzey yükü, biodurability kimyasal aktivitesi gibi protein alaşımlı malzemelerin çeşitli biyofiziksel özelliklerini kontrol ederek, sonuçta lokal hücresel hem de doku fonksiyonlarını etkileyebilir ki, manipüle edilebilir Bu malzemelerle ilgili davranışları. Buna ek olarak, in vivo olarak proteinlerin programlanabilir ömrü doğasına bağlı olarak, bu alaşım malzemeler için uygun bir platform olur. Bu tür avantajlar sonrası onarım cerrahi alma önlenebilir gelecekte implante edilebilir tıbbi cihazlar için yeni seçenekler sağlayabilir. Bu protein alaşım biyomalzemeler de ayarlanabilir biyolojik fonksiyonları ve özellikleri ile, ve doku uyumu ve ilgili gereksinimleri ile eşleşen tıbbi cihazlar üretmek için yeni bir yol sunacak. Bu makalede, bu cihazları imal ve nasıl genel bir protokol inceleme sağlarBirden fazla biyomedikal alanlarında hem de bilim adamlarını ve klinik doktorları yararlanacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar bu araştırma desteği için Rowan University teşekkür ederim. Tufts Üniversitesi'nde XH ayrıca teşekkür Dr David L. Kaplan ve önceki teknik eğitimler için NIH P41 Doku Mühendisliği Kaynak Merkezi (TERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC) TA Instruments, New Castle, DE, USA
N/A You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity.
SS30T Vacuum Sputtering System  T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA N/A With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat.
VWR 1415M Vacuum Oven VWR International, Bridgeport, NJ, USA N/A You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
  2. Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
  3. Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
  4. Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
  5. Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
  6. Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
  7. Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
  8. Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
  9. Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
  10. Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
  11. Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
  12. Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
  14. Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
  15. Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
  16. Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
  17. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  18. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
  19. Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003 (2012).
  20. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
  21. Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
  22. Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
  23. Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  24. Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
  25. Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
  26. Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
  27. Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
  28. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
  29. Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
  30. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
  31. Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
  32. Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
  33. Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
  34. Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130 (2013).
  35. Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
  36. Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
  37. Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101 (2004).
  38. Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
  39. Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901 (2011).
  40. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  41. Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
  42. Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
  43. Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
  44. Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).
  45. Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  46. Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
  47. Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
  48. Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
  49. Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
  50. Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
  51. Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
  52. Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
  53. Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics