Nodülasyona ve Baklagil Bitki Büyüme için tek-bitki, Steril Mikrokozmoslar * These authors contributed equally

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Standart laboratuvar plakalardan yapılmış bireysel, steril mikrokosmlarından yılında azot bağlayıcı bakteriler Sinorhizobium meliloti ile simbiyoz Medicago truncatula bitkilerin büyüme ödün vermeden, sterilite kök sistemleri ve nodüller sık muayene izin verir. Bitkiler kadar 9 hafta boyunca bu büyüme odalarına korunabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jones, K. M., Mendis, H. C., Queiroux, C. Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti . J. Vis. Exp. (80), e50916, doi:10.3791/50916 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rhizobial bakteriler uyumlu ana baklagil bitkilerin kökleri üzerinde simbiyotik azot sabitleme nodül oluşturur. Bu etkileşimleri çalışmak için en iyi gelişmiş bir model sistemleri Medicago cv truncatula bitkidir. Jemalong A17 ve rhizobial bakteri Sinorhizobium meliloti 1021. Bitki kökleri ve simbiyotik fenotipleri puanlama tekrarlanan görüntüleme bitki veya bakteri birine tahribatsız yöntemleri gerektirir. Bazı bitki ve bakteriyel mutantlann simbiyotik fenotipleri büyüme göreceli olarak kısa bir süre sonra belirgin hale gelir ve ana / symbiont etkileşiminin uzun süreli takip gerektirmez. Bu atılır Ancak, önce nodülasyon sürecinin erken aşamalarında belirgin değildir simbiyotik verim ve nodül yaşlanma fenotipleri ince farkları nispeten uzun bir büyüme dönemleri gerektirmektedir. Çeşitli yöntemler, uzun vadeli büyüme ve bu ana / symbiont çiftinin gözlem için geliştirilmiştir.Ancak, bu yöntemleri birçok diğer mikroplar tarafından bulaşma olasılığını arttırır tekrarlanan sulama gerektirir. Diğer yöntemler bitkilerin çok sayıda büyüme için nispeten büyük bir alan gerektirir. Bir yöntem olup, burada M. simbiyotik büyüme tarif truncatula / S. steril, tek bitki microcosms in meliloti, birçok avantajı vardır. Bu mikrokosmlarından Bitkiler bu sulama sulama sırasında çapraz bulaşmayı önlemede kadar 9 hafta boyunca gerekli değildir sağlamak için yeterli nem ve besin var. Bu fenotipleri Bu nodül gelişimi ve erken nodül yaşlanmasında ince gecikmeler gibi kısa-vadeli büyüme sistemleri, kaçırmış olabileceğini sayısal sağlar. Up-köklenme gözlem için bitkilerin gerekli değildir bu yüzden de, insan olarak kökleri ve nodüller kolayca, levha kapak aracılığıyla izlenir.

Introduction

Baklagil konak bitki Medicago truncatula A17 ve Sinorhizobium 1021 meliloti rhizobial bakteri arasında etkileşim kök nodül gelişimi ve azot sabitleme ortak yaşam çalışma için en uysal bir model sistemlerinden biridir. Her iki simbiyotik ortakların genomları 1,2 dizilendi ve bitki ve bakteri hem genetik manipülasyon 3,4 mükellef bulunmaktadır. Bitki ve bakteri mutantlar hem fenotipleri Analizi nodül gelişme aşamalarını gözlemlemek ve zamanla simbiyotik verimliliğini ölçmek için yeteneği gerektirir. Burada M. kök nodül gelişme gözlem için bir yöntem tarif cv truncatula. S ile aşılandı Jemalong A17 standart, yuvarlak 100 mm çapında, 15 mm derinliğinde laboratuar plakaları (Şekil 1A) yapılan bireysel mikrokosmlarından içinde meliloti 1021. Sürgün plakanın tarafında çentikli bir portal (aracılığıyla maruz ve büyür Figüres 1B, 1C ve 1 E). Kökler microcosms içinde bulunan ve plaka (Şekil 1D) ve kapak boyunca gözlem izin verirken, steril tutulur. Sürgün erişilebilir olduğu için, büyüme kısıtlı değildir ve bu kök sterilitesini ödün vermeden periyodik aralıklarla ölçülebilir. Çentikli plaka Mikrokozmoslar oluşturma yöntem aslında yonca büyüyen bitkiler için Leigh, vd. 5 tarafından geliştirilen, ancak yaygın olarak diğer yöntemlere göre birçok avantajları rağmen kabul edilmedi. Bu yöntemin bir varyasyonu, aynı zamanda bitki köklerine ve mikorhizalların 6 arasındaki etkileşimin analizi için geliştirilmiştir. Şimdi M. büyümesi için uyarlanmış ve bu yöntemi optimize truncatula bitkiler. Daha yaygın olarak kullanılan yöntemlere göre bu protokol avantajları aşağıda tarif edilmektedir.

M. nodülasyon çalışmalar için geniş şu anda kullanımda olan birkaç yöntem vardır truncatula inocuS. ile lated meliloti 7. Nodulated köklerin büyük ölçekli hazırlanması için en yaygın olarak kullanılan yöntem aeroponic kesonların 7 de büyüme. Bu yöntemde, bitki büyük bir kap üzerine asılır ve kökleri S. oluşan bir karışım ile havalandınlır meliloti ve besleyici çözelti 7. Bu yöntem pratik ise S. tek bir genotip meliloti, test edilecek olan. Bu bakterilerin yüksek konsantrasyonlarda aerosol haline gerektirdiğinden, farklı bakteri türleri ile aşılanmış kesonlar arasında çapraz kontaminasyon yüksek bir olasılıktır. Genellikle aşılanmış bitkilerin büyük miktarlarını hazırlamak için kullanılan diğer bir yöntem küvet veya perlit, vermikülit, kum veya besleyici çözelti ile aşılanmış ve S ile aşılanır kalsine kil tencere büyüme meliloti 7. Bu yöntem, açık tüplerde veya tencere kullanımını gerektirir, ve besin çözeltisi sulama ve ikmal gerektirir. Tencere bir diğer dezavantajı olduğu bitkikökler ve nodüllerin incelenmesi için bu parçacık matris çıkarılmalıdır. Bu yöntemin diğer bir sakıncası olduğunda pek çok farklı S. kuluçka alanı geniş bir alan gerekli olmasıdır meliloti genotip ayrı bir kap her bir bakteri genotip için kullanılmalıdır, çünkü karşılaştırılabilir vardır. "Leonard kavanoz" Bu yöntem, 8,9 üzerinde bir çeşididir. A Leonard kavanoz diğerinin üstüne yığıldığında ve bir fitil birbirine bağlanan iki steril kapların oluşmaktadır. Büyüme ortamı, alt kabına yerleştirilir ve perlit, vermikülit, kum ya da üst tekne içinde kalsine kil büyüme matris içine kılcal hareket ile lamba fitili üzerinden çekilmektedir. Fide (ler) büyüme matris içine yerleştirilmiş ve S ile aşılanmıştır meliloti. Bu yöntem, sulama gerektirmez, fakat kök ve nodüllerin inceleme fide parçacık büyüme matris kaldırılması gerekir.

Roo kolay muayene izin vermeyiz birkaç yöntem vardırts. Bunlardan biri, saydam plastik "büyüme poşet" 7'dir. Bu yöntemin bir dezavantajı, sık sulama sıvı ortam M. büyüme için uygun olan tek ≤ 10 ml Başlangıcı gerekli olmasıdır torbalar 7'de truncatula. Kese deneyler genellikle nedeniyle torba içindeki kağıt fitilin arıza, ~ 2 hafta 7 ile sınırlıdır. Yaygın olarak kullanılan diğer iki yöntem bitki agarı üzerinde büyümüş ve kökleri görebilir olduğu bizim yönteme benzer, ancak bu yöntemler aynı zamanda işlemdir önler dezavantajları vardır. Bu yöntemlerde, bitkiler tamamen 24.5 cm gözenekli bir ameliyat bandı ile üst çevresinde kapatılmış veya pamuk tıpalı ya da plastik kapaklar 7-tıpalı agar eğik tüpler içinde yetiştirilen x 24.5 cm agar plakaları içinde yer alır. Bu yöntemlerin her ikisi de köklerin kolayca incelenmesine olanak ve steril tutulabilir. Ancak, agar eğimli tüpleri genellikle orta 7 ağar sadece 20 ml ile yetiştirilen ve sulama ve besin a gerektirirBitkilerin uzun-vadeli büyüme için ddition. 24.5 cm içinde yetiştirilen bitkiler 24,5 cm agar mikrokozmosları yeterli nemi ve uzun vadeli büyüme için besin var, ama büyüyen sürgün hızla kapalı plaka evren ve etilen gazı Nodülasyona 7 inhibe kurabilirsiniz içinde kısıtlı olur x. Burada tarif edilen prosedür olarak, sürgün maruz kalır ve uzun süreli büyüme sağlayan, ~ 70 ml ortam içeren evren dışına serbestçe büyür.

Burada tarif edilen prosedür baklagil bitkileri nodülasyon çalışma için değil, aynı zamanda, diğer orta boy bitkilerin kök fenotiplerinin incelenmesi için de yararlı olabilir. Bu microcosms ve geleneksel bir polikarbonat bitki dokusu kültürü kavanoz arasındaki fark, burada tarif edilen plaka microcosms kökleri aşağı kavanozun altındaki agar yatay bir tabaka halinde agar dikey yüzeyi üzerinde büyümeye yerine olmasıdır. Bu kök minimal d agar yüzeyinden kaldırılması sağlar:kök tüyleri ve mikroskopi ile kök tüyleri incelenmesini kolaylaştıran kök yüzeyine, agar minimal yapışmasına Amage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Adımların gerçekleştirilmesi 1, 2, 4, ve steril bir laminar akış başlığı içinde 6 önerilir.

1.. M. hazırlanması truncatula A17 Fideler

Not: M. Bu çalışmalarda kullanılan truncatula A17 tohumlar 22 ° C ° 'de veya ~ 150-400 mmol / m-2 s -1 ışık ile 22-26 ° C de muhafaza edilen bir bitki büyüme odasında soğutuldu, sera koşulları altında üretilmektedir.

  1. Tohum çimlenme plakaları dökün: 100 mm kare plakaları (derinlik 15 mm) kullanın ve 3-5 mm derinliğe kadar 10 ağar arıtılmış w / v otoklava 1.1-1.2% dökün. Her bir plaka (63-125 tohum / plaka eşdeğeri) tohum ~ 0,25-0,5 g çimlenmeye kullanılacaktır.
    Not: Bu protokolde tarif edilen tüm levhalar için bitki hücre kültür içinde test edilmiş, arıtılmış, agar kullanımı için çok önemlidir. Agar için satıcı ve katalog numarası bilgileri özel reaktifler ve ekipman Tablo listelenir.
  2. Kanatın / M. sterilize truncatula A17 tohums: fidan istenilen sayıda için yeterli tohum tartılır. (, Bu ~ 63-125 tohumu 0,25-0,5 g tohum / şişe) ve pipet konsantre edildi (% 96) 20 ml steril folyo kapakları ile steril 125 ml şişelere yer tohumları (M. A17 tohumları, ~ 4 mg olan truncatula) H 2 SO şişenin yanları boyunca 4.
    Not: Asit scarification tohum sterilize edecek. Aynı zamanda, şişenin yanları boyunca asit pipetleme, bu sterilize edilmemiş tohumları ile temas halinde olan şişenin içine yeniden sterilize olacaktır.
  3. Steril bir cam pipet ile tohum öbekler kırmak. 10-12 dakika boyunca sık sık, her şişe döndürülür. Küçük, kahverengi çukurları tohumlar üzerinde görünür hale gelecektir. Bu tohum kat 11 küçük delikler vardır.
    Not: SO 4 konsantre H 2 ile çalışırken koruyucu gözlük ve eldiven giyin.
  4. SO 4 H 2 çıkarın ve tohum durulama: tohumların en az% 10, küçük kahverengi çukurları ya da 12 dk olduğunda geçti, hangisiilk olarak söz konusu olduğunda, steril bir cam pipet ile şişelerden ALL asiti çıkarmak. (En az 300 ml musluk suyu ihtiva eden bir 1-2 L behere yer atık asit elde edildi. Bu seyreltik asit ve aşırı ısınmayı önler. Doyurmaya) şişenin eğrisinde kalan asidi toplamak için şişeyi yatırın ve küçük bir cam pipet için kullanımı Tüm geri kalan asidi çıkarmak. Kalan asit kalırsa, bu, durulama su ile reaksiyona tohumları ısıtmak ve onları öldürecek.
    1. Hızlı bir şekilde her şişeye steril aşırı saf su ve 100 ml dökülerek tohum durulayın. Suyun fazla hacmi seyreltik asit ve su ile asidin reaksiyonu esnasında aşırı ısınma ve tohum zarar görmesini engeller. Su dökün ve şişenin dudak alev sterilize edin.
    2. Steril aşırı saf 50 ml su ile tohum 8-10x durulayın. Her durulama sırasında şişeyi girdap. Şişe bu noktada steril olduğu kabul edilmelidir ve şişenin her bir dudak durulama önce yakılmış olmalıdır.
  5. Tohumlar gecede öğrenmek edelim: Mesaison durulama, gece boyunca karanlıkta 4 ° C de, her bir kaba ve bir yere steril folyo kapağı yerine, her bir şişeye 50 ml steril saf su dökün.
  6. Çimlenme tabakta Yeri tohumları: icar tohumları gecede öğrenmek sonra, tohum tekrar süspansiyon ve bir 1.1-1.2% agar çimlenme plaka üzerine dökmek için 20 ml steril saf su, girdap eklemek sonra, ~ 25 ml saf su ile 2x yıkayın, suyu dökün 1.1 adım. Tohum şişe içinde kalır, daha fazla su ilave edin ve tekrar dökün. Her bir şişeden bir plaka (63-125 tohum / plaka) için tohum dağıtın.
    1. Tohum dağıtmak için plaka çalkalanır. Tohumlar, plakanın bir ucunda bir 4-5 cm bandında eşit dağıtılmalıdır. Bu plakanın "üst" olacaktır. "Alt", 5-6 cm (Şekil 2A) Tohumların serbest tutulmalıdır.
    2. Steril bir pipet ile suyu çizin. Plakanın altına kalan su tahliye etmek için bir 45 ° açıyla plaka eğin. Til üzerindeki kapağı değiştirinted plakası ve ışıktan korumak. Plakalar, 10-20 dakika boşaltmak için izin verilmelidir. (Şekil 2B).
  7. Çimlenmesini kurmak: Steril bir pipet ile eğik plakanın altındaki topladığı tüm suyunu çıkartın.
    1. Kapağı takın ve parafilm plaka mühür. Eldiven giyin ve (Şekil 2C) steril tutmak.
    2. Çimlenme plakaları yığını ve daha sonra bir 90 ° açıyla hepsini açmak. Tohumlar agar dikey yüzey yatan olacaktır. Tamamen emdirilmiş tohumlar kolaylıkla ağar uymalıdır. Kökleri aşağıya doğru (Şekil 2B) artacak.
    3. Işığı bloke eder ve 3 gün boyunca 25 ° C'de tutmak için folyo çimlenme plakaların yığınını sarın.

Not: en az 3 gün boyunca çimlenme gelirleri ise, kökleri mikrokosmlarından yılında agar ulaşmak için çok kısa olabilir. Çimlenme daha 4 gün evren plakaları aktarılmadan önce devam ederse, fidelerin hayatta olacakfakir. Eğer M. daha yavaş çimlenme oranları ile truncatula ekotipler veya mutantlan karşılaştırılacak olan, yavaş yavaş filizlenen ekotip 3 günden daha fazla çimlenme izin verilmelidir.

2. Bireysel Plate microcosms hazırlanması

  1. Her mikrokozmosu için Jensen orta 12 (kompozisyon bkz. Tablo 1), izin ~ 70 ml ortamı hazırlayın. Için uygundur sürahi veya şişeler içinde hazırlayın hızlı dökme (sürahi başına en fazla 1-2 L) ve otoklav sırasında sürahi bir manyetik karıştırma çubuğu bırakın.
    1. Orta ~ 55-65 ° C, takviyeleri ilave edilmiştir soğuyana ve pH (bkz. Tablo 1) kontrol edildikten sonra, yuvarlak 100 mm çaplı içine 15 mm derin plakaları dökün. Tabaklar ~ 0,9-1 cm derinliğinde (~ 70 ml / plaka) dökülmelidir.
    2. Jensen ortamının bileşenleri bulanık bir çökelti meydana getirebilir, bu nedenle yerleştikten bileşenleri önlemek için periyodik olarak manyetik karıştırma plakasına sürahi dönmek için önemlidir. Çökeltiler vis olabilirkatılaşma sonra plakadaki bağdaş ve sürece eşit plakalar arasında dağıtılır olarak performansını etkilemez.
    3. Plaka kapaklarındaki yoğuşma oluşumunu önlemek için dökme sırasında plakaları yığını.
  2. Jensen plakaları katılaşan sonra, bir U-şekilli 5 (Şekil 3A) bükülmüş olan bir tartı spatula ile iki tabak ve kapaklar çentik. Kırmızı sıcak, çentik 5-6 plakalar kadar bir brülör ile spatula bend ısıtın ve sonra tekrar ısı. Çentikli kapak çentikli plakası üzerine yerleştirilir, bu fidenin ateş (Şekil 3B) artacak, üzerinden bir oval portal oluşturacaktır. Çentikli plakaları saklanacak ise, parafin film ile ayrı ayrı sarın ..

3. Sinorhizobium meliloti hazırlanması Kültürleri

İki gün bitki inokulasyonlarda önce, tüm S. kültürleri başlar meliloti fideleri üzerine inoküle edilecek suşları. Cultures LBMC 2.5 mM MgSO 4, 2.5 mM CaCI2, ve uygun antibiyotikler (TY ortam ayrıca iyi çalışır) ile desteklenmiş (Luria-Bertani [Miller]) ortamı içinde 13 yetiştirilmelidir. Her kültürün az 2-3 ml yeterli olacaktır.

  1. Hücreler yoğun kadar 2 gün boyunca çalkalanarak 30 ° C'de büyür.
  2. Çoğu bitki aşıları için, S. büyüme fazı meliloti kritik değildir. Tipik olarak, geç log ya da erken durağan faz hücreleri kullanılır.

4. M. dışarı atarken Bireysel Mikrokozmoslar üzerinde truncatula Fideler

  1. 3 gün sonra, (aşama 1 'de hazırlanan) bir çimlenme plakası açık ve derhal steril aşırı saf su ile sel. Dip etanol ve sterilize etmek alev kısaca forseps. Hafifçe kurumasını önlemek için su altında tüm fidan kök ipuçları itmek için steril forseps kullanın. Kökleri uzun 2-6 cm arasında değişmektedir. Çoğunluk 3-4 cm olacaktır. Düz kökleri ve hiçbir belirgin ile fidan seçindefektleri.
  2. Yoğuşma birikmesi için Jensen orta mikrokosmlarından kapaklarını kontrol ediniz. Yoğunlaşma kaldırmak veya yeni bir çentikli kapak ile değiştirmek için kapağı hafifçe vurun. Kapağın üzerinde yoğunlaşma fazlalığı varsa, fide kök kapağa yapışabilir ve yoğunlaşma kuruduktan sonra daha sonra ölür.
  3. Forseps kullanarak, hafifçe kotiledonlarının tarafından çimlenme plakadan bir fide almak ve Jensen orta mikrokozmos üzerindeki kök yatıyordu. Kök ucu agar ile temas halinde olduğundan emin olun.
  4. Hala mevcut olup olmadığını nazikçe tohum kat kaldırmak. Tohum kabukları 5-10 dakika boyunca suda ıslatıldıktan sonra gevşek olmalıdır. Yavaşça yol verir kadar forseps ile tohum ceket kızdırmak, ve atın. Sürgün Kotiledonlar ve yaklaşık olarak 0.5 cm plaka (Şekil 4A) 'de U-çentik üzerinden çıkıntı gerekir. Dikkatlice fide (Şekil 4B) için bir portal oluşturma, fidenin üzerinde kapağın U-çentik ile plaka kapağı yerine takın.Tüm fidanları mikrokosmlarından konuldu kadar yatay yığınlar kenara tabak ayarlayın.
  5. Canlı bakmak ve düz bir kök var her çimlenme plaka tüm fide kullanın. (Mümkünse, hemen aşılamadan önce solmuş fide için yedek olarak kullanmak için açılmamış fidelerin bir tabak bırakın.)
  6. Tüm fidan dışarı atarken sonra, onları yatay Jensen mikrokosmlarından oturmak için izin verirken S. meliloti inokulum süspansiyonlar hazırlanmaktadır.

5. S. hazırlanması meliloti Aşı Cezalı

  1. S. edin onlar büyüyor emin olmak için periyodik aşılamadan sonra kültürleri meliloti. 2 günlük bir büyümeden sonra, OD 600 2 ve 4 arasında olmalıdır.
  2. Pipet steril bir 1.5 ml tüp ve pelet için santrifüje her bir kültür 0.5 ml. Süpernatantı.
  3. % 0.85 NaCl veya steril aşırı saf, steril su içinde ya da hücreler, iki kez yıkayın. 0.5 ml% 0,85 ste hücrelerin yeniden süspanseNaCl veya saf su kızdırmak.
  4. S. yeniden süspansiyon haline getirilmiş bir 1/10 sulandırma OD 600 ölçün adım 5.3 den kültürleri meliloti. Bu okuma göre, OD 600 = 0.05 steril aşırı saf su içinde her bir kültürün bir süspansiyon elde etmek. Hücre yoğunluğu çok yüksekse, nodülasyon inhibe edilebilir. 100 ul her bir fide üzerine aşılanır, böylece seyreltik süspansiyonun yeterince olun. OD 600 = 0.05 süspansiyon bulutluluk gözle zar zor algılanabilir olmalıdır.

6. Aşılama ve mikrokosmlarından Sızdırmazlık

  1. Hemen öncesinde başlayan İnokülasyonlara, Jensen orta mikrokosmlarından için transferi hayatta değil soldu fidelerin kontrol edin. Çimlenme plakalardan taze fidan olan fidan değiştirin.
  2. Her evren açın ve uygun S. 100 ul aşılamak fide kök üzerine süspansiyon meliloti. Kapağı takın ve yatay istiflenmiş kenara koyun6-10 mikrokosmlarından ks. Her S. meliloti gerginlik karşılaştırıldığında olmak, en az 15 bitki aşılamak. Simbiyotik verimlilik ince farklar var suşları için, 30-35 bitkiler aşılamak. Bir negatif kontrol olarak, aşılanmamış en az 10 bitkiler bırakın. S. ile 30-35 bitkiler inoküle meliloti 1021 veya diğer uygun doğal tipte suş, pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.
  3. Sonra, S. meliloti süspansiyon, kök yüzeyi üzerine adsorbe etmek için zaman oldu ve süspansiyon, sıvı, agar (en az 20 dak.) içine batırılmış, parafin film ile her bir levha sarın. Tabaklar çentik çok kenarına sarılmış olmalı, ancak parafin filmi fide (Şekil 4C) büyümesini engellemek gerekir.
  4. Sarma sırasında, plaka kapağın içine yapıştırılmış kökleri için bir kez kontrol edin. , Kapaktan yapışmış kökleri kaldırın bankta düz plaka yatıyordu ve ağar su üzerine tekrar aşağı kök vurmak için kapağı dokunun veya fiskerface.
  5. 6-10 plakaların her yığınının fide portalları hizaya. Fide (Şekil 4D) yukarı işaret eden bir 90 ° açıyla yığını yatıyordu. Parafin filmin yapışkanlığı fideleri (Şekil 4E) ortaya çıktığı açılmamış bir 1-2 cm şerit bırakarak folyo yığının tamamını sarmak için yeterince uzun levhaları yerinde tutacaktır. Folyo ışıktan kökleri koruyacaktır.
  6. (16 saat ışık / 8 saat karanlık döngüsünde 21-25 ° C,% 60-70 nispi nem ve 100-175 umol / m-2 s -1 ışık ışıklı bir büyütme odası ya da büyüme odasında folyo sarılmış yığınları yerleştirin Şekil 1A). Bu büyüme koşulları altında, ışık seviyelerinde uzun kuluçka daha yüksek 200 mol / m -2 s -1 bitki büyümesi üzerinde zararlı etkisi olabilir.

7. Kök Sistemleri ve Simbiyotik fenotipleri Nicel İncelenmesi

Bitkiler korunabilirkadar 9 hafta boyunca mikrokozmosları.

  1. Nodül sayısı her yığından folyo açılması ve nodüller sayarak zaman noktalarının bir dizi de belirlenebilir. S ile aşılanmış bitkilerdeki nodülleri geliştirilmesi meliloti 1021 vahşi tip aşılamadan sonra 10-14 gün daha belirgindir.
  2. Symbiotic verimliliği de ortaya çıkan sürgünün uzunluğunun ölçülmesi ile, her bir zaman noktasında ölçülebilir.
  3. Simbiyotik verimlilik Final miktarlandınlması genellikle ateş ayırma ve sürgün taze ağırlığını ölçerek aşılamadan sonra 7 hafta gerçekleştirilir. Daha fazla büyüme isteniyorsa, bu adım olarak geç 9 hafta gibi gerçekleştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu plaka mikrokosmlarından hazırlanması ve aşı Giriş bölümünde anlatılan çok diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında oldukça basittir. Bu mikrokosmlarından kullanımı da sulama veya besin takviyesi, kök sterilite bakım, hem de kökleri ve ışıktan köklerinin korunması kolay muayene olmadan (9 haftaya kadar) uzun süre bitki gelişimini sağlar, bitkinin büyümesi için serbest çekimine, kolay erişim vuruyor uzunluk ölçümü ve kök tüyleri minimal hasar ile mikrokosmlarından bitkilerin çıkarılması. Şekil 1A bir kuluçka mikrokosmlarından büyüyen genç fidan gösterir. Şekil 1B-1E gösterisinde görüntüler M. içeren mikrokosmlarından birkaç farklı görünümler Vahşi tip S. ile aşılanır truncatula A17 bitkiler meliloti 1021. Sıkıca paketlenmiş ise,> 220 mikrokozmosları x 67.5 cm kuluçka raf bir 73,8 cm üzerinde uyacak. Bir de 1B ve 1C gösterisi Mikrokozmoslar Rakamlarfolyo sarılı mikrokosmlarından yılında portalları çıkan bitkiler ile yığını. Şekil 1D kaldırıldı folyo ve kök ve plakasının ön aracılığıyla gösteren nodüller ile tek bir evren gösterir. Şekil 1E aynı evren çıkan bitki ile düz yalan gösterir plakadaki portal. Sürgün uzunluğu bitki bozmadan mikrokozmos (Şekil 1C) dan çıkması açısından ölçülebilir. Şekil 5A M. sürgün uzunluğu verileri göstermektedir Vahşi tip S. ile aşılanır truncatula A17 bitkiler meliloti 1021 aşılanmamış 7 hafta sonra bitkiler ve 9 hafta sonrası aşılama ile karşılaştırıldığında. Microcosms büyüme nodül gelişimi ve sürgün uzunlukta zaman noktalarında bir dizi toplama için idealdir. Son timepoint, sürgünler sürgün taze ağırlık (Şekil 5B) ölçümü için kesilir. 6 7 hafta pos 3 simbiyotik fenotipleri örneklerini göstermektedirt-aşı. M. nispi simbiyotik verimlilik Farklı S ile aşılanmış truncatula A17 bitkiler meliloti suşları sürgün uzunluğu (Şekil 6A) ile ölçülebilir ve taze ağırlığı (Şekil 6B) ateş edilir. Bu suşlar ile aşılanmış bitkilerde kök nodüllerin sayısı Şekil 6C'de gösterilmiştir. Kök düğümlerinde leghaemoglobin üretimi nedeniyle bir pembe renkli küçük beyaz nodüller genellikle işlevsiz ve / veya iptal ve kahverengi nodüller yaşlanmış ve 14-18 nekrotik ise nodüller, fonksiyonel ve azot tespit yeteneğine sahip olduğunu gösterir. Şekil 6'da karşılaştırması gösterir M. simbiyotik verimlilik S ile aşılanmış truncatula A17 bitkiler meliloti 1021 ExoY undecaprenyl-fosfat galaktoz fosfotransferaz aşın PSTB-LAFR5-exoY plazmid, taşıma vahşi tip S. daha büyüktür meliloti 1021 ve eksi c taşıyan suşları ontrol PSTB-LAFR5 plazmid. Bu ExoY aşırı ifade suşları kontrol suşları daha süksinoglikan simbiyotik eksopolisakaritin daha fazla üretmek. Tezahür birkaç hafta sürebilir simbiyotik fenotiplerinde farklılıkları ölçmek için yeteneği, bu yöntemin önemli bir avantajdır. M. üzerinde simbiyotik verimlilik her önlemler için truncatula A17, Sinorhizobium Medicae suşları WSM419 ve ABS7 S. daha iyi performans meliloti 1021 (Şekiller 6A-6C). (Şekil 6 verilerin başlangıçta 19) 2012 (Jones çıktı.) Evren demonte ve taze ağırlıkları ateş olduğu zaman kökleri de mikroskobu ile görüntülenmiş edilebilir, ölçülür. Şekil 7. M. temsilcisi manzarası gösterir microcosms çıkarıldıktan sonra truncatula A17 kökleri. Kökleri Agarın yüzeyi üzerine yerleştirin ve yukarı-köklü agar yatay tabakasından değildir çünkü kök kıllar çok az hasar yaşanmıştır.

plakadaki agar büyüme ortamı ~ 70 mi yoktur, çünkü _content "> Bu bitkiler microcosms en fazla 9 hafta boyunca muhafaza edilebilir. uzun büyüme süresinin sonunda, bazı bitkiler kurumaya başlayabilir. büyüme yedi hafta simbiyoz için en uygunudur S. meliloti ile 1021. M. daha verimli simbiyoz için S. Medicae WSM419 veya S Medicae ABS7, 4-5 hafta daha kısa bir gelişim periyoduna sahip A17 truncatula en uygunudur.

Her bir L başına Nihai konsantrasyon Stok çözeltisinin miktarı Hazır konsantrasyon
1 g 4 CaHPO NA NA
0.2 g MgSO 4 · 7H 2 0 1 mi 0.2 g / ml
0.2 g K 2 HP0 4 1 mi 0.2 g / ml
0.2 g NaCl 1 mi 0.2g / ml
0.1 g FeCl3 · 6H20 1 mi 0.1 g / ml
11.5 g Agar-saflaştırılmış (agar özellikleri için özel Reaktitlerin bkz. Tablo)
milliQ H 2 0-1 L

Tablo 1. Plaka mikrokosmlarından için Jensen orta ağar protokol. Jensen orta Hazırlama talimatları.

Adımlar:

  1. Yukarıdaki katkı maddeleri eklemek ve manyetik karıştırıcı ile karıştırın.
  2. Sürahi karıştırma çubuğu ile otoklav 45 dakika, sıvı döngüsü.
    Not: CaHPO 4 ve FeCl3 autoklav sırasında çökecektir. Süspansiyonu içine onları geri almak için karıştırın; medya hala bulutlu kalacaktır
  3. Bu çıplak ellerle sürahi almak için ağrılı değildir kadar karıştırılarak soğumaya.
  4. 1 wh (tarifi için aşağıya bakınız) L başına iz mineraller ml ekleIle karıştırma
    Not: hazırlamadan önce iz mineraller çökelti tekrar süspansiyon emin olun.
  5. Karıştırılırken, bir L başına 0.25 ml 4 N NaOH ekleyin.
  6. Steril bir pipet ile ~ 100 ul ortam kaldırılması ve pH kağıdına göre uygulayarak pH'ı kontrol edin
    Not: pH 5-10 aralığı kağıt iyi çalışıyor. pH ~ 7 tam renk gelişimi için bir kaç saniye bekleyin olmalıdır. PH doğru değilse, bir hazırlık bir hata olmuş olabilir.
  7. Manyetik bir karıştırma plakası dönen balon ile yeniden karıştırılması mümkün olduğunca kalın plakalar dökün
    Not: Bir levha kapasitesinin üzerinde (yani, sıvı, kapağın alt üzerine emer),
    Not: ~ litre başına 15 plaka almak için bekliyoruz.

Minerallerin stok 1 L Trace (otoklav ile sterilize)

1 g H 3 BO 3
1 g ZnSO 4 · 7H 2 0
0.5 gr CuSO 4 · 5H 2 0
0.5 g MnCI2 · 4H 2 0
1 g Namoo 4 · 2H 2 0
mili-Q H 2 0 L 1'e

Şekil 1
Şekil 1. S ile aşılanmış bitkiler ihtiva eden mikrokosmlarından sayısı meliloti 1021 A) bir kuluçka büyüyen evren plakalarda Bitkiler. B) M. S ile aşılanmış truncatula A17 bitkiler kökü ile B ve C evren plakaları biri mikrokosmlarından. D çentikler ile büyüyen bitkiler) gösteren B plakaların Jensen agar mikrokosmlarından üst yarıktan büyüyen meliloti 1021 yabani türü. C) Ek yakın çekim görüntüsü kapak aracılığıyla görüntülü nodüller. E) fro Plakam D çentik çıkan ateş ile düz yalan.

Şekil 2,
Şekil 2. Tohum çimlenme plaka set-up. A) Tohumlar, 100 mm kare levha. B'nin bir yarısı boyunca dağıtılır) Agar yüzey suyu eğik bir plakanın altındaki toplamak için izin tarafından boşaltılır. C) Tabaklar yığın), parafin folyoya sarılır yığılmış ve D 90 o açıyla döndü ve folyoya sarılmış.

Şekil 3,
Şekil 3,. Bükük bir spatula ile Jensen'in plakaları çentik tarafından mikrokosmlarından İnşaatı. A) bir oval şeklinde bükülmüş olan metal bir spatula tartı alev ısıtılır ve tarafında U-şekilli bir delik çentik elplaka ve kapak yan. Plakadaki U-çentiğin alt agar yüzeyinin üstünde olmalıdır. Kapağın içindeki U-çentiğin alt fide çıkıntı, üzerinden bir oval-şekilli portal oluşturur plaka üzerine kapağı yerine takın) tüm yol kapağın. B en üstünde olmalıdır.

Şekil 4,
Şekil 4. Mikrokosmlarından içine fidan ekleme. A) İki Defa fide kök dizilmiş çentikler ile plaka üzerinde kapağını yerleştirme) ateş plakası. B) ve C U-çentik dışarı çıkıntılı kotiledonlarında ve ~ 0.5 cm ile agar yüzeyinde yatıyordu nasıl göstermek fide için oval bir portal oluşturmak olacaktır. Parafin filmle sıkı bir şekilde plaka Sarma hareket kapağı tutmak ve kurumasını engeller. D) Plakalar daha sonra birlikte istiflenebilir 6-10 grupları, ve E) folyo ile sarılmış. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,
Şekil 5,. Örnek simbiyotik fenotipleri 7 hafta büyüme ve M. 9 hafta büyüdükten sonra, S. ile aşılanmış bitkilerin truncatula bireysel microcosms olarak A17. A) ateş uzunluğu meliloti 1021, aşılanmamış ve bitkilerin filiz uzunluğu microcosms gelen bitkiler çıkarmadan 7 hafta sonra ölçüldü. 9 haftada aşılama sonrası, sürgün uzunluğu (A) ölçülmüştür ve daha sonra sürgünler kesilmiş ve (B) tartılmıştır.

. Jpg "/>
Şekil 6,. Temsilci simbiyotik fenotipleri M. 7 hafta büyüdükten sonra truncatula A17 bireysel microcosms içinde. S. suşları exoY-aşırı meliloti 1021 konakçı bitki Medicago truncatula A17 üzerinde simbiyoz gelişmiş var. S. simbiyotik verimlilik meliloti 1021 M. üzerinde truncatula A17 exoY tarafından kodlanan undecaprenyl-fosfat galaktoz fosfotransferaz aşırı ifade eden suşta artırıldı. Simbiyotik verimlilik cm (A) sürgün uzunluğu olarak ölçülür ve (B) gram taze ağırlık ateş edilir. Beyaz, etkisiz nodüller (orta grafik bar);, pembe, fonksiyonel nodüller (alt grafik bar) sayıları ve kahverengi, nekrotik nodüller (üst grafik bar) (C) gösterilmiştir. S. ile aşılanmış bitkilerin simbiyotik verimlilik ve nodül sayısı Medicae suşları WSM419 ve ABS7 de gösterilir. Grafik bar üzerinde Yıldız istatistiksel bir ifadeEşleştirilmemiş bir t-testinde 1021 yabani tip referans suşu ly anlamlı fark. Bir süksinoglikan üretmez bir exoY :: Tn5 boş mutant ile aşılanmış bitkiler aşılanmamış bitkilerine benzer sürgün uzunlukları ve taze ağırlığına ve sadece beyaz, etkisiz nodüller üretti. (A) ve (B) ilk 19 yılında yayımlandı grafikler. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 7
Şekil 7. Bu agar üzerinde bulunması nedeniyle microcosms çıkarıldıktan sonra bir mikroskop üzerinde görüntülenmiş kökleri. Roots kolayca kök tüyleri için en az hasar ile görüntüleme için microcosms kaldırılabilir. Görüntüler M. köklerini göstermek 10 gün sonrası aşılama (A, B) truncatula A17 (C). Gösterilen kökleri S ile aşılandı meliloti 1021 vahşi tip (A), bir S. meliloti bir EGLC :: GUS füzyonu (B) taşıyan suşu ve bir S. Bir SMc00911 :: GUS füzyon 20 (C) taşıyan meliloti süzün. S. GUS boyama SMc00911 :: GUS füzyonu taşıyan meliloti hücreler kök tüyleri görünür ve E. Bar kök yüzeyi 100 um gelir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Başarı için kritik olan protokolün birçok adım vardır: 1) saflaştırılmış, bitki hücre kültürü kullanarak gerekliliği ağar gereğinden fazla vurgulanan olamaz test. Bu, alfalfa fideleri için kritik öneme sahip değildir, ancak M. büyümesi için çok önemlidir truncatula A17. 2) Aşama 1 'de tarif edildiği gibi, dikey agar plakaları üzerinde fide çimlenme için önemlidir. Fide kökleri düz çok kısa ve / veya değil, olacak çünkü 15 mm derin bir plaka 7 ters bir yatay yüzey üzerinde fide çimlenme yaygın olarak kullanılan teknik, bu protokol için tavsiye edilmez. Uzunluğunda 2-4 cm düz büyüyen kökleri ile fidan mikrokosmlarından için çimlenme plakaları transferi için idealdir. Dikey çimlenme plakalarda büyüme Üç gün Bu uzunluğu elde etmek için, genellikle kökleri için idealdir. 3) Bu aşılamadan önce Rhizobia'da fidelerin kirlenmesini önlemek için de önemlidir. Microco hiç çimlenme plakalardan fide aktarımı öncesindesms, çalışma alanı etanol ile iyice temizlenmeli ve transferinde kullanılan tüm aletler sık ​​sık sterilize alevi olmalıdır. Kirlenme potansiyel bir kaynak S. hazırlanması önlenebilir hazırlık fide için kullanılan ayrı bir çalışma alanı mikrokosmlarından aşılanması için meliloti gerginlik süspansiyonlar. Mantar sporları kat gömülü olabilir beri mikrokosmlarından mantar kontaminasyonu da, evren iç gelen tohum kat tüm kalıntılarını kaldırarak önlenebilir. 4) Fide sağkalım transferi sırasında her zaman nemli ve agar ile temas fide kökleri tutarak, ve çok nazik tedavi ile maksimize edilebilir. Çimlenme plaktaki agar sıkışıp kök ile herhangi bir fide köküne zarar görmesini önlemek için dikkatli bir şekilde eksize edilir. Canlı bitkiler yüksek verim başlamadan önce aşılar mikrokosmlarından yığınlarının solmuş fidan için son bir kontrol yapmak ve onları zekâ değiştirerek elde edilebilirh yeni fidan. Fidan iyi durumda olan ve plaka kapağın içine yapıştırılır değil, fide% 5'ten az bu aşamada değiştirilmesi gerekir gerekir. Mikrokozmosun sürgün büyüme tıkanması emin tohum kat hiçbir kalıntıları kotiledonlar kısıtlayıcı olduğunu ve evren parafilm sarılmış sürgün engel olmayacak şekilde dikkatli olduğunu yaparak önlenebilir.

Biz rutin ev sahibi bitkilerde simbiyoz incelemek için bu yöntemi kullanın M. truncatula A17 ve yonca ve şu anda diğer M. büyüme için teknik optimize edilir truncatula çeşitlerin, Medicago'dan diğer türler ve Melilotus (sweetclovers) türleri. Henüz M. ile bu yöntemi test değil A17 ile genetik haritalama ortak olarak kullanılan bir ekotiptir truncatula A20. Gag'ın M. cv truncatula. R108 saflaştırılmış bitki hücre kültürü test ag üzerinde iyi büyümek değilşu anda kullanıyor ve biz başka bir agar hazırlanması veya bu çeşidinde için bir evren büyüme tabakası olarak kullanım için bir agar-yerine tespit etmeye çalışıyoruz ar.

M. analizi için diğer yaygın olarak kullanılan yöntemlerle burada tarif edilen yöntem karşılaştıran truncatula A17 / S. simbiyoz meliloti, bu aynı zamanda S. çok sayıda simbiyotik performansını karşılaştırmak için bugüne kadar en iyi yöntemi ile olduğu bulduk suşları meliloti. Biz rutin bir seferde 250 Mikrokozmoslar kurmak (S. meliloti 25 bitkilerin her ekildikten 10 farklı suşları.) Ne zaman S. tek bir genotip ya da S. meliloti Medicae kullanılacak, ve çapraz kontaminasyon riski değil, aeroponic kesonler ya da büyüme torbalar daha uygun bir yöntem olabilir. Bu plaka evren yöntem de uzun bir dönemi üzerinde nodül gelişimi ve simbiyotik verimlilik ilerlemesi periyodik gözlemler yapmak için en iyi yöntemzamanı. Bu tür nodül yaşlılığında gibi ortak yaşam daha sonraki aşamalarında tezahür fenotipleri, diğer protokolleri ile daha bu yöntemle daha kolay incelenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz yazının eleştiri Brian K. Washburn teşekkür KMJ 20582 - Bu çalışma USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi hibe 2010-65108 tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar purified, plant cell culture-tested Sigma A7921

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
  3. Glazebrook, J., Walker, G. C. Genetic techniques in Rhizobium meliloti. Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).
  4. Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
  5. Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
  6. Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
  7. Barker, D. G., et al. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. (2006).
  8. Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
  9. Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
  10. Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
  11. Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. (2006).
  12. Vincent, J. M. A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. Blackwell. (1970).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1982).
  14. Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
  15. Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
  16. Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
  17. Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
  18. Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
  19. Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
  20. Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics