टिशू इंजीनियरिंग: स्तरित सेल पत्रक के वितरण के लिए एक बहुकोशिकीय 3D पाड़ के निर्माण

Bioengineering

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Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. J. Vis. Exp. (92), e51044, doi:10.3791/51044 (2014).

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Abstract

ऐसे वयस्क मानव मन के रूप में कई ऊतकों,, पर्याप्त रूप से क्षति के बाद पुनर्जीवित करने में असमर्थ हैं. ऊतक इंजीनियरिंग में 2,3 रणनीतियाँ वसूली और मरम्मत में शरीर की सहायता करने के लिए नवाचारों का प्रस्ताव. उदाहरण के लिए, ते दृष्टिकोण रोधगलन (एमआई) के बाद दिल remodeling attenuate और संभवतः एक के पास सामान्य पूर्व एमआई स्तर के लिए कुल दिल समारोह को बढ़ाने में सक्षम हो सकता है. 4, हृदय के ऊतकों के सफल उत्थान के समुचित वितरण शामिल है किसी भी कार्य ऊतक के साथ के रूप प्रत्यारोपित सेल / ऊतक भ्रष्टाचार के एकीकरण और अस्तित्व के पक्ष में पर्यावरण cues के साथ कई प्रकार की कोशिकाओं. डिलीवरी वाहन, सेल अस्तित्व पर उनके प्रभाव, सामग्री ताकत, और सेल के लिए ऊतक संगठन की सुविधा के रूप में मूल्यांकन घुलनशील संकेत, सेल करने वाली सेल बातचीत, और मैट्रिक्स सामग्री: इंजीनियर ऊतकों सहित कई मापदंडों का पता होना चाहिए. भ्रष्टाचार कोशिकाओं की प्रत्यक्ष इंजेक्शन ही इन आवश्यक तत्वों की अनदेखी रोजगार अध्ययन. 2,5,6इन सामग्री के संयोजन एक ऊतक डिजाइन अभी तक विकसित किया जाना है. यहाँ, हम "ऊतक" में नए जहाजों के गठन को बढ़ाने के लिए लक्ष्य अंग सेल प्रकार और endothelial कोशिकाओं से युक्त जैविक व्युत्पन्न सामग्री की दो अलग प्रकार के साथ नमूनों सेल पत्रक के layering का उपयोग कर एकीकृत डिजाइन का एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं. इन अध्ययनों दिल की तरह ऊतक की पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित हालांकि, इस ऊतक डिजाइन न्यूनतम डिजाइन और सामग्री में परिवर्तन के साथ दिल के अलावा अन्य कई अंगों के लिए लागू किया जा सकता है, और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक मुस्तैद उत्पाद के लिए होती है. प्रोटोकॉल पांच विस्तृत चरणों में हैं. एक तापमान संवेदनशील पाली (एन -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) कोट टिशू कल्चर व्यंजन के लिए प्रयोग किया जाता है. फिर, ऊतक विशिष्ट कोशिकाओं को मजबूत पार्श्व adhesions के साथ सेल पत्रक के लिए फार्म लेपित प्लेटें / micropattern सतहों की सतह पर संवर्धित कर रहे हैं. तीसरा, एक आधार मैट्रिक्स neovascular permissi साथ झरझरा मैट्रिक्स के संयोजन से ऊतक के लिए बनाई गई हैहाइड्रोजेल और endothelial कोशिकाओं की है. अंत में, सेल चादरें pNIPAAM लेपित व्यंजन से उठा लिया जाता है और पूरा का निर्माण कर रही है, आधार तत्व को हस्तांतरित.

Protocol

PNIPAAM में लिपटे प्लेटों की 1 निर्माण

  1. एक 60% टोल्यूनि / 40% हेक्सेन समाधान के 2 मिलीलीटर में pNIPAAM की 2.6 ग्राम भंग.
  2. PNIPAAM भंग कर रहा है, जब तक हड़कंप मच गया 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक मिश्रण गर्मी.
  3. Buchner कीप में एक 60 मिमी व्यास चक्र और जगह कागज में फिल्टर पेपर कट.
  4. पूर्व तौला गिलास बीकर में Buchner कीप के माध्यम से समाधान (हेक्सेन प्लास्टिक पिघल जाएगा, के रूप में प्लास्टिक का उपयोग नहीं करते) फ़िल्टर.
  5. एक घंटी निर्वात (24 साई) ओ / एन (16 घंटे) में बीकर और सामग्री रखें. नोट: छाछ isopropyl के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है, जब तक यह तो यह ऑक्सीजन के संपर्क में नहीं आती बनाना oxidize जाएगा.
  6. PNIPAAM का वजन स्थापित करने बीकर वजन.
  7. समाधान डब्ल्यू / डब्ल्यू एक 50/50 बनाने, pNIPAAM को isopropyl शराब जोड़ें.
  8. यूवी प्रकाश के तहत 5 मिनट के लिए टिशू कल्चर प्लेट की सतह पर समाधान, और कोट के 2 मिलीलीटर रखें.
  9. दो बार गर्म पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ प्लेट धोसेल संस्कृति के लिए उपयोग करने से पहले.

सेल शीट्स के 2 निर्माण

नोट: लक्ष्य अंग के लिए प्राथमिक कोशिकाओं के सेल पत्रक अलग तरीकों का एक नंबर का उपयोग कर बनाया जा सकता है, या यहाँ वर्णित के रूप में थर्मामीटरों उत्तरदायी बहुलक साथ टिशू कल्चर सतहों कोटिंग से. पूर्व लेपित थर्मामीटरों संवेदनशील प्लेटें भी विक्रेताओं के एक नंबर के द्वारा की पेशकश कर रहे हैं.

नोट: इस प्रोटोकॉल एक 35 मिमी पकवान का उपयोग संस्कृति के लिए है. संक्षेप में, कोशिकाओं पहली आसन्न कोशिकाओं के बीच पार्श्व कनेक्शन स्थापित करने के संगम पर 24 घंटे की एक न्यूनतम के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated हैं. सेल पत्रक जारी करने के लिए, प्लेटें 32 डिग्री सेल्सियस नीचे तापमान के अधीन हैं. सेल चादर तो संवहनी endothelial कोशिकाओं के साथ एक neovascular अनुमोदक हाइड्रोजेल युक्त मजबूत आधार रेशेदार मैट्रिक्स को सौंप दिया है.

  1. सेल आबादी अलग. नोट: इस विधि व्यक्ति व्युत्पत्ति प्रक्रियाओं और कोशिकाओं के प्रकार पर निर्भर है. चूहा महाधमनी चिकनी म्यूscle कोशिकाओं (RASMC) इस उदाहरण में उपयोग किया जाता है. ये एक चूहे के उदर महाधमनी से अलग प्राथमिक चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं रहे हैं.
  2. गर्म पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें.
  3. 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को trypsin (या अन्य cleaving / disassociating समाधान) के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
  4. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त संस्कृति मीडिया, या फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) के 3 मिलीलीटर के अलावा द्वारा trypsin रोकते हैं.
  5. एक शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा और एक विभाज्य गिनती.
  6. 5 मिनट के लिए 1000 rpm (228 XG) में कोशिकाओं स्पिन.
  7. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और उनके विकास मीडिया में कोशिकाओं resuspend (SmGM2 प्लस गोली किट संस्कृति के माध्यम RASMC के लिए प्रयोग किया जाता है).
  8. 100% संगम को प्राप्त होगा कि एक एकाग्रता में pNIPAAM लेपित थाली - एक 35 मिमी थर्मामीटरों संवेदनशील थाली पर कोशिकाओं से युक्त मीडिया रखें. नोट: RASMCs के लिए उस नंबर / 2 सेमी 100,000 कोशिकाओं होने के लिए निर्धारित किया गया था. कि VA के बहरहाल, कारण निधन दौरान कोशिकाओं के नुकसान के लिए, 120% lue प्रयोग किया जाता है.
  9. 37 डिग्री कंपनी / एन पर एक मशीन में रखें. नोट: यह थाली करने के लिए सेल आसंजन बनाए रखने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है.

मूलभूत मैट्रिक्स की 3 तैयारी

नोट: विभिन्न 3D रेशेदार matrices नाजुक सेल चादर के बीच मजबूत रेशेदार मैट्रिक्स परत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कुछ उदाहरणों में शामिल: gelfoam, bioglass, प्राकृतिक acellularized सामग्री 26 या nanospun सामग्री 27,28 इन अध्ययनों में इस्तेमाल किया सुअर मूत्राशय मैट्रिक्स (UBM) उदारता से हमारे सहयोगी, डॉ Badylak से प्रदान की गई थी 29.

  1. Decellularized मैट्रिक्स प्रयोग किया जाता है, सेलुलर सामग्री की कमी सहित मैट्रिक्स विशेषताओं का निर्धारण 27,28 सेल विशिष्ट व्यवहार्यता, और शून्य अंतरिक्ष, का उपयोग करने से पहले. 22
  2. एक वांछित आकार और आकार में पूर्व निष्फल मैट्रिक्स काटें. नोट: ये लो, एक छेद पंच एक 4 मिमी व्यास सर्कल में कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
ve_title "> 4. एक Neovascular उदारचेता Hydrogel में सीडिंग endothelial कोशिकाओं

नोट: endothelial कोशिकाओं से स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं से भेदभाव सहित विभिन्न स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है. इधर, HuVECs किया जाता है.

  1. पार से जोड़ने समय के रूप में लंबे समय के किसी भी अनुमोदक हाइड्रोजेल (आतंच, कोलेजन जैल) का उपयोग कोशिकाओं व्यवहार्य रहने की अनुमति देने के काफी कम है. नोट: यहाँ, एक Hyaluronan (हा) आधारित जेल एक डाइसल्फ़ाइड पुल प्रयोग किया जाता है के साथ पार से जुड़े.
  2. कंपनी प्रोटोकॉल के अनुसार हा हाइड्रोजेल तैयार करें.
  3. Endothelial कोशिकाओं लीजिए और 1x trypsin का उपयोग कर एक एकल कोशिका समाधान में फैलाने के. नोट: Accutase या सेल हदबंदी बफर भी एकल कक्ष फैलाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. , या पीबीएस में 10% FBS के समाधान / एक 15 मिलीलीटर में कोशिकाओं शंक्वाकार ट्यूब का संग्रह (यह कोशिकाओं सीरम के साथ संपर्क में नहीं आते हैं यह महत्वपूर्ण है कि अगर) सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के एक बराबर राशि का उपयोग करके trypsin एंजाइम निष्क्रिय.
  5. सीकोशिकाओं ount, और पैच आयामों के लिए आवश्यक मात्रा की गणना (पहले मात्रा निर्धारित). नोट: एक 4 मिमी पैच के लिए, यहां 2 लाख endothelial कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाता है.
  6. 2 मिलियन कोशिकाओं निकालें, और एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जगह है.
  7. 5 मिनट के लिए (228 XG) पर स्पिन.
  8. एक शंक्वाकार ट्यूब में एक गोली के रूप में कोशिकाओं को छोड़ रहा है, सतह पर तैरनेवाला aspirate.
  9. 1 राशन: एक 1 में हा और जिलेटिन तरल सामग्री मिश्रण. फिर गोली युक्त शंक्वाकार ट्यूब में कुल मात्रा का 80% जोड़ें.
  10. 1 हेक्टेयर / जिलेटिन मिश्रण: 1 में endothelial कोशिकाओं Resuspend
  11. चरण 2 से बेस रेशेदार मैट्रिक्स में हा / जिलेटिन मिश्रण में निलंबित कोशिकाओं रखें.
  12. पार linker के वांछित कुल मात्रा का 1/5 (20 प्रतिशत) जोड़ें
  13. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.

सेल शीट्स की 5 अलगाव

  1. एक सेल संस्कृति हुड में इनक्यूबेटर और जगह से कोशिकाओं से युक्त 35 मिमी pNIPAAM इलाज प्लेटें निकालेंआरटी.
  2. जल्दी कोशिकाओं से मीडिया aspirate, और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया है कि 6% सामान्य जिलेटिन के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. जिलेटिन अभी भी गर्म है, वहीं सामान्य जिलेटिन (1 मूवी) की सतह के नीचे यह जलमग्न, जिलेटिन में धातु जाली जगह है.
  4. जिलेटिन कड़ा करने की इजाजत दी, 5 से 7 मिनट के लिए बर्फ पर पूरी थाली रखें.
  5. 7 मिनट के बाद, ध्यान से थाली की ओर से जिलेटिन किनारों को अलग करने के लिए एक रंग का उपयोग करें, और फिर थाली नोट से धातु जाली उठाने के लिए संदंश का उपयोग: 6% जिलेटिन, और सेल चादर जाली साथ उठाने चाहिए.
  6. डिश सेल चादर ले जाएँ और ध्यान से निर्माण के शीर्ष पर जाली स्थापना, आधार रेशेदार मैट्रिक्स हाइड्रोजेल संयोजन के शीर्ष पर जगह है. नोट: सेल चादर के शिखर की ओर अब भी शीर्ष स्थिति में होगा.
  7. गर्म मीडिया (37 डिग्री सेल्सियस) के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
  8. ओ / एन हाइड्रोजेल सतह का पालन करने के लिए कक्षों की चादर की अनुमति सेते हैं.
  9. टी निकालेंसमाधान (लगभग 1 घंटा), या अगले दिन warms के बाद वह धातु जाली.

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Representative Results

प्रवाह आरेख (चित्रा 1) multilayered पैच बनाने के समग्र विधि से पता चलता है. सेल चादरें 32 डिग्री सेल्सियस नीचे तापमान गिर कर pNIPAAM इलाज थाली से अलग कर रहे हैं. फिर सेल चादर अंतर्निहित रेशेदार मैट्रिक्स (चित्रा 1) में वरीयता प्राप्त endothelial कोशिकाओं से युक्त पार से जुड़े हाइड्रोजेल के शीर्ष पर रखा गया है. pretreated थर्मामीटरों संवेदनशील प्लेटें भी सेल पत्रक बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्पेशल topological सतहों विशेष रूप से पैटर्न कोशिकाओं 30 (यानी, संरेखित) के लिए उपयोग किया जाता है.

आधार रेशेदार मैट्रिक्स देशी ऊतक मैट्रिक्स या electrospun decellularizing से उत्पन्न हो सकता है. इधर, रेशेदार पदार्थ शीट पैच आधार (2A चित्रा) के लिए एक 4 मिमी व्यास को काट दिया गया. इस सामग्री के लक्षण वर्णन शून्य रिक्त स्थान को भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि हाइड्रोजेल की राशि का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहां इस्तेमाल किया मैट्रिक्स Previou किया गया हैधूर्त विशेषता और प्रकाशित किया. 22

endothelial कोशिकाओं से युक्त हाइड्रोजेल पार से जुड़े रेशेदार मैट्रिक्स हा हाइड्रोजेल तरल घटकों के आवेदन के बाद कर रहे हैं. प्रतिदीप्ति / पारेषण माइक्रोस्कोपी पार से जुड़े हाइड्रोजेल में कब्जा कर लिया गया है कि calcein AM (चित्रा 2B) के साथ दाग जीवित कोशिकाओं से पता चलता है.

सेल शीट बनाने की प्रक्रिया एक विक्रेता से खरीदा हमारे अपने pNIPAAM लेपित प्लेटें और पूर्व लेपित प्लेटों के बीच तुलना सहित (चित्रा 3) imaged है. RASMC 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 16 घंटे के लिए pNIPAAM इलाज सतह पर चढ़ाया जाता है. यह कम से कम समय कोशिकाओं पड़ोसी कोशिकाओं (चित्रा 3) के साथ अपने पार्श्व आवासी adhesions स्थापित करने के लिए अनुमति देता है. नोट: कोशिकाओं इन पार्श्व संदेश लेखक स्थापित करने के लिए संगम पर होना चाहिए. कम से कम 16 घंटे के लिए संवर्धन के बाद, कोशिकाओं की थाली एक 32 डिग्री सेल्सियस से नीचे ड्रॉप, और बर्फ F उपयोग करने के लिए आर टी के लिए ले जाया जाना चाहिएया 5-8 मिनट ठंडा करने की प्रक्रिया (3B चित्रा) को गति. तापमान ड्रॉप सेल शीट प्लेट की लिफ्ट बंद करने के लिए अनुमति सामग्री कोटिंग के गठनात्मक संपर्क कोण बदल जाता है. चित्रा -3 सी थाली से सेल चादर उठाने से पता चलता है.

प्रयोगशाला में लेपित प्लेट बनाने और सेल चादरें बढ़ने के लिए, कुछ अनुकूलन के बाद, अच्छी तरह से काम किया. 4D हस्तांतरण से पहले RASMC का एक मिला हुआ monolayer पता चलता है. कोशिकाओं लिफ्ट करने के लिए अनुमति दी गई है, जब पत्रक घर में बनाया pNIPAAM पर सेल चादरें जोड़ तोड़, गुना और वास्तव में. ही (चित्रा 3E) के लिए लकड़ी की जाती थी या खरीदी उन मुश्किल था और अक्सर (चित्रा चादरें फाड़ में हुई 3F). इसलिए, चादरें स्थानांतरित करने के लिए एक समाधान विकसित किया गया था. कोशिकाओं इनक्यूबेटर से हटा दिया है और शांत करने के लिए शुरू कर रहे हैं एक बार, 6% जिलेटिन एक अतिरिक्त धातु एल के साथ कोशिकाओं को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाattice जेल (चित्रा 3 जी) के भीतर एम्बेडेड. प्लेट ठंडा के रूप में, कोशिकाओं को उठा लिया, और जिलेटिन मज़बूत बनाता है. संदंश का प्रयोग, gelatin- जाली और सेल चादर संस्कृति की थाली से एक साथ हटाया जा सकता है; सभी एक ही समय (चित्रा 3H) पर. तो इन तीन घटकों के आधार का निर्माण (चित्रा 3I) के शीर्ष पर रखा जाता है. इधर, सेल शीट (गुलाबी) अंतर्निहित आधार मैट्रिक्स (गुलाबी सेल चादर के नीचे मोटी सफेद मैट्रिक्स) की तुलना में काफी बड़ा है. सेल चादर आसानी से आकार के लिए छंटनी की जा सकती है.

अंतिम सेल पैच (चित्रा 4) पैच आधार और अनुमोदक हाइड्रोजेल का preformed परिसर पर सेल चादर layering द्वारा बनाई गई है. नीचे से ऊपर, पैच hyaluronan हाइड्रोजेल endothelial कोशिकाओं से युक्त, और फिर सेल चादर इस मैट्रिक्स के शीर्ष पर स्तरित है साथ वरीयता प्राप्त एक रेशेदार मैट्रिक्स के होते हैं. प्रारंभिक जिलेटिन / जाली appar के उपयोग के बिना सेल शीट में हेरफेर करने का प्रयासatus (चित्रा -4 ए डी ऊपर से देखा). चित्रा -4 ए Mitotracker लाल के संयोजन एक जल्दी पैच डिजाइन समग्र तस्वीर का प्रतिनिधित्व करता है अक्सर मुड़ा और फटे हुए थे कि बहुत छोटे सेल पत्रक में हुई रंगे RASMC (चित्रा 4 बी), calcein AM हरी फ्लोरोसेंट HuVECs (चित्रा 4C), और प्रेषित प्रकाश छवि (चित्रा 4D). करीब 10x छवियों सेल शीट के लिए आपूर्ति की जाती है और हा / Hydrogel मैट्रिक्स (चित्रा 4E एच) के बिना. चित्रा 4E mitotraker लाल (चित्रा 4F) के समग्र है, calcein AM हरी HuVECs (चित्रा 4 जी) और प्रेषित प्रकाश ( चित्रा 4H). (आधार मैट्रिक्स, हा / HUVEC), और प्रत्येक घटक की सेल चादर चित्र के नीचे से देखने आंकड़े 4I एल में शो है. समग्र चित्र चित्रा 4J एल में प्रतिनिधित्व अलग अलग हिस्सों के साथ, चित्रा 4I है, चित्रा 4J शसेल शीट (लाल), endothelial कोशिकाओं (हरा), चित्रा 4K में हैं और पारेषण छवि (चित्रा 4L) OWS समग्र छवि (चित्रा 4M) मैट्रिक्स के पूरे क्षेत्र को कवर करने के लिए एक समान सेल पत्र के साथ पैच से पता चलता है किसी भी तह या फाड़. बिना 4M पी मैट्रिक्स में ऊपर देख नीचे से भी आंकड़े. चित्रा 4N तटस्थ लाल युक्त, सेल चादर है. शीट मैट्रिक्स के किनारे करने के लिए सीधे सटे इन इलाकों में सिलवटों क्योंकि फिर, मोटी लाल स्ट्रिप्स मैट्रिक्स चारों ओर दिखाई देते हैं. ट्रांसमिशन प्रकाश इमेजिंग (चित्रा 4o) कोशिकाओं की आकृति विज्ञान, और मैट्रिक्स की संरचना से पता चलता है. अंत में (चित्रा 4P), मैट्रिक्स DAPI रूप में एक ही तरंग दैर्ध्य पर fluorescing का एक विशेष गुण है. इसलिए, मैट्रिक्स की पराबैंगनी उत्तेजना स्पष्ट रूप से यह सेल शीट (उज्ज्वल लाल) से अलग देखने के लिए प्रयोग किया जाता है. पैच के किनारों के लिए छंटनी की जा सकतीमैट्रिक्स के किनारों पर लटक रहे हैं कि चादर से किसी किनारों को हटा दें.

चित्रा 1
ऊतक विधानसभा. सेल पत्रक चित्रा 1 फ्लो चार्ट संगम तक पहुँचने और पड़ोसी कोशिकाओं को पार्श्व कनेक्शन स्थापित करने की कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय thermoresponsive pNIPAAM में लिपटे प्लेटों पर कोशिकाओं बोने, और अनुमति से बनाया जाता है. सेल शीट तापमान (पीला डिस्क) को कम करके जारी की है. समवर्ती, endothelial कोशिकाओं रिक्तियों मजबूत आधार रेशेदार मैट्रिक्स की जगह है, और रासायनिक Crosslinked (सफेद डिस्क) में इंजेक्शन, एक neovascular अनुमोदक हा हाइड्रोजेल में एम्बेडेड रहे हैं. सेल शीट (पीला डिस्क) endothelial मैट्रिक्स संयोजन (सफेद) के साथ स्तरित है, जरूरत के रूप में. के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने.

चित्रा 2
बेस मैट्रिक्स और endothelial इनकैप्सुलेशन के 2 छवियाँ चित्रा. (ए) मजबूत आधार रेशेदार मैट्रिक्स एक गोल आकार में मुक्का मारा है. यहाँ व्यास में एक 4 मिमी vivo में पशु मॉडल के आधार पर किया जाता है. आधार मैट्रिक्स (10X) की सतह पर हा हाइड्रोजेल में निलंबित Mitotracker हरे (calcein AM) के साथ दाग (बी) HuVECs. एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का संस्करण.

चित्रा 3
सेल शीट्स की 3 निर्माण चित्रा. (ए) RASMC सीवाणिज्यिक खरीदी से रिहा एक सेल चादर के किनारे की ultured पर 16 घंटा (10X) के लिए 35 मिमी व्यंजन pNIPAAM इलाज. (बी) RASMC 5-7 मिनट के लिए बर्फ पर थाली रखने के बाद उठाया. (सी) छवि thermoresponsive सेल संस्कृति पकवान (10X). (डीएफ) छवियां घर में बनाया pNIPAAM लेपित व्यंजन से सेल चादरों की पीढ़ी के लिए इसी तरह के परिणाम को दर्शाती है. (डी) मिला हुआ RASMC 35 मिमी मानक टिशू कल्चर प्लेट (4X) पर हो. (ई ) ठंडा करने के बाद), सेल चादरें अनुबंधित किया है और वे अलग रूप में (4X मुड़ा. (एफ) के कारण एकल कोशिका शीट की कमजोरी के लिए, सेल चादरें अक्सर) 4X (उठाने या अन्य जोड़तोड़ के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे हैं. (जी) में सेल चादर में छेद कम करने के लिए, एक धातु स्क्रीन सेल पत्रक के हस्तांतरण सहायता करने के लिए एक भौतिक सहायता के रूप में इस्तेमाल किया गया था. RASMC 6% जिलेटिन और एक झरझरा धातु स्क्रीन समर्थन, एक साथ कवर, तटस्थ लाल के साथ दाग रहे थेएन डी कड़ा करने की अनुमति दी. (एच) स्क्रीन समर्थन के साथ, सेल चादरें न्यूनतम क्षति (4X) के साथ स्थानांतरित कर रहे हैं. (मैं) बड़ा RASMC सेल शीट लेयर (गुलाबी रंग) तो मजबूत आधार रेशेदार पैच हाइड्रोजेल संयोजन (तीर) के शीर्ष पर रखा गया था. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
स्तरित सेलुलर पैच. प्रकोष्ठों के 4 चित्र छवियाँ एक pNIPPAM लेपित सतह पर सुसंस्कृत थे और फिर रेशेदार मैट्रिक्स की सतह को एक पत्र के रूप में ले जाया गया. जिलेटिन / धातु जाली के साथ स्थानांतरित नहीं किया गया है कि प्रारंभिक परीक्षणों छोटे फटा हुआ पैच (ई) में हुई. (बी) (ए) समग्र छवि,(बी) Mitotracker लाल और हरे रंग के साथ दाग (सी) HuVECs, और प्रेषित प्रकाश (घ). (ई) मजबूत आधार रेशेदार मैट्रिक्स हाइड्रोजेल संयोजन को रोकने के साथ संयुक्त एक सेल पत्र के समग्र छवि के साथ दाग दो चादरें में RASMCs Calceing हूँ हाइड्रोजेल में निलंबित कर दिया. मजबूत आधार रेशेदार मैट्रिक्स हाइड्रोजेल संयोजन के (एच) ट्रांसमिशन छवि HuVECs (हरा), और (च) Mitotracker लाल RASMCs. (जी) ग्रीन फ्लोरोसेंट HuVECs दाग. (आई) समग्र छवि से देख ऊपर की तरफ मजबूत आधार रेशेदार मैट्रिक्स (दाग नहीं) आधार रेशेदार matrix- के माध्यम के रूप में देखा, हा, HuVECs (हरा), और RASMCs की सेल शीट (लाल), क्रमशः. (जे) लाल फ्लोरोसेंट RASMCs चादर युक्त माध्यम से पैच के नीचे हाइड्रोजेल संयोजन. (कश्मीर) ग्रीन फ्लोरोसेंट HuVECs. (एल) पैच निर्माण के ट्रांसमिशन छवि.(एम) आधार रेशेदार मैट्रिक्स हाइड्रोजेल संयोजन (autofluorescent नीला) पर सेल शीट (लाल) की समग्र तस्वीर. शीट कवर में (एन) कोशिकाओं किनारों पर बेस रेशेदार मैट्रिक्स हाइड्रोजेल संयोजन शो वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति की वजह से है कोशिकाओं के गुच्छन. निर्माण की (ओ) ट्रांसमिशन छवि. (पी) प्राकृतिक रेशे का आधार मैट्रिक्स DAPI (नीला तरंगदैर्ध्य) में autofluorescent है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 1 . कोशिकाओं की चादरों के हस्तांतरण की प्रक्रिया दस्तावेज़ के साथ प्रस्तुत पूरक फिल्म में प्रकाश डाला है. फिल्म शो, कदम के लिहाज से इस प्रक्रिया में, इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाने; 6% जिलेटिन, वीं की प्रविष्टि के साथ मीडिया के प्रतिस्थापनई धातु स्क्रीन, बर्फ पर कोशिकाओं के द्रुतशीतन, एक अन्य पकवान, स्थानांतरण के दौरान कोशिकाओं की एक छवि है, और अंत में चादर से स्क्रीन को हटाने के लिए pNIPAAM लेपित पकवान से कोशिकाओं का स्थानांतरण.

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Discussion

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: thermoresponsive बहुलक साथ थाली सतहों कोटिंग और प्लेटें ठंडा करने के बाद सेल चादरें जोड़ तोड़. विभिन्न कोशिकाओं विभिन्न भौतिक गुणों का प्रदर्शन, क्योंकि adhesivity तरह, उठाने का समय एक अलग सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल की दूसरी, और सबसे महत्वपूर्ण चुनौतीपूर्ण घटक, सेल चादर, ऊतक विधानसभा के लिए तरीकों की एक महत्वपूर्ण पहलू के हेरफेर पर केंद्रित है. सेल चादर में एकल कक्ष परत काफी नाजुक है और संदंश के साथ छेड़छाड़ तो आसानी से फाड़ कर सकते हैं. सेल पत्रक जगह में आयोजित नहीं कर रहे हैं इसके अलावा, जब वे अनुबंध के लिए करते हैं और आसानी से गुना कर सकते हैं. एक सहायक स्क्रीन का उपयोग प्रस्तावित सेल शीट हस्तांतरण कमजोर सेल शीट में हेरफेर एड्स.

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत डिजाइन पद्धति ऊतक इंजीनियरिंग appli की एक किस्म के लिए एक सेल शीट बनाने के लिए एक काफी कम लागत दृष्टिकोण प्रदान करता हैफैटायनों. इसके अलावा, एक विश्वविद्यालय की प्रयोगशाला के भीतर pNIPAAM लेपित प्लेटें बनाने अनेक प्रकार की कोशिकाओं, और सतहों को समायोजित करने के लिए किया जा सकता है प्रोटोकॉल के लिए इस विधि और संशोधनों के साथ मानकीकृत किया जा सकता है. सेल चादरें, बजाय असंगठित एकल कक्षों का उपयोग, ऊतक विधानसभा एड्स, और भी अस्तित्व और प्रत्यारोपित ऊतकों के एकीकरण की संभावना बढ़ सकती है. हालांकि, इन निर्माणों की (नहीं इस प्रोटोकॉल में वर्णित) में विवो वितरण पद्धति प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी. भविष्य अनुप्रयोगों अन्वेषणों और विशिष्ट अंग प्रणालियों के लिए ऊतकों पैदा करने के लिए अनुकूलित के तरीके शामिल हैं.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Calcein-AM Invitrogen C3099 Cell tracker / live dye
Lysotracker Red Invitrogen L7528 Cell tracker
Neutral Red Sigma N7005 Visible Cell dye
pNIPAAM Sigma Aldrich 412780250 Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene Sigma Aldrich 244511-1L
Hexane Sigma Aldrich 296090-1L
RAOSMC Lonza R-ASM-580 Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2 Lonza CC-4149 Smooth Muscle Media
HUVEC Invitrogen C-003-5C Human Venous Endothelial Cells
HyStem Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol VWR International BDH1133-4LP
Trypsin Corning Cellgro 25-053-C1
PBS Gibco 14287-072
FBS Gibco 16140-071
Specific Equipment
Filter paper Ahlstrom  6310-0900 
Buchner Funnel  Sigma Aldrich  Z247308 
UpCell Plates  Nunc  2014-11 
UV light Jelight Company  UVO Cleaner Model No.42

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