माउस में कॉर्नियल neovascularization की एक क्षार जला चोट मॉडल

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Summary

कॉर्निया के neovascularization (NV) कई दृश्य विकृतियों को मुश्किल कर सकते हैं. एक नियंत्रित, क्षार जला चोट मॉडल का उपयोग, कार्निया NV की एक quantifiable स्तर neovascular विकारों के लिए संभावित उपचारों की कार्निया NV और मूल्यांकन की यंत्रवत अध्ययन के लिए उत्पादन किया जा सकता है.

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Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse. J. Vis. Exp. (86), e51159, doi:10.3791/51159 (2014).

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Abstract

सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत, कॉर्निया avascular है, और यह पारदर्शिता अच्छा दृश्य तीक्ष्णता को बनाए रखने के लिए आवश्यक है. आघात, स्वच्छपटलदर्शी या संक्रामक रोग की वजह से हो सकता है, जो कॉर्निया,, के neovascularization (NV) कॉर्निया के तथाकथित 'वाहिकाजनक विशेषाधिकार' टूट जाती है और यहां तक ​​कि अंधापन हो सकता है कि कई दृश्य विकृतियों का आधार बनाता है. कई उपचार के विकल्प होते हैं, कार्निया neovascular विकृतियों से प्रस्तुत मौलिक चिकित्सा की जरूरत unmet की बनी हुई है. सुरक्षित, प्रभावी और लक्षित चिकित्सा के विकास के क्रम में, कार्निया NV और औषधीय हस्तक्षेप की एक विश्वसनीय मॉडल की आवश्यकता है. यहाँ, हम माउस में एक क्षार जला चोट कार्निया neovascularization मॉडल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल कॉर्निया, ब्याज की एक औषधीय परिसर के प्रशासन, और परिणाम के दृश्य के लिए एक नियंत्रित क्षार जला चोट के आवेदन के लिए एक तरीका प्रदान करता है. इस विधि instrumen साबित हो सकता हैताल कार्निया NV और अन्य neovascular विकारों में हस्तक्षेप के लिए तंत्र और अवसरों के अध्ययन के लिए.

Introduction

कॉर्नियल अंधापन सभी मामलों 1 के लगभग 4% के लिए जिम्मेदार अंधापन के चौथे सबसे आम कारण है. कॉर्नियल neovascularization (NV) ददहा स्वचछपटलशोथं (पश्चिम में अंधापन का प्रमुख संक्रामक कारण) और ट्रेकोमा (दुनिया भर में संक्रामक अंधापन का प्रमुख कारण) 2 सहित इन विकृतियों, के कई में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. वर्तमान उपचार स्टेरॉयड, nonsteroidal विरोधी भड़काऊ दवाओं (NSAIDs), विरोधी VEGF चिकित्सा, और एक साथ ही पारंपरिक या लेजर सर्जरी तकनीक 3 CYCLOSPORIN शामिल हैं. हालांकि, कॉर्निया NV आधारित विकृतियों के गंभीर रूप से दुर्बल प्रकृति, शल्य कार्निया NV इलाज करने में सक्षम सुविधाओं, और एक जोरदार प्रदर्शन औषधीय विकल्प की कमी की कमी, वर्तमान उपचारों के बावजूद, बुनियादी चिकित्सा की जरूरत समाप्त करने के लिए हाल ही में एक विशेषज्ञ गोलमेज सम्मेलन का नेतृत्व किया इन विकृतियों से प्रस्तुत 4 unmet की बनी हुई है.

मानव कॉर्निया5 परतों, 3 सेलुलर परतों (उपकला, stromal और endothelium) और 2 इंटरफेस (बोमन झिल्ली और Descemet झिल्ली) के होते हैं. यह आंख के लिए एक यांत्रिक बाधा और अपवर्तक सतह के रूप में कार्य करता है. इसके पारदर्शी स्वभाव उसके घटकों के एक नाजुक संतुलन का नतीजा है और इसके समुचित कार्य 5 का अभिन्न अंग है. आम तौर पर avascular, कॉर्निया सिलिअरी और नेत्र धमनियों से तंग आ चुके हैं जो अपने बाहरी किनारे के साथ चल microvessels से रक्त प्राप्त करता है. एक प्रेरणा उन्हें कॉर्निया के केंद्र की ओर बढ़ती है और इस प्रकार दृष्टि 6 को सीमित करने की अनुमति इन जहाजों के angiogenesis को बढ़ावा देता है जब कॉर्नियल NV होता है. कॉर्नियल angiogenesis कॉर्निया के केंद्र की ओर अंगीय संवहनी आर्केड से रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के अंतर्वृद्धि में परिणाम है, जो hemangiogenesis और lymphangiogenesis शामिल हैं. यह कार्निया "वाहिकाजनक विशेषाधिकार", कॉर्निया अस्पष्टता और फाइब्रोसिस में वृद्धि, कॉर्निया ला के विघटन का एक टूटने की ओर जाता हैyers, और शोफ 7. कार्निया NV की सटीक चलाता है पारंपरिक दवाओं, औद्योगिक रसायन, या यहां तक ​​कि रासायनिक युद्ध एजेंटों के कारण संक्रामक रोग के लिए एक प्रतिक्रिया से ऐसे ट्रेकोमा के रूप में एक रासायनिक प्रेरित राज्य को लेकर कई हैं.

इस प्रक्रिया के आणविक तंत्र के रूप में अभी तक पूरी तरह से विशेषता नहीं हैं; हालांकि, कुछ प्रमुख खिलाड़ियों की पहचान की गई है. सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत कॉर्निया (जैसे घुलनशील VEGF-R1 के रूप में) विरोधी angiogenic कारकों 8 की अनावश्यक सरणी द्वारा बनाए रखा एक अनूठी 'वाहिकाजनक विशेषाधिकार' के पास. हालांकि, (जैसे कि एक चोट के रूप में) एक बाहरी उत्तेजना के जवाब में, समर्थक angiogenic कारकों (जैसे VEGF-ए) के एक स्थानीय upregulation हो जाएगा. इस सुझाव कॉर्निया के वाहिकाजनक विशेषाधिकार underlies, और इसलिए कार्निया विकृति और भी अंधापन 9, जिससे hemangiogenesis, lymphangeogenesis, और सूजन की ओर जाता है कि समर्थक और विरोधी angiogenic कारकों का संतुलन.

<पी वर्ग = "jove_content"> इस बेहद कमजोर कर देने वाली विकृति के unmet चिकित्सा की जरूरत को देखते हुए यह कार्निया NV की एक विश्वसनीय पशु मॉडल है क्षेत्र के लिए ब्याज की है. नियंत्रित क्षार जला चोट: यहाँ हम इस तरह के एक मॉडल प्रस्तुत करते हैं. फिल्टर पेपर के छल्ले के प्रयोग पर आधारित विभिन्न आंख चोट मॉडल 1970 के दशक में 10 के बाद से इस्तेमाल किया गया है. 1989 में, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल के नेत्र रोग विज्ञानियों के एक समूह सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के साथ परिपत्र फिल्टर पेपर के एक टुकड़े भिगोने और एक विशिष्ट श्रेणी के कम से कॉर्निया के लिए आवेदन के आधार पर खरगोश में एक केंद्रीय कार्निया क्षार जला चोट का एक मानक मॉडल की विशेषता सांद्रता 11. तब से, इस तकनीक माउस 12-14 में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया गया है. हाल ही में, वांग प्रयोगशाला एक माउस कार्निया क्षार जला चोट मॉडल 15 का उपयोग कार्निया एनवी के रोगजनन में histone deacetylase (HDAC) अवरोध साहा के उपचारात्मक प्रभाव का अध्ययन किया. यहाँ प्रस्तुत माउस कार्निया क्षार जला चोट मॉडल की कार्यप्रणाली बनाया गया थामुख्य रूप से दो अन्य कागजात 14,16 से पहले काम पर.

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Protocol

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम एक उदाहरण यौगिक के रूप में HDAC अवरोध साहा का उपयोग करें. हालांकि, इस प्रोटोकॉल साहा का उपयोग करने के लिए सीमित तरह से है, और corneal neovascularization पर घुलनशील यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक सामान्य विधि के रूप में सिफारिश की है. मामूली संशोधनों के कमजोर पड़ने की डिग्री के साथ ही आवृत्ति और आवेदन की अवधि के लिए किए जाने की जरूरत होगी. साथ ही, पानी में आसानी से घुलनशील हैं कि यौगिकों DMSO के अभाव में प्रशासित किया जा करने में सक्षम हो जाएगा.

एथिकल विवरण: सभी पशु प्रयोगों केवल राष्ट्रीय कानून और संस्थागत नियमों के अनुपालन में किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल Tulane विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा उपयोग के लिए मंजूरी दे दी थी.

1. (प्रयोग के क्रम में) सामग्री की तैयारी

  1. 2 मिमी हलकों में सेल्यूलोज फिल्टर पेपर (11 माइक्रोन) का एक टुकड़ा काट.
  2. द्वारा NaOH के एक 1 एम समाधान तैयार500 मिलीलीटर आसुत एच 2 ओ में NaOH के 20 ग्राम भंग कमरे के तापमान पर स्टोर. चेतावनी: NaOH समाधान संक्षारक कर रहे हैं और क्षार जलता पैदा कर सकता है.
  3. एक अंतिम 20 मिलीग्राम / एमएल ketamine की एकाग्रता और 4 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine के लिए 1x पीबीएस के 37.5 मिलीलीटर में 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine की 10 से 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर ketamine के मिलीग्राम और 2.5 मिलीलीटर गिराए द्वारा एक संवेदनाहारी कॉकटेल तैयार करें.
  4. फ़िल्टर्ड पीबीएस के 100 मिलीलीटर में proparacaine हाइड्रोक्लोराइड के 500 मिलीग्राम भंग करके (सामयिक analgesia के लिए) proparacaine हाइड्रोक्लोराइड के एक 0.5% समाधान तैयार करें.
  5. 8 छ NaCl, KCl की 0.2 ग्राम, 1.44 जी 2 ना 4 HPO, और आसुत एच 2 ओ की 900 मिलीलीटर में नाह 2 पीओ 4 का 0.23 ग्राम भंग करके 1x पीबीएस तैयार करें 7.4 पीएच को समायोजित करें. बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए आसुत एच 2 हे और फिल्टर के साथ 1,000 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा का हल लाओ.
  6. DMSO के 1 मिलीलीटर में साहा की 26.4 मिलीग्राम भंग करके डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में ~ 100 मिमी पर साहा के 1000 एक्स शेयर समाधान तैयार करें. एक 1x को पतला (~ 10 माइक्रोन)प्रत्येक उपयोग के लिए फ़िल्टर पीबीएस में हल. अप करने के लिए एक महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर. चेतावनी: DMSO एक ज्ञात विष और उत्परिवर्तजन है.
  7. निर्धारण के लिए paraformaldehyde (पीएफए) के एक 4% समाधान तैयार करें. एक रासायनिक हुड के तहत, पीबीएस के 90 मिलीलीटर में पीएफए ​​के 4 जी भंग. 65 डिग्री सेल्सियस तक मिश्रण ले आओ और 7.4 के पीएच के लिए टाइट्रेट. पीएफए ​​भंग कर दिया है, 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा का हल ले आओ. अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर. चेतावनी: पीएफए ​​है ​​एक, एलर्जी उत्पन्न कासीनजन, और विषाक्त होने के लिए जाना जाता है.
  8. पीबीएस के 94.5 मिलीलीटर में बकरी सीरम के 5 एमएल और ट्राइटन X-100 के 500 उल गिराए 1x अवरुद्ध बफर तैयार करें.
  9. पीबीएस के 99.5 मिलीलीटर में ट्राइटन X-100 के 500 उल गिराए 1x धोने बफर तैयार करें.

2. चोट और यौगिक उपचार क्षार जला

  1. 1 एम NaOH का एक समाधान में, व्यास में फिल्टर पेपर के एक दौर टुकड़ा, ~ 2 मिमी भिगोएँ.
  2. क, 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 5 मिलीग्राम / किलो xylazine का एक इंजेक्शन के साथ माउस anesthetizeआईसीएच ~ 25 ग्राम माउस प्रति कदम 1.3 से संवेदनाहारी कॉकटेल के 100 μl है. संज्ञाहरण संज्ञाहरण कोई जवाब नहीं होना चाहिए पर्याप्त है, तो धीरे जानवर के पैर के अंगूठे या पूंछ pinching द्वारा निर्धारित किया जा सकता है ~ संज्ञाहरण की गहराई अंदर स्थापित करने के लिए 1-2 मिनट में लेना चाहिए. नोट: केयर माउस संज्ञाहरण प्रेरित हाइपोथर्मिया का शिकार नहीं करता है यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए.
  3. एक eyedropper का प्रयोग, topically स्थानीय analgesia के लिए corneal सतह को 0.5% proparacaine हाइड्रोक्लोराइड की एक बूंद लागू होते हैं.
  4. बाँझ संदंश का प्रयोग, NaOH लथपथ फिल्टर पेपर के एक टुकड़े उठा. आप अतिरिक्त NaOH को पकड़ या फिल्टर पेपर से टपकता नोटिस, संक्षेप में अतिरिक्त अवशोषित करने के लिए फिल्टर पेपर के एक सूखे टुकड़े पर लथपथ फिल्टर पेपर टैप करें. केंद्रीय कॉर्निया पर NaOH लथपथ फिल्टर पेपर का टुकड़ा रखें. क्षेत्र में ~ 2 एक्स 2 मिमी 2 की भारी क्षार जला उत्पन्न करने के लिए 30 सेकंड के लिए छोड़ दें. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप ठीक से फिल्टर पेपर रखने में सहायक है. नोट: माउस है की केवल एक आँखhould अन्य किसी नियंत्रण के रूप में सेवा के साथ घायल हो.
  5. फिल्टर पेपर निकालें. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, धीरे अवशिष्ट 1 एम NaOH दूर धोने के लिए दो बार 1x पीबीएस के 10 एमएल के साथ नजर फ्लश.
  6. तुरंत 1x साहा काम कर समाधान (या पीबीएस से मिलकर एक वाहन पर नियंत्रण नहीं साहा युक्त DMSO पतला) topically कॉर्निया के लिए की एक बूंद लागू होते हैं. 14 दिनों के लिए आवेदन 3x/day दोहराएँ. नोट: यह चोट के विकास और परिसर के वितरण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में इस अवधि के दौरान एक सामयिक एंटीबायोटिक मलहम की सिफारिश नहीं है. एक तरल एंटीबायोटिक समाधान, जैसे 3% Gentamicin समाधान, बजाय का उपयोग करें.
  7. नैदानिक ​​मूल्यांकन (नीचे प्रोटोकॉल 3) के लिए सीधे आगे बढ़ना या माउस बलिदान और (नीचे प्रोटोकॉल 4) या पारंपरिक आयल / जमे हुए ऊतक विज्ञान कार्निया फ्लैट माउंट के लिए आँखें साफ करना.

3. नैदानिक ​​मूल्यांकन

  1. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत एक अंधा फैशन में चूहों के एक दैनिक परीक्षा प्रदर्शन और सी स्कोरorneal NV कार्निया अस्पष्टता, NV, और पोत आकार के आधार पर. कम से कम दो पर्यवेक्षकों का प्रयोग करें और दो की औसत है कि एक अंतिम स्कोर रिकॉर्ड.
    1. 0-4 के पैमाने पर कार्निया अस्पष्टता स्कोर. 0 = पूरी तरह से स्पष्ट; 1 = थोड़ा धुंधला, आईरिस और शिष्य आसानी से दिखाई; 2 = थोड़ा अपारदर्शी, आईरिस और शिष्य अभी भी पता लगाने योग्य; शायद ही detectable 3 = अपारदर्शी, विद्यार्थियों; और शिष्य की कोई दृष्टि से पूरी तरह से अपारदर्शी = 4.
    2. 0-3 के पैमाने पर NV स्कोर. 0 = नहीं neovessels; कार्निया किनारी पर 1 = neovessels; कार्निया किनारी फैले और कार्निया सेंटर आ 2 = neovessels; कार्निया सेंटर फैले 3 = neovessels.
    3. 0-3 के पैमाने पर पोत आकार स्कोर. 0 = नहीं neovessels; सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत detectable 1 = neovessels; आसानी से सर्जिकल माइक्रोस्कोप के नीचे देखा 2 = neovessels; आसानी से माइक्रोस्कोप के बिना देखा 3 = neovessels.
  2. एक डिजिटल कैमरे का उपयोग, 7 दिन और 14 दिन पर आंख के प्रतिनिधि छवियों ले.

4.कॉर्नियल धुंधला और फ्लैट माउंट

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​में enucleated आंख फिक्स
  2. पीबीएस 1x और ध्यान से अतिरिक्त ऊतक निकालने संदंश का उपयोग करने के लिए आँख स्थानांतरण.
  3. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप की सहायता के साथ, (इस आंख से तरल पदार्थ को रिहा कर देना चाहिए ध्यान दें) आँखों का pericorneal क्षेत्र छेदना के लिए एक सुई (18 गेज) या सूक्ष्म चाकू का उपयोग करें.
    1. खंड 4.3.1 में बनाया वेध से पीछे भाग से आंख (कॉर्निया) का अग्र भाग में कटौती करने के लिए शल्य कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात निर्धारण के लिए वापस 4% पीएफए ​​में कॉर्निया स्थानांतरण
  5. (पीएफए ​​खतरनाक है और संस्थागत नियमों के अनुसार से निपटाया जाना चाहिए सावधानी) और किसी भी अवशिष्ट पीएफए ​​दूर करने के लिए 1x पीबीएस के साथ कॉर्निया तीन बार कुल्ला 4% पीएफए ​​त्यागें.
  6. ऊतक permeabilize और प्राथमिक एंटीबॉडी के अविशिष्ट बंधन को रोकने के लिए कमरे के तापमान पर कम से कम 2 घंटे के लिए 1x अवरुद्ध बफर में सेते.
    1. एक 100-500 गुना कमजोर पड़ने पर, 1x अवरुद्ध बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करें. 1:100 में रक्त वाहिकाओं का पता लगाने के लिए (जैसे चूहा विरोधी माउस PECAM-1, खरगोश विरोधी माउस LYVE -1 मैक्रोफेज का पता लगाने के लिए 1:500 पर लसीका वाहिकाओं का पता लगाने, और / या चूहा anti-mouse-F4/80 के लिए 1:100 पर). 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
    2. पूरी तरह से अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1x धोने बफर के साथ हर बार छह बार धोएं.
    3. 1x एक 500-1,000 गुना कमजोर पड़ने पर अवरुद्ध बफर में एक माध्यमिक एंटीबॉडी लागू करें. (उदाहरण के लिए एक 488 एनएम फ्लोरोसेंट 1:800 में बकरी विरोधी चूहे आईजीजी में चिह्नित या एक 594 एनएम फ्लोरोसेंट 1:800 में बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी में चिह्नित). 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
    4. पूरी तरह से अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रत्येक 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
  7. ताजा 1x पीबीएस में कॉर्निया स्थानांतरण और, एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप की सहायता से, ध्यान फीसदी की दिशा में परिधि से चार चीरोंएर. यह (जिसके परिणामस्वरूप आकार बल्कि एक तितली की तरह दिखना चाहिए) लगभग समान आकार के चार quadrants में कॉर्निया विभाजित है और यह एक स्लाइड पर फ्लैट झूठ करने की अनुमति चाहिए.
  8. फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए एक बढ़ते मध्यम उपयुक्त के साथ माउंट. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, नमूने तुरंत imaged किया जाना चाहिए और डिजिटल फोटो ले लिया, लेकिन 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित कई हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है

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Representative Results

क्षार जला चोट के बाद, कॉर्निया NV एक उम्मीद के मुताबिक, समय पर निर्भर फैशन में होता है. 1 एक अनुपचारित जानवर (चित्रा 1 ए) और HDAC अवरोध साहा (चित्रा 1 बी के साथ इलाज एक पशु के बीच neovascularization और corneal अस्पष्टता में दोनों बुनियादी अंतर को दर्शाता है चित्रा ) 7 दिन का समय बिंदु पर.

आंकड़े 2A और 2B प्राथमिक PECAM-1 और LYVE -1 धुंधला और माध्यमिक एलेक्सा Fluor 488 और 594 धुंधला (क्रमशः) के साथ एक अनुपचारित नियंत्रण आंख की कार्निया फ्लैट माउंट प्रदर्शित करता है. -2 सी और 2 डी के साथ दैनिक इलाज एक आँख पर एक ही धुंधला दिखाने के आंकड़े HDAC अवरोध साहा, hemangiogenesis और lymphangiogenesis दोनों में नाटकीय कमी को ध्यान दें.

आंकड़े 3 ए और 3 बी दो दाग बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं. PECAM -1 blo के लिए एक मार्कर कार्य करता हैआयुध डिपो वाहिकाओं (चित्रा 3), LYVE -1 लसीका वाहिकाओं (3B चित्रा) के लिए विशेष रूप से बांध देता है. दो क्षेत्रों का एक ओवरले lymphangiogenesis बनाम hemangiogenesis की तुलना के रूप में अच्छी तरह से भिन्न सेल आकारिकी की तुलना की अनुमति, चित्रा -3 सी में दिखाया गया है.

पीएफए ​​निर्धारण (4.1 कदम) के बाद, आप आंख के जमे हुए या आयल या तो एम्बेडेड वर्गों उत्पन्न करने के लिए (ऊपर प्रोटोकॉल में विस्तृत नहीं) पारंपरिक सेक्शनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं. यह एक फ्लैट माउंट करता है कि आक्रमण की मात्रा का ठहराव का एक ही स्तर की अनुमति नहीं है, कॉर्निया के बाण के समान वर्गों आप corneal मोटाई और आंख के भीतर ट्यूबों के सापेक्ष गहराई दिखा सकते हैं. 3 डी एफ कॉर्निया के बाण के समान, जमे हुए वर्गों से पता चलता आंकड़े और F4/80 (बृहतभक्षककोशिका धुंधला), या तो DAPI (परमाणु धुंधला), या किसी मर्ज किए गए छवि.

चित्रा 1 चित्रा 1. एक अनुपचारित आँख के सात दिनों के क्षार जला चोट के बाद कोर्नियल neovascularization की प्रगति. (ए) प्रतिनिधि छवि. (बी) एक आँख के प्रतिनिधि छवि हमारे हित के यौगिक (HDAC अवरोध साहा) के साथ प्रति दिन तीन बार का इलाज किया. कार्निया अस्पष्टता और neovascularization में अंतर नोट करें. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक अनुपचारित नियंत्रण (ए और बी) और एक साहा के प्रतिनिधि छवियों (सी और & # इलाजचोट क्षार जला डी) कॉर्निया सात दिनों के बाद (PECAM-1 के साथ संवहनी endothelial सेल धुंधला के और सी) वाइड फ़ील्ड छवि, 160.. (बी और डी) LYVE-1 के साथ लसीका endothelial सेल धुंधला के विस्तृत क्षेत्र छवि. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. PECAM-1 के साथ (ए) संवहनी endothelial सेल धुंधला हो जाना. (बी) LYVE-1 के साथ लसीका endothelial सेल धुंधला हो जाना. (सी) PECAM-1/LYVE-1 धुंधला विलय कर दिया. (डी) एक बाण के समान जमे हुए खंड में मैक्रोफेज की F4/80 धुंधला हो जाना. (ई) DAPI सेंटएक बाण के समान कटौती जमे हुए खंड में सेल नाभिक की aining. (एफ) F4/80 और DAPI धुंधला विलय कर दिया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल यह इन तीन (अंतर्संबंधित) प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श व्यवस्था है, जिससे hemangiogenesis, lymphangiogenesis, और सूजन की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के स्तर में यह परिणाम है. इस विधि केंद्रीकृत कार्निया NV, छर्रों 18 व्यक्त वृद्धि कारक कॉर्निया 17 की अर्थात् suturing अधिक निर्देशित NV, पैदा करने के लिए विकसित और प्रत्यारोपित किया गया है कि कई तरीकों पैदा करता है, वहीं यह भी ब्याज की हो सकती है. हमारे प्रोटोकॉल भी बड़ा स्तनधारियों के लिए अभी तक उपलब्ध नहीं आणविक और ट्रांसजेनिक तकनीक की एक मेजबान का पूरा लाभ लेने के लिए एक प्रयोगशाला की अनुमति है जबकि पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए एक आसान प्रदान करने, वयस्क माउस में इस्तेमाल के लिए बनाया गया है. ऊपर प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम विस्तार एक C57BL/6J पृष्ठभूमि पर चूहों का उपयोग. सूरजमुखी मनुष्य चूहे भी उपयुक्त होगा और आसान इमेजिंग के लिए उपलब्ध करा सकता है; हालांकि, हाल ही में एक अध्ययन सूरजमुखी मनुष्य चूहों की neovascular प्रतिक्रिया 19 के रूप में नाटकीय नहीं किया जा सकता है दर्शाता है. इसके अलावा, कई के विपरीतअन्य neovascularization मॉडल, कॉर्निया NV एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से या यहाँ तक कि नग्न आंखों से परीक्षा के साथ रन बनाए जा सकते हैं. Neovascularization की हद तक का एक और अधिक कठोर मात्रा का ठहराव आवश्यक है, तो दाग फ्लैट पर्वत की डिजिटल चित्र सॉफ्टवेयर संकुल के एक नंबर के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है, Photoshop CS4 के साथ ऐसा करने का एक उदाहरण एट अल कोनर, में देखा जा सकता है. 20 हाल ही प्रकृति प्रोटोकॉल पत्र "माउस में ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी की मात्रा".

Proparacaine हाइड्रोक्लोराइड एक सामयिक समाधान (यह इस परिवार के अन्य सदस्यों को भी उतना ही स्वीकार्य होगा कि संभव है) के रूप में लागू एक एमिनो एस्टर एनाल्जेसिक है. पशु प्रक्रिया के लिए सामान्य संज्ञाहरण के अंतर्गत रखा गया है, भले ही हम अतिरिक्त सामयिक पीड़ानाश कॉर्निया को पूर्ववत दर्द को रोकने के लिए एक नैतिक आवश्यकता समझे. यह पीबीएस अपने परिसर पतला और आंख फिल्टर किया फ्लश करने के लिए इस्तेमाल किया और वें भर में स्वच्छ रखा जरूरी है किई प्रक्रिया (प्रत्येक उपयोग से पहले संदूषण के स्पष्ट संकेत के लिए जाँच). पीबीएस व्यक्ति प्रयोगशाला परंपरा पर आधारित के लिए कहा जाता है; किसी भी बराबर संतुलित नमक समाधान वांछित परिणाम प्राप्त करना चाहिए. इसी तरह, यहाँ प्रस्तुत immunohistochemistry प्रोटोकॉल का संशोधन अन्य स्रोतों से एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने की आवश्यकता की डिग्री यानी) का इस्तेमाल कर रहे हैं के लिए बुलाया जा सकता है.

इस प्रक्रिया का सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण भागों NaOH लथपथ फिल्टर पेपर की प्रारंभिक नियुक्ति और कॉर्निया का विच्छेदन कर रहे हैं. हम दोनों तकनीकों से पहले वास्तविक प्रक्रिया के लिए अभ्यास किया जा सलाह देते हैं. फिल्टर पेपर सभी पक्षों से neovascularization की एक समान स्तर को बढ़ावा देने के क्रम में कार्निया के केंद्र में रखा जाना चाहिए. ऑफसेट के किसी भी डिग्री माउस से माउस को परिवर्तनशीलता के एक उच्च स्तर का निर्माण करेगा. कॉर्नियल विच्छेदन मैनुअल निपुणता का एक अच्छा सौदा की आवश्यकता है. आँख pericorneal क्षेत्र छेदना करने का प्रयास करने के जवाब में ख़राब होने की संभावना है.हम प्रारंभिक कटौती करने और अंदर दबाव जारी एक तेज, छोटे गेज सुई का उपयोग करना चाहिये. एक प्रारंभिक पंचर हो जाने के बाद, शल्य कैंची की एक जोड़ी छेद में डाला और पीछे आंख कप से आंख की पूर्वकाल को अलग करने के लिए एक काल्पनिक रेखा के साथ कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. धीरे धीरे और सावधानी से कार्य करना एक अक्षुण्ण कॉर्निया उपज चाहिए.

यह इस प्रोटोकॉल का प्राथमिक उद्देश्य कार्निया क्षार जला चोट के उपचार में विभिन्न यौगिकों की प्रभावकारिता परख है, जबकि यह भी कार्निया घाव फिर से epitheliaztion, कॉर्निया फाइब्रोसिस, और अंगीय उपकला स्टेम अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए सेल नवीकरण. इसके अलावा, यह रोग hemangiogenesis, lymphangiogenesis, और सूजन के तंत्र का पता लगाने के लिए एक सामान्य मॉडल के रूप में कार्य करता है. प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया जा सकता है जिसके साथ रिश्तेदार आसानी के रूप में अच्छी तरह से अपनी noninvasive प्रकृति के रूप में, vivo में यौगिक स्क्रीनिंग, प्रभावकारिता परीक्षण के लिए एक आकर्षक अवसर प्रस्तुत करता हैएस, और रोग angiogenesis के लिए सम्मान के साथ ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की विशेषता.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि की तैयारी में डा. Xinyu ली की मदद के लिए आभारी हैं. पश्चिम Tulane विश्वविद्यालय, UT दक्षिण मेडिकल सेंटर, एनआईएच अनुदान EY021862, दृष्टिहीनता फाउंडेशन को रोकने के लिए अनुसंधान से एक कैरियर विकास पुरस्कार से राष्ट्रपति का अनुसंधान परिषद नई अन्वेषक पुरस्कार, और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन रिसर्च में एक तेज फोकस पुरस्कार से एक स्टार्टअप निधि द्वारा समर्थित किया गया .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml Syringe BD 309659
18 G Needle BD 305918
10 ml Syringe BD 306575
25 G Needle BD 305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse) AbD Serotech MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) Abcam ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) BD 553370
Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) Invitrogen A11006
Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) Invitrogen A11012
Camera Tucsen TCC 5.0 ICE
Coverslips Fisher 12-548-B
DMSO Sigma D4540-1L Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris WPI 15915
Forceps (Sharp), Dumont #4 WPI 500340
KCl Fisher P217-500
Ketamine Solution MedVet RXKETAMINE Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope AmScope LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X) AmScope SM-1B
Mounting Medium, VECTASHIELD Vector H-1000
NaCl Fisher S271-10
NaH2PO4 Fisher S397-500
NaOH Fisher S318-1 Caution: Corrosive
Paraformaldehyde P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride Sigma P4554-1G
Scissors (5 mm blade), Vanas WPI 14003
Goat Serum MPBio 92939249
Microscope Slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-6508
Xylazine Solution MedVet RXANASED-20

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References

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