从人骨骼肌隔离血管源性多能前体

Biology

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Summary

人体骨骼肌肉的海港几个多系前驱体的人口,是理想的可再生应用血管内。这种隔离方法允许3多能前体细胞群的同时纯化分别从血管三个结构层次:从内膜肌内皮细胞,从媒体的周细胞,并从外膜外膜细胞。

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Chen, W. C. W., Saparov, A., Corselli, M., Crisan, M., Zheng, B., Péault, B., Huard, J. Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (90), e51195, doi:10.3791/51195 (2014).

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Abstract

由于间充质干细胞/基质细胞(MSCs)的发现,本土身份和干细胞的定位一直被掩盖着他们的文化追溯隔离。近年来,使用荧光激活细胞分选(FACS),我们和其他研究人员前瞻性地识别和纯化的人类骨骼肌的脉管系统相关联的多能前体细胞三个亚群。这三个细胞群:肌内皮细胞(的MECs),周细胞(PCS)和外膜细胞(ACS),分别定位于血管的三个结构层次:内膜,媒体和外膜。所有这些人的血管源性干细胞(hBVSC)的人群,不仅表达经典的MSC标志,而且具有类似于典型的中胚层干细胞的发育潜能。此前,的MECs,PC和无线控制器已经通过不同的协议隔离,随后其特征在于,独立的研究。当前隔离普罗特ocol,通过修改隔离工艺和调整的选择性细胞表面标志物,可以让我们同时净化三个hBVSC亚群流式细胞仪从一个单一的人体肌肉活检。这种新方法不仅简化多个BVSC亚群的隔离也方便hBVSCs为不同的治疗目的,未来的临床应用。

Introduction

人体骨骼肌肉一直被认为是一种临床上有吸引力的干/祖细胞的来源。骨骼肌包含不仅致力于肌祖细胞,成肌细胞,而且原始肌干细胞,包括卫星细胞和肌源性干细胞(肌源性干细胞)1。利用人体肌源性干细胞/祖细胞,自体或异体,在再生医学的已被广泛地研究在临床前动物模型和临床试验。肌肉干细胞/祖细胞的再生应用范围从再生在杜兴肌营养不良(DMD)患者的营养不良的肌肉来修复患者的受损心脏与心脏发作。

自间充质干细胞/基质细胞(MSC)和其它多能前体细胞群,其中包括骨髓来源的多能成体祖细胞(MAPC的)和脂肪来源的干细胞(ADSC中),成体干/的发现祖细胞已被广泛研究,以时间1-9。然而, 在原地家乡的身份和定位一直被掩盖着的回顾性分离方法。近年来,使用荧光激活细胞分选(FACS),我们和其他团体已前瞻性地确定和纯化3多能来自于人骨骼肌血管和其它几种器官的前体细胞群:肌源性内皮细胞(的MECs),周细胞(如PC),和外膜细胞(ACS)10。内膜,中膜和外膜:人类血管来源的干细胞(hBVSCs)这三个亚群可以在血管中的三个结构层可以分别找到。更具体地讲,的MECs和PC的微血管和毛细血管被检测,而AC均为定位于较大的动脉和静脉外膜层。每个前体细胞亚群表达的细胞表面抗原的独特组合:的MECs(CD34 + / 56 + / 144 + / 45 - ),个人电脑(CD146 + / 34 - / 45 - / 56 - ),和AC(CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 - )。

这些hBVSC亚群的进一步鉴定表明,所有三个前体细胞群具有类似于典型的干细胞,包括骨骼肌肉发育,成骨,软骨,脂肪形成和中胚层发育的潜力。所有hBVSC子集也表现出经典的MSC标志,包括CD44,CD73,CD90,和CD105,新鲜和文化。总的来说这些证据支持干细胞的血管起源。此外,的MECs,PC和无线控制器的治疗能力,最近被证明在独立的研究。排序的MECs从成人的肌肉活检显示再生受伤,营养不良骨骼肌和修复受损的心肌更有效地比骨骼肌成肌细胞和血管内切thelial细​​胞(EC)。从不同的人体器官纯化的电脑也已显示修复/再生损伤和营养不良骨骼肌和向卫星细胞池13-16。最近,我们已经证明,从人骨骼肌来源的电脑有效修复通过间接的旁分泌作用和直接的细胞相互作用17的梗塞心肌。 AC的,另一方面,已经可以直接分离自外植血管或通过FACS从人脂肪组织和骨骼肌纯化。 AC的一个显着的促血管生成作用表现在小鼠后肢缺血模型19。此外,无线控制器也被证明比传统的MSC更有效地修复心肌梗死,表示在局部缺血组织修复20 AC的鲁棒治疗潜力。

目前的纯化方案补助的同时,的MECs,个人电脑未来的净化和AC的从一个人类骨骼肌活检的血管。这使我们能够研究和/或选择最佳的hBVSC亚群的不同的治疗目的。此外,这种新技术进一步扩大,可从人骨骼肌衍生干细胞/祖细胞的剧目,使得它的多能前体细胞用于再生医学的一个理想的来源。

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Protocol

1,肌肉活检处理

  1. 保存在冰上人骨骼肌活检中的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM),补充有5%胎牛血清(FBS)和1%青霉素 - 链霉素运输过程中(P / S)。
  2. 在接收到肌肉活检后,除去从运输容器中的检体和在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中补充有在无菌条件下的2%抗生素 - 抗真菌溶液(A / A)的两次洗涤。
  3. 除去附着的脂肪和结缔组织,用无菌剪刀和镊子的DMEM补充有2%A / A。
  4. 解剖显微镜下去掉大的血管,并随后切开肌肉标本切成小块(<1cm 2的面积)。
  5. 保持切口肌片(<5克),在20毫升的保存介质(PM; DMEM补充有10%FBS和1%P / S)在4℃至5天。

2,肌肉Dissociat离子与细胞分离

  1. 上的细胞分离的日子,从PM去除肌肉块,在PBS中洗两次,补充有2%P / S。为了使消化液,加I型,II型和IV型胶原酶(100毫克/毫升)新鲜到下午。
  2. 切碎并机械剁碎肌肉块,用无菌剪刀和镊子在培养皿用少量的PM,直到溶液通过10毫升血清吸液管与无凝块。在此过程中除去残留的脂肪和结缔组织。至少使用8-10克,成人的肌肉或2克胎儿肌肉的每一个细胞分离的。
  3. 转4-5克剁碎成肌〜20毫升(或2克剁碎胎儿肌肉成10毫升)与国税发10毫升血清移液管消解液。消化为50 - 60分钟,在37℃在轨道摇床上于70 - 80转。通过调节消化时间和/或搅拌速度相应地基于所述量优化细胞产率和表面抗原的保存组织。观察消化状况每次15-20分钟,直到浊度几乎清除。
  4. 大力吸取消化组织3-5次10毫升血清吸管。加入相等量的PM,使反应停止,然后离心分离,在400×g离心4分钟。
  5. 小心取出上清液;重悬沉淀用10毫升PM洗,然后通过一个100微米的细胞过滤网过滤。
  6. 离心400×g离心4分钟,小心取出上清液。重悬粒料在红细胞裂解缓冲液(155 mM的氯化铵 ,10mM的KHCO 3,0,1mM EDTA)中,过滤通过70微米的细胞过滤网,以获得单细胞悬浮液,然后下室温温育10分钟。经过70m的细胞过滤器再次过滤,如果观察到任何沉淀。
  7. 离心机在400×g离心4分钟,并重新悬浮于0.5ml PBS中的细胞沉淀。计数细胞的数目。得到总共至少5百万个细胞的细胞分选。淡化SINGLë细胞悬液,以每毫升少于5百万个细胞,用PBS进行染色。取出50-100微升的细胞悬浮液和分割成11个管用于控制染色(未染色的对照,阴性对照,与单色阳性对照)。

3,细胞标记和排序

  1. 孵育的单细胞悬浮液10分钟,在小鼠血清(在PBS中按1:10稀释)4℃阻断目的,如果有必要的。
  2. 加入CD34-APC,CD45-APC-Cy7的,CD56-PE-Cy7的,CD144-PE,和CD146-FITC(所有1:100)成单细胞悬浮液,并温育20分钟,在4℃。为阴性对照,添加当量浓度APC-,APC-Cy7-,PE-Cy7-,PE-和FITC缀合的同种型IgG抗体,孵育20分钟,在4℃。对于单色阳性对照,加入等量浓度的CD34-APC,CD45-APC-Cy7的,CD56-PE-Cy7的,CD144-PE,和CD146-FITC的单独向每个管中,孵育20分钟,在4℃。
  3. 孵化后,离心机在400×g离心4分钟,洗。重悬在1细胞沉淀 - 2毫升的DMEM补充有5%FBS和1%P / S。将细胞悬浮液的最终浓度应为每毫升少于5百万个细胞。加入7-AAD(1:100)孵育15分钟,在RT下死细胞排除。为阴性对照和单色阳性对照,以0.5毫升的DMEM补充有5%FBS和1%P / S的重悬细胞沉淀。
  4. 转移所有细胞悬液,以圆底聚苯乙烯流式细胞仪管。制备细胞收集管(每管是预填充用500μl适当的培养基:MPM对的MECs; EGM-2的个人电脑;交流介质为ACS)。运输的细胞悬浮液在冰上的细胞分选器。
  5. 同时调节激光强度,信道补偿和细胞群门控严格最大化单元P上的未染色的对照,阴性对照,单色阳性对照,而主要的细胞悬浮液的顺序进行细胞分选仪上运行的细胞悬浮液urity(请参考由朱庇特和其他刊物的流动细节仪发表的文章)。
  6. 收集在合适的收集管所需的细胞群。商店收集到的细胞在4℃,如果不立即播种。

4,邮政分拣细胞培养

  1. 种子新鲜排序的MECs(P0)在<10,000细胞/ cm 2在MPM上板预涂覆有I型胶原蛋白。对于的MECs随后传代,种子3,500 - 4,000个细胞/厘米2的MPM到板/瓶预包被I型胶原蛋白。
  2. 种子在EGM-2刚整理电脑(P0),在<20000个/ cm 2的平板上新涂0.2%明胶。 3比在PC培养基(DMEM,用20%FBS和1%P / S补充)到正规的聚苯乙烯培养板,直到P2:用于PC的随后的传代,以1分裂细胞。从P3以后,种子细胞在6,500 - 7,000个细胞/厘米2的PC媒体上经常聚苯乙烯培养板/瓶。
  3. 种子新鲜排序的AC(P0)在<20000细胞/ cm 2在AC培养基(DMEM补充有20%FBS和1%P / S)到正规聚苯乙烯培养板中。对于随后的传代AC的种子细胞在6,500 - 7,000个细胞/厘米2的交流媒介上经常聚苯乙烯培养板/瓶。

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Representative Results

基于来自未染色的对照,阴性对照,以及单色阳性对照而获得的数据的FACS参数被首先校正。排除死细胞后,荧光标记的细胞悬浮液进行了一系列的阴性和阳性的细胞表面标记物的选择。首先,CD45 +细胞被选通的CD56 +和CD56前-细胞从CD45分离的-部分。的CD56 +级分进一步进行CD34-CD144的选择,其中只有CD34 + / CD144 +(双阳性)细胞中被标记为的MECs(CD34 + / 56 + / 144 + / 45 - ),随后收集( 图1)。类似地,CD56 -馏分进一步进行CD34-CD146的选择,其中只有CD34 - / CD146 +细胞被标记为个人电脑(CD146 + / 34 - / 45 - / 56 - ),随后收集( + / CD146 -分数进行附加的阴性CD31选择排除内皮细胞(CD34 + / CD31 +),并且仅CD34 + / CD31 -的子集被标识为AC的(CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 - ),收集( 图1)。为了简化该过程,CD144可被用来替代CD31排除内皮细胞。

新鲜分选的细胞可以接种在协议进一步扩展指定的培养条件下或立即用于体内实验。 hBVSC亚群的克隆扩增可以通过流式细胞仪唱腔autoclone系统或有限稀释法13,21来实现。不像典型的非均相的MSCs,hBVSC亚群的培养物,即使经过长期的扩张保持均匀。培养hBVSC亚群代表形态,从肌肉活检法单一供体,示于图2。典型的MSCs和纯化hBVSC亚群之间的比较总结于表1中

图1
人体血管干细胞(hBVSCs)从一个单一的人骨骼肌活检。每个分类的细胞群的纯度的三个子集的图1代表性的排序是由后排序分析进一步证实。 请点击这里查看更大的版本这个数字。

图2
图2:这三个hBVSC亚群,排序,以同质性,表现出不同的形态在Culture(左到右):肌内皮细胞(MEC),周细胞(PC)和外膜细胞(AC)(在第4代,比例尺= 100毫米)。 请点击这里查看该图的放大版本。

干细胞的MECs 电脑无线控制器
纯度异构
对于纯化的细胞表面抗原信息不适用 CD34 + CD45-CD56 + CD144 + CD31 - CD34 + CD45-CD146 -
在海安文化标志物表达 CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + CD29 + CD44 + CD90 + CD105 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 +
多能成肌(+),脂肪生成(+),成骨(+),软骨(+) 成肌(+),脂肪生成(+),成骨(+),软骨(+) 成肌(+),脂肪生成(+),成骨(+),软骨(+) 成肌(N / A)脂肪生成(+)成骨(+),软骨(+)
潜在的应用 Skeletomuscular修复/恢复:骨,软骨,肌腱,韧带和骨骼肌;心脏修复;血管修复;伤口愈合;免疫调节心脏修复;骨骼肌修复/再生;骨/软骨修复/再生心脏修复;血管修复/恢复;骨骼肌修复/再生;骨再生心脏修复;血管修复/恢复;骨再生
原位解剖定位不适用血管内膜血管媒体血管外膜

表1比较典型的干细胞和多能hBVSC亚群。

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Discussion

hBVSC亚群的鉴定和纯化代表海安个体发育的理解的一个重大进展。有越来越多的证据表明MSCs的血管周围的起源和组织特异性前体细胞和血管22-25之间的关联。此外,容量以分离均相亚hBVSCs的进一步有助于MSC异质性和血管细胞生物学26的理解。

在过去的几年中,的MECs,PC和无线控制器已经被单独识别并通过独立的研究不同的协议隔离。然而,没有尝试了同时净化所有三个hBVSC亚群从人骨骼肌由于该困难,以优化组织分离程序和选择性的细胞系标记识别的MECs,个人电脑,和AC共结合。在这里,我们描述了一种新的细胞分离协议,允许并发PURIF的MECs,PC和无线控制器从一个单一的人体肌肉活检通过修改组织解离过程和应用的选择性细胞表面标志物的新组合( 图1)ication。对于最好的结果,在当前的协议,该协议需要额外注意的关键步骤包括:1,新鲜度和保存的组织样品; 2,优化的细胞产率和表面抗原保存通过仔细监测消化过程中,调整组织解离时间;六色的3精确校准流式细胞仪。这些参数是由单个实验室根据其特定的供应/设备安装确定。

通过实施这种新的协议,可以不仅简化多个hBVSC亚群的同步分离也便于利用hBVSCs的基础研究和翻译应用,如HBVS之间差的细胞行为的比较Ç亚群和单个或组合hBVSC子集(S)的各种个性化的治疗应用的优化。然而,所有这三个hBVSC子集的并发隔离目前仅限于骨骼肌中,由于这样的事实的MECs尚未在其它人组织中鉴定。此外,它是超出了当前协议来区分这三个hBVSC亚群之间的过渡和/或蜂窝层次的限制。

表征新鲜分离和体外培养的MECs,PC和无线控制器已经在以前的研究中的MECs被单独体现在文化保持肌源性标记CD56的表达,但逐渐失去的欧盟标志物CD34和CD144的表达。在克隆水平的MECs表达MSC标记物,包括CD29,CD44,CD90,和CD105,并显示充质分化潜能,如软骨,骨,脂肪细胞分化,和成肌。此外,克隆的MECs保留其angiogen集成电路容量长期培养后,形成在基质胶培养毛细血管样网络和参与新血管形成的体内 21。

电脑,新鲜或培养的,已显示出,不仅表达MSC标记物,包括CD44,CD73,CD90,和CD105,而且也显示出中胚层发育的能力,例如,骨骼肌成肌,骨,软骨,脂肪生成和13。电脑鲁棒分泌许多营养因子,即使在低氧条件下,和作为通过其旁分泌功能,直接分化,并在组织修复/再生过程的AC,PC类似的细胞相互作用的再生单元,分别显示表达经典的MSC标记并分化为主要的间质细胞系18。连同个人电脑,无线控制器还提出了作为干细胞的发育起源之一。比较所述细胞表面标记物的表达,分化能力,而p的概要典型的干细胞和hBVSCs之间ossible翻译应用程序已列于表1。近日,从大血管在大鼠和人类的29中膜Tang 等人多能确定血管干细胞(MVSCs)。 MVSCs不仅分化成平滑肌细胞,但血管损伤29后也有助于血管重塑和新生内膜增生。无论MVSCs居住在微血管和小血管BVSCs分享发展的连接需要进一步调查。

目前的协议需要得到新鲜的人体肌肉活检,其中,有时可能无法在临床上可访问的适时细胞分离。备选地,基于选择性细胞表面标记物的改性组,这是可行的流动,净化从冷冻保存的人原代骨骼肌细胞培养的MECs和PC仪30。此方法允许准PURIF从治疗目的编组人骨骼肌培养ication两个hBVSC子集。然而,由于缺乏对培养的人类肌细胞CD34表达的,这是不可能的,以进一步分离的AC与这个特定的协议。

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Acknowledgments

作者要感谢艾莉森洛加尔她用流式细胞仪卓越的技术援助。这项工作是由美国国防部(JH),亨利·J·曼金基金全人教育教授(JH),以及教育和哈萨克斯坦共和国科学部(AS)的资助。 CWC在由美国心脏协会博士前奖学金(11PRE7490001)部分得到了支持。 M.Corselli是由美国加州再生医学研究所的训练津贴(TG2-01169)的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase type 1 Sigma C5894 Sterile vial
Collagenase type 2 Sigma C1764 Sterile vial
Collagenase type 4 Sigma C1889 Sterile vial
Anti-human CD34 APC BD Pharmingen 555824 Keep sterile
Anti-human CD45 APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
Anti-human CD56 PE-Cy7 BD Pharmingen  557747 Keep sterile
Anti-human CD144 PE Beckman Coulter A07481 Keep sterile
Anti-human CD146 FITC AbD Serotec MCA2141F Keep sterile
FACS Aria II Flow Cytometer Becton-Dickinson
EGM-2 complete medium Lonza CC-3162 For culturing PCs (only P0)
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate Invitrogen 11965 For culturing PCs
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate Invitrogen 11995 For culturing MECs and ACs
Fetal bovine serum Invitrogen 10437-028
Heat-inactivated horse serum Invitrogen 26050-088
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122
Antibiotic-antimycotic (100X) Invitrogen 15240-062
Trypsin-EDTA 0.5% (10X) Invitrogen 15400-054
Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium Invitrogen 14190-250
Chick embryo extract Accurate Chemical CE650T-10 Filter before use

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References

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