Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

Biology

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Summary

I vasi sanguigni all'interno del porto muscolo scheletrico diverse popolazioni precursori multi-lignaggio umane che sono ideali per applicazioni rigenerative. Questo metodo di isolamento permette la purificazione simultanea di tre popolazioni di cellule precursori multipotenti rispettivamente da tre strati strutturali dei vasi sanguigni: cellule endoteliali da miogenici intima, periciti dai media, e le cellule avventiziali da avventizia.

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Chen, W. C. W., Saparov, A., Corselli, M., Crisan, M., Zheng, B., Péault, B., Huard, J. Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (90), e51195, doi:10.3791/51195 (2014).

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Abstract

Dalla scoperta delle staminali / cellule stromali mesenchimali (MSC), l'identità originaria e la localizzazione delle MSC sono state oscurate dal loro isolamento retrospettiva nella cultura. Recentemente, con l'ordinamento delle cellule fluorescenza-attivato (FACS), noi e altri ricercatori prospetticamente identificato e purificato tre sottopopolazioni di cellule precursori multipotenti associate alla vascolarizzazione del muscolo scheletrico umano. Queste tre popolazioni di cellule: cellule endoteliali miogeniche (MECS), periciti (PC), e le cellule avventiziali (ACS), sono localizzati rispettivamente ai tre strati strutturali dei vasi sanguigni: intima, media e avventizia. Tutte queste cellule staminali del sangue-nave-derivato umano (hBVSC) popolazioni esprimono non solo i marcatori MSC classiche, ma possiedono anche le potenzialità di sviluppo mesodermiche simili a MSC tipici. In precedenza, MECS, PC e AC sono state isolate tramite protocolli distinti e successivamente caratterizzato in studi separati. L'attuale prot isolamentoOcol, attraverso modifiche al processo di isolamento e le rettifiche dei marcatori di superficie delle cellule selettive, ci permette di purificare contemporaneamente tutte e tre le sottopopolazioni hBVSC da FACS da una singola biopsia muscolare umana. Questo nuovo metodo non solo snellire l'isolamento di più sottopopolazioni BVSC ma facilitare anche le future applicazioni cliniche di hBVSCs per diversi scopi terapeutici.

Introduction

Muscolo scheletrico umano è stato considerato una fonte clinicamente attraente di cellule staminali / progenitrici. Il muscolo scheletrico non contiene solo impegnata progenitori miogenici, mioblasti scheletrici, ma anche le cellule staminali miogeniche primitive, comprese le cellule satelliti e cellule staminali derivate dal muscolo (MDSCs) 1. L'uso di cellule umane di derivazione muscolari staminali / progenitrici, autologo o allogenico, nella medicina rigenerativa è stato ampiamente studiato in modelli animali preclinici e sperimentazioni cliniche. Le applicazioni rigenerative delle cellule staminali / progenitrici muscolari vanno dalla rigenerazione del muscolo distrofico nella distrofia muscolare di Duchenne (DMD) pazienti per riparare il cuore danneggiato nei pazienti con infarto.

Dalla scoperta delle staminali / cellule mesenchimali stromali (MSC) e di altre popolazioni di cellule precursori multipotenti, comprese le cellule multipotenti derivate dal midollo osseo progenitrici adulto (MAPCs) e le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSCs), staminali adulte /cellule progenitrici sono stati ampiamente studiati fino ad oggi 1-9. Tuttavia, la loro identità originaria e localizzazione in situ sono state oscurate dai metodi di isolamento retrospettivi. Recentemente, utilizzando cellule fluorescenza-attivato (FACS), noi e altri gruppi hanno prospetticamente identificato e purificato tre popolazioni di cellule precursori multipotenti da vasi sanguigni all'interno del muscolo scheletrico umano e diversi altri organi: cellule endoteliali miogenici (MECS), periciti (PC), e le cellule avventiziali (ACS) 10. Questi tre sottopopolazioni di cellule umane staminali-vasi sanguigni derivati ​​(hBVSCs) si trovano, rispettivamente, nei tre strati strutturali dei vasi sanguigni: tunica intima, tonaca media, e la tunica avventizia. Più in particolare, MECs e PC sono rilevati in microvasi e capillari mentre ACS sono localizzate nello strato avventizia delle arterie più grandi e le vene. Ogni sottoinsieme di cellule precursori esprime una combinazione unica di antigeni di superficie cellulare: MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) e AC (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).

Ulteriore caratterizzazione di questi sottoinsiemi hBVSC ha rivelato che tutti e tre popolazioni di cellule precursore possiedono potenzialità di sviluppo mesodermiche simili a MSC tipici, tra cui miogenesi scheletrica, osteogenesi, condrogenesi, e adipogenesi. Tutti i sottoinsiemi hBVSC mostrano anche i marcatori MSC classici, tra cui CD44, CD73, CD90 e CD105, al momento e nella cultura. Collettivamente questi elementi di prova sostenuto l'origine vascolare delle MSC. Inoltre, le capacità terapeutiche di MECs, PC e AC sono stati recentemente dimostrato in studi separati. MECs ordinati da biopsie muscolari umane adulte sono stati mostrati per rigenerare i muscoli feriti e distrofici scheletriche e riparazione feriti miocardio più efficiente di mioblasti scheletrici e endo vascolarecellule thelial (ECS). PC purificato da diversi organi umani hanno anche dimostrato di riparare / rigenerare i muscoli scheletrici feriti e distrofiche e contribuire al pool delle cellule satellite 13-16. Molto recentemente, abbiamo dimostrato che i PC derivate dal muscolo scheletrico umano riparare efficacemente il miocardio infartuato mediante effetto paracrino indiretta e interazioni cellulari dirette 17. ACs, d'altra parte, sono stati direttamente isolata dai vasi sanguigni espiantati o purificato mediante FACS da tessuto adiposo umano e muscolo scheletrico. Una notevole effetto pro-angiogenico di ACS è stata dimostrata in un topo arti posteriori modello di ischemia 19. Inoltre, ACS hanno anche dimostrato di riparare il miocardio infartuato più efficiente rispetto MSC convenzionali, indicando il robusto potenziale terapeutico di ACS in ischemico riparazione dei tessuti 20.

L'attuale protocollo prevede la purificazione simultanee, prospettico purificazione di MECS, PC, eACs dal sistema vascolare di un singolo biopsia muscolare scheletrico umano. Questo ci permette di studiare e / o scegliamo la sottopopolazione hBVSC ottimale per diversi scopi terapeutici. Inoltre, questa nuova tecnica amplia ulteriormente il repertorio di cellule staminali / progenitrici che possono derivare dal muscolo scheletrico umano, che lo rende una fonte ideale di cellule precursori multipotenti per la medicina rigenerativa.

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Protocol

1 Biopsia muscolare Processing

  1. Preservare biopsia muscolare scheletrico umano su ghiaccio in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) addizionato con siero fetale bovino 5% (FBS) e 1% penicillina-streptomicina (P / S) durante il trasporto.
  2. Dopo la ricezione della biopsia muscolare, rimuovere il campione dal contenitore di trasporto e lavare due volte in tampone fosfato salino (PBS), integrato con la soluzione antibiotica-antimicotica 2% (A / A) in condizioni sterili.
  3. Rimuovere la adiposo allegato e del tessuto connettivo con le forbici sterili e pinze in DMEM addizionato con 2% A / A.
  4. Rimuovere grandi vasi sanguigni sotto il microscopio di dissezione e successivamente tagliare il campione muscolari in piccoli pezzi (<1 cm 2 di dimensione).
  5. Conserva pezzi di muscolo tagliati (<5 grammi) in 20 ml di terreno di conservazione (PM; DMEM supplementato con 10% FBS e 1% P / S) a 4 ℃ fino a 5 giorni.

2. Muscle Dissociationi e isolamento delle cellule

  1. Il giorno di isolamento delle cellule, rimuovere pezzi di muscolo dal PM e lavare due volte in PBS addizionato con 2% P / S. Per rendere la soluzione Kjeldahl, tipo I, di tipo II, e collagenasi di tipo IV (100 mg / ml) al momento in PM.
  2. Tritare finemente e tritare meccanicamente pezzi muscolari con forbici sterili e pinze in una piastra di Petri con una piccola quantità di PM fino a che la soluzione passa da 10 ml pipetta sierologica senza coagulazione. Rimuovere il residuo adiposo e del tessuto connettivo durante questo processo. Utilizzare almeno 8-10 grammi di muscolo adulto o 2 grammi di muscolo fetale per ogni isolamento delle cellule.
  3. Trasferire 4-5 grammi di muscolo adulto macinata a 20 ml (o 2 grammi di muscolo fetale tritata in 10 ml) Ofthe soluzione di digestione con un 10 ml pipetta sierologica. Digest per 50 - 60 minuti a 37 ℃ su un agitatore orbitale a 70-80 rpm. Ottimizzare il rendimento superficie cellulare e la conservazione antigene regolando il tempo di digestione e / o la velocità di agitazione di conseguenza in base alla quantitàdel tessuto. Osservare lo stato di digestione ogni 15-20 minuti fino a quando la torbidità quasi cancella.
  4. Pipettare vigorosamente il tessuto digerito 3-5 volte con 10 ml pipetta sierologica. Aggiungere la stessa quantità di PM per fermare la reazione e centrifugare a 400 xg per 4 min.
  5. Rimuovere con attenzione il surnatante; risospendere il pellet con 10 ml di PM per lavare, e poi filtrato attraverso un colino cella di 100 micron.
  6. Centrifugare a 400 xg per 4 minuti e rimuovere con cautela il surnatante. Pellet Risospendere in tampone di lisi degli eritrociti (155 mM NH 4 Cl, 10mM KHCO 3, 0,1 mm EDTA), filtrare attraverso un filtro 70 micron cellulare per ottenere una sospensione singola cella, e poi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Filtrare attraverso un colino cella 70 m nuovo se qualsiasi precipitazione si osserva.
  7. Centrifugare a 400 xg per 4 minuti e risospendere il pellet di cellule in 0,5 ml di PBS. Contare il numero di cellule. Ottenere un totale di almeno 5 milioni di cellule per l'ordinamento delle cellule. Diluire il singlsospensione e cellulare per meno di 5 milioni di cellule per ml con PBS per la colorazione. Estrarre 50-100 ml di sospensione cellulare e suddivisa in 11 tubi per colorazioni di controllo (controllo senza macchia, controlli negativi e monocolore controlli positivi).

3 Etichettatura cellulare e ordinamento

  1. Incubare la sospensione di cellule singole per 10 min a 4 ℃ nel siero di topo (diluito 1:10 in PBS) per bloccare scopo se necessario.
  2. Aggiungi CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, e CD146-FITC (tutti 1: 100) nella sospensione di cellule singole e incubare per 20 minuti a 4 ℃. Per il controllo negativo, aggiungere le concentrazioni equivalenti di APC-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE, e gli anticorpi IgG isotipo FITC-coniugato e incubare per 20 minuti a 4 ℃. Per monocolore controlli positivi, aggiungere le concentrazioni equivalenti di CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, e CD146-FITC singolarmente in ciascuna provetta e incubare per 20 minuti a 4 ℃.
  3. Dopo l'incubazione, Centrifugare a 400 xg per 4 minuti per lavare. Risospendere il pellet di cellule in 1 - 2 ml di DMEM supplementato con 5% FBS e 1% P / S. La concentrazione finale della sospensione cellulare deve essere inferiore a 5 milioni di cellule per ml. Aggiungere 7-AAD (1: 100) e incubare per 15 minuti a RT per l'esclusione di cellule morte. Per il controllo negativo e monocolore controlli positivi, pellet cellulari risospendere in 0,5 ml di DMEM supplementato con 5% FBS e 1% P / S.
  4. Trasferire tutte le sospensioni cellulari a fondo rotondo flusso polistirolo citometria a tubi. Preparare provette per il prelievo di cellule (ogni tubo è pre-riempita con 500 ml di terreno di coltura appropriato: MPM per MECs; EGM-2 per PC, media CA per ACS). Sospensioni cellulari Trasporto su ghiaccio al cell sorter.
  5. Sospensioni cellulari eseguire sul cell sorter nell'ordine del controllo senza macchia, controlli negativi, monocolore controlli positivi, e la sospensione cellulare principale mentre la regolazione dell'intensità del laser, la compensazione dei canali, e la popolazione di cellule gating rigorosamente per massimizzare cellulare purezza (fare riferimento agli articoli pubblicati da Giove e di altre riviste per i dettagli di citometria a flusso).
  6. Raccogliere popolazioni cellulari desiderati nei tubi di raccolta appropriati. Conservare le cellule raccolte in 4 ℃ se non semina immediatamente.

4. post-smistamento Colture Cellulari

  1. Seed MECs appena ordinate (P0) a <10.000 cellule / cm 2 in MPM su piastre pre-rivestite di tipo collagene. Per la successiva passaging di MECs, sementi 3.500 - 4.000 cellule / cm 2 in MPM su piastre / flaconi pre-rivestite di tipo collagene.
  2. Seed PC appena ordinate (P0) a <20.000 cellule / cm 2 in EGM-2 su piastre rivestite con appena lo 0,2% di gelatina. Per la successiva passaging di PC, cellule dividere in rapporto 1: 3 in mezzo PC (DMEM supplementato con 20% FBS e 1% P / S) su piastre di coltura polistirolo regolari fino P2. Da P3 in poi, le cellule del seme a 6.500 - 7.000 cellule / cm 2 in media PC sul regolari cultura polistirolo piatti / fiaschi.
  3. Seed appena ordinato AC (P0) a <20.000 cellule / cm 2 a medio AC (DMEM supplementato con 20% FBS e 1% P / S) su piastre di coltura polistirolo regolari. Per la successiva passaging di ACS, cellule seme a 6.500 - 7.000 cellule / cm 2 a medio AC sul regolari cultura polistirolo piatti / fiaschi.

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Representative Results

Parametri FACS vengono prima corretti sulla base dei dati ottenuti dal controllo senza macchia, controlli negativi, e un solo colore controlli positivi. Dopo esclusione delle cellule morte, sospensione cellulare fluorescenza marcato viene sottoposto ad una serie di selezioni marcatori di superficie cellulare negativi e positivi. In primo luogo, le cellule CD45 + sono gated prima CD56 + e CD56 - le cellule sono separate dal CD45 - frazione. Il CD56 + frazione è ulteriormente sottoposto a selezione CD34-CD144 dove solo CD34 + / CD144 + cellule (dual-positivi) sono contrassegnati come MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -) e successivamente raccolto (Figura 1). Allo stesso modo, il CD56 - frazione viene ulteriormente sottoposto a selezione CD34-CD146 dove solo CD34 - / CD146 + cellule sono contrassegnati come PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) e successivamente raccolti ( + / CD146 - frazione viene sottoposto ad una ulteriore selezione CD31 negativo ad escludere ECS (CD34 + / CD31 +), e solo CD34 + / CD31 - sottoinsieme è contrassegnato come AC (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -) di raccolta (Figura 1). Per semplificare il processo, CD144 può essere utilizzato per sostituire CD31 per l'esclusione di EC.

Appena cellule ordinati possono essere seminati in condizioni di coltura specificati nel protocollo per un'ulteriore espansione o utilizzati immediatamente per esperimenti in vivo. Espansione clonale di sottoinsiemi hBVSC può essere raggiunto dal sistema autoclone FACS Aria o metodo di diluizione limite 13, 21. A differenza delle tipiche MSC eterogenee, colture di sottoinsiemi hBVSC rimangono omogenea anche dopo l'espansione a lungo termine. Morfologia Rappresentante di sottoinsiemi hBVSC coltivate, purificata da biopsie muscolari di unsingolo donatore, è mostrato nella Figura 2. Confronti tra MSC tipici e sottoinsiemi hBVSC purificate sono riassunti nella Tabella 1.

Figura 1
Figura 1 ordinamento Rappresentante dei tre sottoinsiemi di cellule staminali del sangue-nave-derivati ​​umani (hBVSCs) da una singola biopsia muscolare scheletrico umano. Purezza di ciascuna popolazione cellulare ordinato è ulteriormente confermata da analisi post-sort. Cliccare qui per visualizzare un grande versione di questa figura.

Figura 2
Figura 2 I tre sottopopolazioni hBVSC, ordinati per omogeneità, esposti morfologia distinta in cultura (da sinistra a destra): miogenico delle cellule endoteliali (MEC), periciti (PC), e la cella avventiziale (AC) (a passaggio 4, barre di scala = 100 mm). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

MSC MECs PC AC
Purezza Eterogeneo Omogeneo Omogeneo Omogeneo
Profilo dell'antigene di superficie delle cellule per la purificazione N / a CD34 + CD56 + CD144 CD45- + CD31- CD34 + CD45- CD146-
Espressione marcatore MSC nella cultura CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + CD29 + CD44 + CD90 + CD105 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 +
Multipotenza Miogenesi (+) adipogenesi (+) Osteogenesi (+) Condrogenesi (+) Miogenesi (+) adipogenesi (+) Osteogenesi (+) Condrogenesi (+) Miogenesi (+) adipogenesi (+) Osteogenesi (+) Condrogenesi (+) Miogenesi (N / A) adipogenesi (+) Osteogenesi (+) Condrogenesi (+)
Le potenziali applicazioni Skeletomuscular riparazione / rigenerazione: osso, cartilagine, tendini, legamenti e muscoli scheletrici; Riparazione cardiaca; Riparazione vascolare; La guarigione delle ferite; Immunoregulation Riparazione cardiaca; Riparazione del muscolo scheletrico / rigenerazione; Bone / riparazione della cartilagine / rigenerazione Riparazione cardiaca; Vascolare riparazione / rigenerazione; Riparazione del muscolo scheletrico / rigenerazione; Rigenerazione ossea Riparazione cardiaca; Vascolare riparazione / rigenerazione; Rigenerazione ossea
Localizzazione anatomica in situ N / a Vaso sanguigno Intima Vaso sanguigno media Vaso sanguigno avventizia

Tabella 1 Confronto tra MSC tipici e sottopopolazioni hBVSC multipotenti.

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Discussion

Identificazione e purificazione di sottopopolazioni hBVSC rappresentano un importante passo avanti nella comprensione di MSC ontogenesi. Vi è una crescente evidenza che indica l'origine perivascolare di cellule staminali mesenchimali e l'associazione tra cellule precursori tessuto-specifici e vasi sanguigni 22-25. Inoltre, la capacità di isolare sottopopolazioni omogenee di hBVSCs AIDS ulteriormente la comprensione di MSC eterogeneità e la biologia delle cellule vascolari 26.

Negli ultimi anni, MECs, PC e AC sono stati identificati singolarmente e isolati mediante protocolli distinti in studi separati. Tuttavia, nessun tentativo è stato fatto per purificare tutti e tre sottoinsiemi hBVSC contemporaneamente dal muscolo scheletrico umano a causa delle difficoltà di ottimizzare la procedura di dissociazione dei tessuti e la combinazione di marcatori di lineage cellulare selettivi identificare MECs, PC e AC del tutto. Qui abbiamo descritto un nuovo protocollo di isolamento delle cellule che permette purif concorrenteicazione di MECs, PC e AC da una singola biopsia muscolare umano modificando il processo di dissociazione dei tessuti e l'applicazione di una nuova combinazione di marcatori di superficie delle cellule selettive (Figura 1). Per il miglior risultato, i passaggi critici del protocollo corrente che richiedono ulteriore attenzione sono: 1 freschezza e la conservazione del campione di tessuto; 2 Ottimizzazione del rendimento delle cellule e l'antigene di superficie conservazione da un attento monitoraggio del processo di digestione e la regolazione del tempo di dissociazione dei tessuti; 3. calibrazione precisa del sei colori citometria a flusso. Questi parametri sono determinate da laboratorio individuale secondo la sua specifica configurazione di alimentazione / attrezzature.

Con l'implementazione di questo nuovo protocollo, non si può solo razionalizzare l'isolamento sincrono di diverse sottopopolazioni hBVSC ma anche facilitare l'utilizzo di hBVSCs per la ricerca di base e traslazionale applicazioni, come ad esempio il confronto dei comportamenti cellulari differenziali tra hBVSSottoinsiemi C e l'ottimizzazione del singolo o combinatoria sottoinsieme hBVSC (s) per varie applicazioni terapeutiche personalizzate. Tuttavia, l'isolamento simultanea di tutti e tre sottoinsiemi hBVSC è attualmente limitato al muscolo scheletrico a causa del fatto che MECs non sono stati identificati in altri tessuti umani. Inoltre, è al di là della limitazione del protocollo corrente per distinguere la transizione e / o gerarchia cellulare tra questi tre sottopopolazioni hBVSC.

Caratterizzazione di isolati di fresco e colto MECs, PC e AC è stata dimostrata separatamente in studi precedenti MECs nella cultura mantenere l'espressione del marcatore CD56 miogena ma a poco a poco perdono l'espressione dei marcatori CD34 e CD144 CE. A livello clonale, MECs esprimono marcatori MSC, tra cui CD29, CD44, CD90 e CD105, e mostrano potenzialità di differenziazione mesenchimali quali condrogenesi, osteogenesi, adipogenesi, e miogenesi. Inoltre, MECs clonali mantengono la loro angiogencapacità ic dopo coltura a lungo termine, formando reti capillari, come nella cultura Matrigel e partecipando a neovascolarizzazione in vivo 21.

PC, freschi o coltivate, hanno mostrato di esprimere non solo i marcatori MSC, tra cui CD44, CD73, CD90 e CD105, ma anche mostrare le capacità di sviluppo mesodermiche, per esempio, miogenesi scheletrica, osteogenesi, condrogenesi, e adipogenesi 13. PC robusto secernono una serie di fattori trofici, anche in ipossia, e servono come unità di rigenerazione attraverso la loro funzione paracrina, differenziazione diretta, e l'interazione cellulare durante l'/ processo di rigenerazione riparazione dei tessuti AC, simile a PC, hanno mostrato di esprimere marcatori MSC classici e differenziarsi in grandi linee cellulari mesenchimali 18. Insieme con i PC, AC sono anche stati proposti come una delle origini dello sviluppo di MSC. Una sintesi confrontando l'espressione marcatore di superficie cellulare, la capacità di differenziazione, e papplicazioni traslazionali ossible tra MSC e hBVSCs tipici sono stati elencati nella Tabella 1. Recentemente, identificate multipotenti cellule Tang et al. vascolari staminali (MVSCs) dalla tunica media di grandi vasi sanguigni nel ratto e umano 29. MVSCs non solo si differenziano in cellule muscolari lisce, ma contribuiscono anche al rimodellamento vascolare e neointimale dopo danno vascolare 29. Sia MVSCs condividono collegamenti evolutivi con BVSCs residenti nei vasi microvasculature piccole e richiede ulteriori indagini.

Il protocollo attuale richiede l'isolamento delle cellule tempestiva da fresco biopsia muscolare umana, che, a volte, non possono essere accessibili nelle impostazioni cliniche. In alternativa, basata su un insieme modificato di marcatori di superficie cellulare selettivi, è fattibile per purificare MECs e PC da colture primarie umani crioconservati scheletrici cellule muscolari mediante citometria di flusso 30. Questo metodo permette prospettico purificazione di due sottoinsiemi hBVSC da sopraelevata cultura muscolo scheletrico umano a scopo terapeutico. Tuttavia, a causa della mancanza di espressione di CD34 in cellule coltivate muscolari umane, non è possibile separare ulteriormente ACs con questo particolare protocollo.

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Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Alison Logar per l'eccellente assistenza tecnica di citometria a flusso. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Dipartimento della Difesa (JH), l'Henry J. Mankin sedia dotata (JH), e il Ministero dell'Istruzione e della Scienza della Repubblica del Kazakistan (AS). CWC è stato sostenuto in parte dalla borsa di studio predoctoral American Heart Association (11PRE7490001). M.Corselli è stato sostenuto dal California Institute for Regenerative Medicine borsa di formazione (TG2-01169).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase type 1 Sigma C5894 Sterile vial
Collagenase type 2 Sigma C1764 Sterile vial
Collagenase type 4 Sigma C1889 Sterile vial
Anti-human CD34 APC BD Pharmingen 555824 Keep sterile
Anti-human CD45 APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
Anti-human CD56 PE-Cy7 BD Pharmingen  557747 Keep sterile
Anti-human CD144 PE Beckman Coulter A07481 Keep sterile
Anti-human CD146 FITC AbD Serotec MCA2141F Keep sterile
FACS Aria II Flow Cytometer Becton-Dickinson
EGM-2 complete medium Lonza CC-3162 For culturing PCs (only P0)
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate Invitrogen 11965 For culturing PCs
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate Invitrogen 11995 For culturing MECs and ACs
Fetal bovine serum Invitrogen 10437-028
Heat-inactivated horse serum Invitrogen 26050-088
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122
Antibiotic-antimycotic (100X) Invitrogen 15240-062
Trypsin-EDTA 0.5% (10X) Invitrogen 15400-054
Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium Invitrogen 14190-250
Chick embryo extract Accurate Chemical CE650T-10 Filter before use

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