مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Summary

وميكروأري التضخيم PCR التضخيم غير المتماثلة يجمع وميكروأري التهجين في غرفة واحدة، والذي يبسط إلى حد كبير سير العمل ميكروأري للمستخدم النهائي. تبسيط سير العمل ميكروأري هو خطوة أولى ضرورية لخلق التشخيص القائم على ميكروأري التي يمكن استخدامها بشكل روتيني في البيئات ذات الموارد أقل.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تبسيط سير العمل ميكروأري هو خطوة أولى ضرورية لخلق السل المقاوم للأدوية المتعددة التشخيص القائم على ميكروأري التي يمكن استخدامها بشكل روتيني في البيئات ذات الموارد أقل. وميكروأري التضخيم PCR التضخيم غير المتماثلة يجمع، واختيار حجم الهدف، ووضع العلامات المستهدفة، وميكروأري التهجين ضمن حل واحد وإلى غرفة ميكروفلويديك واحد. ويتجلى أسلوب تجهيز الدفعات مع مزيج الرئيسي غير المتماثلة 9-بلكس ومنخفض الكثافة عنصر هلام ميكروأري التنميط الجيني للأدوية المتعددة والسل المتفطرة مقاومة (السل المقاوم للأدوية المتعددة). بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تكتمل في 6 ساعة وتوفير التنميط الجيني الصحيح مع ما لا يقل عن المعادل 1،000 خلية من خلايا الحمض النووي الجيني. دمج على رقاقة خطوات غسل غير مجدية، الأمر الذي سيؤدي في طريقة AMPLICON مغلقة تماما والنظام. مدى مضاعفة مع ميكروأري التضخيم مقيدة في نهاية المطاف من قبل عدد من أزواج التمهيدي التي يمكن دمجها في رئيسية واحدة مالتاسع ومازال تحقيق حساسية المرجوة ومقاييس الأداء والنوعية، بدلا من عدد من التحقيقات التي يجمد على صفيف. وبالمثل، فإن مجموع الوقت التحليل يمكن اختصارها أو تطول تبعا لاستخدام محدد المقصود، سؤال البحث، وحدود المطلوب من الكشف. ومع ذلك، فإن النهج العام يبسط إلى حد كبير سير العمل ميكروأري للمستخدم النهائي عن طريق تقليل عدد الخطوات مكثفة وتستغرق وقتا طويلا يدويا التجهيز، ويوفر طريقا البيوكيميائية وميكروفلويديك مبسطة لترجمة التشخيص القائم على ميكروأري في الممارسة السريرية الروتينية.

Introduction

وتعتبر اكتشاف الحالات المبكر والعلاج السريع للاستراتيجيات المكافحة الأكثر فعالية للحد من المتفطرة السلية (MTB) نقل وهناك الآن توافق واسع في المجتمع السل أن نقطة الرعاية (مركز عمليات) أو بالقرب من مركز عمليات اختبار لتشخيص السل في وقت واحد وهناك حاجة المقاومة للأدوية (DR). تقنيات مثل GeneXpert Cepheid وغيرها من اختبارات الحمض النووي التضخيم تقليل الوقت لتشخيص لكثير من مرضى السل، وتقديم قراءة التدريجي السريع تشير إلى المقاومة ريفامبين أو الطفرات اختيارها تمنح المقاومة لغيرها من أدوية الخط الأول أو الثاني 2. على الرغم من أن مصممة في الوقت الحقيقي واختبارات الحمض النووي متساوي التضخيم لتحديد الطفرات المقاومة للعقاقير التي تؤدي إلى مرض السل المقاوم للأدوية المتعددة، فإن الطيف من الطفرات التي غالبا ما تكون غير كافية كشف لتصميم نظام المخدرات فردية المقابلة لملف المقاومة للأدوية للمريض، والقيود الفنية المتعلقةلالبصرية عبر الحديث أو تعقيد التضخيم والإبلاغ كيمياء مايو 3-7 تحديد عدد مواضع أو الطفرات التي يتم الكشف عنها. وبالتالي، هناك حاجة تكنولوجيات الكشف بسعة مضاعفة أعلى لمعالجة الثغرات المعروفة في التشخيص POC السل المقاوم للأدوية.

يمكن ميكروأرس وأيدت منظمة الصحة العالمية، هين المقايسات خط التحقيق مواجهة "الجينات متعددة، والطفرات متعددة" تحديا لتشخيص السل المقاوم للأدوية المتعددة 8-29. للأسف، هذه، المنصات كشف المضاعفة القائم على التهجين استخدام متعددة الخطوات، معقدة، والبروتوكولات AMPLICON المفتوح التي تتطلب التدريب الهامة والكفاءة في التقنيات الجزيئية. تم تصميم ميكروأري التضخيم 30 لمعالجة بعض هذه ميكروأري تدفق العمل والاهتمامات التشغيلية. مبادئ فلويديك تبسيط هي لتضخيم، هجن، وكشف الأهداف الحمض النووي داخل غرفة ميكروفلويديك واحد. المستخدم يدخل حمض النووي والتضخيم ماسثالثا خلط في غرفة فلويديك مع ماصة ويبدأ بروتوكول الدراجات الحرارية. للأسلوب تجهيز الدفعات المعروضة هنا، يتم غسلها بعد ذلك في حل ميكروأرس السائبة، والمجففة، وتصويرها. وتوضح هذه الدراسة وظائف لميكروأري التضخيم باستخدام اختبار السل المقاوم للأدوية المتعددة ميكروأري لrpoB (30 الطفرات)، katG (2 الطفرات)، INHA (4 طفرات)، rpsL (2 الطفرات)، embB (1 الطفرة)، IS1245، IS6110 ، والتضخيم الداخلية والسيطرة التهجين. يتم تضمين واحد على الأقل زوج متطابق من تحقيقات ميكروأري (wildtype (WT) ومتحولة واحدة النوكليوتيدات (MU)) لكل طفرة من الاهتمام. الأحماض النووية تنقيته من مقاومة M. أدوية المتعددة السل هي من سلالة السل تقرير التجارة والتنمية 31 بنك. يتم تصنيع ميكروأرس عنصر هلام على ركائز الزجاج بواسطة البلمرة أساسا كما هو موضح في مكان آخر 32، إلا أن نستخدم 4٪ و 0.05 ملي مونومر كل التحقيق في polymerizخليط أوجه. وتحيط صفائف مع طوقا 50 مل قبل استخدامها. بعد ركوب الدراجات الحرارية، والتهجين، وغسل الخطوات، يتم تصوير ميكروأرس التضخيم على محلل المحمولة Akonni. ويتم الحصول على لتصحيح الخلفية، شدة إشارة متكاملة من الخام. معرض طرابلس الصور باستخدام خوارزمية دائرة ثابتة. يتم احتساب الضوضاء لكل عنصر هلام إلى ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري من الخلفيات بقعة المحلية. تعتبر الأهداف الجين عادة للكشف عن إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) تقدر ≥ 3. من أجل تحديد وجود أو عدم وجود طفرة محددة في كل الجينات أو رامزة، ويتم احتساب نسبة التمايز من القيم SNR باسم (WT-MU) / (WT + MU). نسب التمايز <0 تدل على طفرة مقاومة المخدرات في مكان الجريمة، في حين أن نسب> 0 تدل على تسلسل من النوع البري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

للمختبرات التي تتبع الاحتياطات العالمية PCR، فمن الناحية العملية أكثر كفاءة لتشمل العديد من ميكروأرس التضخيم وحشيات في الركيزة وغسل جميع ميكروأرس التضخيم في وقت واحد في حاوية كبيرة، كما هو موضح هنا. تنسيقات الاستهلاكية المتوفرة لأداء آخر التضخيم غسل ميكروأري الخطوات في مختومة تماما، مغلقة اختبار AMPLICON، كما ذكرت في مكان آخر 30،33.

1. الإعداد

  1. استخراج وتنقية الأحماض النووية من العينة تحت ظروف السلامة الأحيائية المناسبة مع طريقة الاختيار. الشرط هو ان تكون الأحماض النووية من النقاء ما يكفي لغير المتماثلة، متعدد PCR التضخيم.
  2. إعداد مساحة العمل عن طريق محو الأسطح والمعدات مع حلول إزالة التلوث.
  3. وضع الكواشف التضخيم على الجليد أو كتلة الباردة.
  4. تسمية العقيمة 1.5 مل microfuge أنبوب لمزيج الرئيسي التضخيم، وتسمية العقيمة 0.2 مل microfuge تويكون لكل عينة.
  5. بعد أن يتم إذابة الكواشف، لفترة وجيزة الدوامة وجمع محتويات في الجزء السفلي من أنبوب مع نبض تدور في الطرد المركزي صغيرة. لا دوامة طق البلمرة. نفض الغبار بلطف أنبوب لخلط وتابع مع نبض تدور في مصغرة الطرد المركزي.
  6. إعداد مزيج الرئيسي التضخيم باستخدام كميات رد فعل لكل عينة المبينة في الجدول 1. لمراعاة عدم دقة pipetting لممكن، وإعداد واحد على الأقل أكثر حجم رد الفعل من العدد الكلي للعينات التي يتم معالجتها. علما بأن مزيج الرئيسي يحتوي البلمرة طق إضافية، وفوق كل ما يتم توفيرها مع المخزن المؤقت PCR muliplex. إضافة فقط السيطرة التضخيم / تثبيط لمزيج الرئيسي بعد يتم الجمع بين جميع الكواشف الأخرى، وعاد أنابيب الأسهم كاشف للتخزين.
كاشف لكل عينة الحجم (ميكرولتر) <قوية> النهائي []
Mulitplex PCR العازلة مع HotStar طق زائد 25 1X
ألبومين المصل البقري (BSA) 0.55 0.6 ملغ / مل
الفورماميد 3.8 7.6٪
البلمرة طق إضافية 0.8 وحدة / ميكرولتر (المجموع 4 وحدات)
السل المقاوم للأدوية المتعددة التمهيدي مزيج 15.75 -
ريبونوكلياز خالية H 2 O 2.1 -
التضخيم / التحكم في تثبيط 1 5.0 FG / ميكرولتر
مجموع 49

الجدول 1. السل المقاوم للأدوية المتعددة التضخيم ميكروأري سيد مزيج تكوينها.

  1. دوامة مزيج الرئيسي وجمع محتويات في الجزء السفلي من أنبوب مع نبض تدور في الطرد المركزي صغيرة.
  2. الجمع بين 49 ميكرولتر من مزيج الرئيسي و 1 ميكرولتر من M. الحمض النووي السل إلى كل من أنابيب عينة من الخطوة 1.4 أعلاه. لخارجي، لا للتحكم القالب (NTC)، استخدم 1 ميكرولتر من الماء الجزيئية الصف البيولوجيا بدلا من م. عينة من الحمض النووي السل. دوامة ونبض تدور الأنبوب (ق) عند الانتهاء.

2 قم بتحميل التضخيم ميكروأرس

  1. إضافة 48 ميكرولتر من كل مزيج سيد / العينة على مركز ميكروأرس كل منها، والحرص على عدم لمس ميكروأري نفسه.
  2. وضع زلة غطاء على رأس طوقا ميكروأري والختم، والحرص على عدم اعتراض أي فقاعات الهواء في غرفة ميكروأري. يمكن فقاعات الهواء تؤثر سلبا على كفاءة التضخيموربما خلق التحف أو الضوضاء في الصورة ميكروأري اللاحقة.

3. ركوب الدراجات الحرارية

  1. مرة واحدة يتم تحميل جميع ميكروأرس مع العينة، ركائز مكان على cycler الحرارية كتلة مسطحة. تأكد من أن الخيار غطاء ساخنة تشغيل "إيقاف". وبالفعل تم الحصول عليها من أجهزة Akonni النظم البيولوجية يمكن تأهيله للاستخدام. خلاف ذلك، من المهم جدا للتحقق من أن كتلة cycler الحرارية المسطحة (ق) تقديم (ق) موحدة، التدفئة متناسقة عبر جميع ركائز ميكروأري.
  2. فتح برنامج cycler الحرارية، حدد البرنامج المناسب، أدخل "50 ميكرولتر" لحجم رد الفعل، والشروع في التشغيل. بروتوكول الدراجات الحرارية الموصوفة هنا تتكون من:
    ركوب الدراجات الحرارية خطوات
    1 88 ° C 5 دقائق
    2 88 ° C 30 ثانية
    3 55 ° C 1 دقيقة
    4 65 ° C 30 ثانية
    5 كرر الخطوات من (2-4) لمدة 50 دورات
    6 65 ° C 3 دقيقة
    7 55 ° C 3 ساعة
  3. العدد الإجمالي للدورات الحرارية و 55 درجة مئوية بعد التضخيم عقد الوقت هي المتغيرات المستقلة أن المستخدم قد تعدل، حسب الحاجة أو المناسبة للتجربة محددة. لأن مزيج الرئيسي السل المقاوم للأدوية المتعددة يخلق غير المتماثلة amplicons (في الغالب الذين تقطعت بهم السبل واحد)، فإنه من المفيد عادة لتشمل دورات أكثر الحرارية عما يمكن استخدامها لالتقليدية، الأسي بروتوكول التضخيم PCR.
  4. عند البرنامج ركوب الدراجات والتهجين الحرارية كاملة، إنهاء البرنامج، وإزالة ميكروأرس التضخيم، أغلق البرنامج، وإيقاف cycler الحرارية (ق).

4. غسل والجافة

  1. لغسل ما يصل الى 24 في وقت واحد ركائز، وإعداد 250 مل على الأقل 1X SSPE - 0.1٪ تريتون X-100 غسل العازلة، وحاويتين مع لا يقل عن 250 مل منزوع الأيونات أو الملة، س الصف المياه لكل منهما. في غسل العازلة يمكن أن تكون معدة مسبقا.
  2. إزالة بعناية زلة تغطية وحشية من كل التضخيم ميكروأري الغرفة باستخدام ملقط نهاية مسطحة. هذه الخطوة هي النقطة التي يوجد فيها أكبر خطر ضررا جسديا صفائف عنصر هلام. استخدام الضوابط المناسبة التلوث PCR لمنع انتشار الأحماض النووية تضخيمها داخل بيئة العمل.
  3. وضع ركائز ميكروأري في حامل الشريحة الأنسجة، ووضع كافة الشرائح في غسل بن تحتوي على غسل العازلة. تغطية الحاويات مع غطاء.
  4. غسل ميكروأرس لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف.
  5. تراجع ميكروأرس كل ثلاث مرات في اثنين من يغسل المتعاقبة منزوع الأيونات أوملي-Q المياه الصف، والهواء الجاف.

5. التصوير

وغير المتماثلة السل المقاوم للأدوية المتعددة التمهيدي مزيج يولد amplicons CY3 المسمى. ولا يمكن تصوير ميكروأرس عنصر هلام مع أي معيار ميكروأري تصوير قادرة على CY3 التصوير. الإجراء التالي هو التصوير محددة لمزيج السل المقاوم للأدوية المتعددة الماجستير، مجال Dx2100 تصوير المحمولة، وبرامج التحليل الآلي التي تقدمها Akonni.

  1. تأكد من توصيل كابل إيثرنت من تصوير إلى جهاز الكمبيوتر.
  2. بدوره على تصوير. يقع مفتاح الطاقة على اللوحة الخلفية للأداة. سوف المصابيح الزرقاء على الجزء الأمامي من تصوير تضيء عندما يتم تشغيل تصوير جرا.
  3. بدوره على جهاز الكمبيوتر.
  4. على سطح المكتب الكمبيوتر، انقر نقرا مزدوجا على أيقونة البرنامج لإطلاق برنامج تحليل الصور الآلي.
  5. انتظر البرنامج لتأسيس اتصال مع كاميرا تصوير. بمجرد تأسيس الاتصال، يصبح الزر تحليل المتاحة، ورسالة "اتصال ناجح" سوف تظهر في الزاوية اليسرى السفلى من الشاشة.
  6. إدراج ميكروأري التضخيم المجففة مع ميكروأري تواجه بعيدا عن المستخدم، ونحو عدسة الهدف. إذا تم الموجهة ميكروأري غير صحيح فيما يتعلق عدسة الكاميرا و، ستفشل برامج التحليل الآلي لوضع شبكة على الصورة مضان.
  7. إغلاق باب الوصول. معاينة الصورة سوف تكون متاحة على شاشة الكمبيوتر.
  8. حدد التحليل النصي السل المقاوم للأدوية المتعددة من القائمة المنسدلة وأدخل وقت التعرض المطلوب (بالمللي ثانية). وهناك نقطة انطلاق نموذجية للعنصر هلام ميكروأرس التضخيم هو 100-500 ميللي ثانية.
  9. سيتم عرض بكسل المشبعة على معاينة الصورة باللون الأحمر. ضبط الوقت التعرض لتقليل عدد وحدات البكسل المشبعة في مواضع فردية.
  10. انقر فوق تحليل لاكتساب وتحليل صورة مضان. البرنامج سيضع تلقائياالسل المقاوم للأدوية المتعددة الشبكة مقايسة محددة على الصورة، واستخراج كثافة متكاملة والقيم الأساسية، وتقديم تقرير عن نتائج مقاومة المخدرات والتنميط الجيني. فإن التحليل الآلي تأخذ عادة بضع ثوان. للصور التحدي التي تحتوي على الخدوش والغبار والتحف الفلورسنت، أو الأضرار المادية إلى ميزات ميكروأري، البرنامج قد تحتاج ما يصل الى 1 دقيقة لاستكمال التحليل.
  11. مرة واحدة تحليل كاملة، انقر على حفظ، حدد المجلد الوجهة، اكتب اسم الملف، ثم انقر فوق موافق. يتم حفظ البيانات ميكروأري الأساسية كملف XLS. ويمكن تصديرها للخارج الخط يحلل، إذا رغبت في ذلك.
  12. مرة واحدة تحليل كاملة، وإزالة ميكروأري التضخيم من تصوير وانقر على جديد لبدء تحليل المقبل.
  13. عند الانتهاء من جمع البيانات، وإغلاق البرامج، إيقاف تشغيل الكمبيوتر، وإيقاف تصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن تحليل الصور النوعية توفر نظرة ثاقبة مصادر الضوضاء التجريبية أو تقلب التي تتحدى لتحديد الجداول في البيانات التي تولدها الآلي برمجيات تحليل الصور. وبالتالي، يمكن أن يكون مفيدا لبصريا التأكد من أن 1) جميع عناصر هلام سليمة وغير التالفة، 2) الخلفية العالمية غير خالية من القطع الأثرية الفلورسنت التي قد تؤثر على إشارة إلى نسبة الضوضاء الفردية (SNR) القيم، 3) ليس هناك أي دليل ل تشكيل فقاعة أو غير منتظم التضخيم / التهجين عبر مجموعة، و4) أن البرنامج حدد بدقة جميع البقع على الصورة ميكروأري. وتظهر السل المقاوم للأدوية المتعددة مثل الصور التضخيم ميكروأري في الشكل 1، توضح مجموعة ذات جودة عالية والتحف التي قد تنشأ نتيجة لضرر مادي أو فقاعات أثناء ركوب الدراجات الحرارية. برامج تحليل الصور ميكروأري هو معيار عادة ما تكون قادرة على وضع الشبكة واستخراج البيانات وكثافة لا يتجزأ الخلفية حتى من الصور ذات نوعية رديئة مثل SHالخاصة في الشكل 1B، لذلك فإنه يتعين على الباحث وضع معايير مراقبة الجودة والمقاييس لقبول أو رفض الصور ميكروأري من مزيد من التحليل. التحقيق التكرار قد تساعد في تحسين هذه القضايا. ومع ذلك، فإن والتشخيصية السل المقاوم للأدوية المتعددة خوارزمية الإبلاغ التضخيم ميكروأري مؤتمتة بالكامل تعلن خلاف ذلك الاختبار من الشكل 1B بأنها "غير صالحة".

يتم عرض القيم SNR التضخيم ميكروأري لسلسلة التخفيف من الحمض النووي الجيني wildtype H37Ra في الجدول 2. في 6.25 خريج إدخال الحمض النووي الجيني في رد الفعل أو ما يقرب من 1.25 × 10 3 خلية حكمه، والكشف عن جميع تحقيقات wildtype بسهولة. تراوحت قيم SNR لكل من التضخيم وتثبيط الضوابط الداخلية من 98.48 (rpoB) إلى 967.24 (Akonni الموردة للسيطرة الإيجابية الداخلية)، مشيرا إلى أن جميع الأهداف الجينات في رد فعل غير متماثل التضخيم متعددة وتتضخم وكشفها. لاكانت الضوابط قالب سلبي (SNR <3) لجميع تحقيقات في ميكروأري التضخيم. وتراوحت نسب التنميط الجيني عند 6.25 خريج الحمض النووي المدخلات 0،18-1،00 لجميع أزواج التحقيق WT / MU، والذي يدل على السلوك الصحيح للWT وMU تحقيقات والتنميط الجيني المناسبة.

وتظهر البيانات التنميط الجيني لممثل لجنة من منظمة الصحة العالمية المرجعية العزلات من النمط الجيني المعروفة في الجدول 3. إذا يتم تمثيل تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد (SNP) على ميكروأري عنصر هلام، ثم اختبار التضخيم ميكروأري يكشف بدقة طفرة المقابلة في MDR للسل الجينوم. بعض من تحقيقات ميكروأري التضخيم هي أيضا حساسة للطفرات قرب الجار التي لم يتم تمثيلها بشكل صريح على مجموعة بوصفها التحقيق فريدة من نوعها. على سبيل المثال، عزل يحتوي تقرير التجارة والتنمية 0129-طفرة في الجين S531E rpoB، ولكن لم يكن هناك مسبار محددة على ميكروأري التضخيم لS531E. ومع ذلك، وخمسة تحقيقات أخرى SNP targetinز كودون 531 تشير إلى أن الطفرة موجودة في كودون 531 - ميكروأري التضخيم بالتالي يشير بشكل صحيح أن هذا هو عزل المقاومة ريفامبين. حساسية مشابهة لطفرة rpoB S513W هو واضح لعزل تقرير التجارة والتنمية 0148-. من ناحية أخرى، فإن بعض تحقيقات SNP ليست حساسة لطفرات الجار القريب، كما يتضح من تقرير التجارة والتنمية عزل-0148 والطفرة rpoB S512G، وعزل تقرير التجارة والتنمية 0011، والطفرة katG S315R. نعتقد أن هذا النوع من السلوك التحقيق هو نتيجة للهيكل الثانوي والعالي في AMPLICON واحد الذين تقطعت بهم السبل و / أو التحقيق 34، وليس شيئا يمكن التنبؤ مسبقا. ومع ذلك، حساسية التحقيق إلى حدوث طفرات الجار القريب هو مماثل لاستخدام منارات الجزيئية قذرة للكشف عن الطفرات المقاومة للأدوية المتعددة مع مجموعة صغيرة من الوقت الحقيقي PCR تحقيقات 35،36، ويمكن أن تكون مفيدة في التشخيص قدمت الاختبار لا تولد ايجابيات كاذبة العالقاتTIVE إلى قابلية المخدرات المظهري.

الشكل 1
الشكل 1 (أ) مثال التضخيم ميكروأري الصورة ل100 خريج wildtype M. السل H37Ra الحمض النووي الجيني ووقت التعرض 100 ميللي ثانية. منارات CY3 (لgridding الآلي والبرمجيات تجزئة) هي على هامش الصورة (B) صورة من ميكروأري التضخيم يظهر قطعة أثرية هالة الفلورية الناجمة عن تشكيل فقاعة أثناء ركوب الدراجات الحرارية، وتضررت عناصر هلام / الحطام. الآلي برمجيات تحليل الصور لا يزال قادرا على وضع شبكة واستخراج البيانات من هذه الصورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

<آر>
شركة عدد التسويقي
Akonni النظم البيولوجية استعلم
QIAGEN # 206143
QIAGEN # 201207
QIAGEN # 206143
الحرارية فيشر العلمية، وشركة # BP227-500
سيغما الدريخ # 3B6917
Akonni النظم البيولوجية استعلم
Akonni النظم البيولوجية استعلم
الحرارية فيشر العلمية، وشركة # BP1328-4
الحرارية فيشر العلمية، وشركة # BP151-500
التكنولوجيات الحالية، وشركة # BRSPRAY128
التطهير مختبرات، وشركة # 8416
شركة عدد التسويقي
Akonni النظم البيولوجية 100-20011
100-10021
ArrayIt HTW
الحرارية فيشر العلمية، وشركة # 10-300
VWR # 3365040
VWR # 93000-196
الهوائية المركزية # 95630

الجدول 2. المواد المطلوبة والمعدات.

69 "> 329.09 <فئة الدفتيريا = "xl69"> 109.90 ع: لا شيء "> 816.64
كودون مسبار
ID
القيم WT دقق SNR 500 خريج 100 خريج 50 خريج 25 خريج 12.5 خريج 6.25 خريج
rpoB 507 1 900.22 644.46 523.17 431.08 364.49 287.47
3 1016.37 699.38 600.16 525.07 446.51 361.64
511 5 867.67 611.97 529.90 451.73 403.76 307.68
512 8 810.69 544.04 488.85 436.89 391.62 257.46 د>
513 11 824.36 547.04 496.00 472.01 408.96 242.25
515 15 715.48 536.59 416.96 335.81 267.48 189.10
516 17 723.83 496.44 402.95 270.10 201.98
522 27 674.37 413.33 360.40 316.75 236.19 153.40
524 29 269.46 153.69 117.71 118.02 110.13 51.22
526 31 136.37 82.63 76.76 53.61 37.76
531 44 219.92 136.31 109.16 96.18 80.58 26.44
533 51 130.54 83.60 76.03 63.47 61.35 41.54
rpsL = "xl71"> 43 54 10.41 12.75 53.30 767.18 5.39 362.42
88 56 655.54 542.79 527.43 690.34 403.86 456.05
katG 315 58 1037.03 873.46 974.83 811.79 876.47
embB 306 66 940.81 781.13 788.75 837.65 787.05 696.69
INHA 8 82 1069.43 934.38 862.58 936.88 809.85 682 .56
15 85 1111.66 931.88 918.22 957.87 795.72 723.16
17 87 1114.49 926.03 920.60 970.70 854.15 744.41

الجدول 3. إشارة إلى نسب الضوضاء للتحقيقات wildtype وسلسلة التخفيف من M. السل H37Ra الحمض النووي الجيني. القيم SNR تعتبر> 3 كشفها.

ntent "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الجدول 4
يعزل الجدول 4. البيانات التنميط الجيني الممثل من السل المقاوم للأدوية المتعددة من النمط الجيني المعروفة في 25 خريج في رد الفعل ميكروأري التضخيم. النجمية تحديد الطفرات التي لم يتم تمثيلها بواسطة مسبار فريدة من نوعها على هلام عنصر ميكروأري. WT = wildtype تسلسل الحمض النووي. القيم السلبية (جريئة ومظللة) تدل على طفرة، وبالتالي المظهري مقاومة المخدرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مدى مضاعفة مع ميكروأري التضخيم وأملت في نهاية المطاف من كفاءة متعددة غير المتماثلة PCR، وليس ميكروأري. في تجربتنا، 10-12 أزواج التمهيدي فريدة من نوعها يمكن بسهولة المضاعفة في شكل التضخيم ميكروأري. وبالتالي تطبيق التمهيدي والتحقيق معايير التصميم التقليدية لفحوصات جديدة، إلا أن واحدا يحتاج أيضا إلى النظر في التفاعلات المحتملة بين حل مرحلة الأحماض النووية وتحقيقات ميكروأري يجمد، والكفاءة الحرارية للcycler الحرارية، والسلوك التحقيق التهجين في منطقة عازلة PCR أن أيضا يحتوي الاشعال PCR وانخفاض الوزن الجزيئي التحف التضخيم. نهج التضخيم المضاعفة للغاية مثل التضخيم كله الجينوم لا تفضي إلى غرفة واحدة بروتوكول التضخيم ميكروأري لعدد من الأسباب التقنية، بما في ذلك التداخل بين hexamers عشوائي وتحقيقات يجمد، والتهجين غير الكفء لل، amplicons المزدوج تقطعت بهم السبل طويلة. هناكهو أيضا العلاقة المتبادلة بين سهولة الاستخدام، وقت التحليل الكلي، وحدود الكشف، أن المستخدمين الفرديين سوف تحتاج إلى أخذها في الاعتبار عند تصميم فحوصات مخصصة أو باستخدام اختبار السل المقاوم للأدوية المتعددة هو موضح هنا. على سبيل المثال، تقليل عدد دورات التضخيم وحتى القضاء على آخر خطوة التهجين التضخيم سوف تقلل إلى حد كبير إجمالي وقت التحليل، ولكن على حساب من حساسية الاختبار. من ناحية أخرى، وتحقيق استنساخه 10 الجينات حد الكشف نسخة قد تتطلب المزيد من الوقت أو دورات التضخيم التهجين، وبالتالي تمديد الوقت الإجمالي تحليل ما وراء تحول عمل واحد.

الجينات، والطفرات، تصوير، برامج التحليل، والإبلاغ خوارزمية الموصوفة هنا هي توضيحية للأسلوب التضخيم ميكروأري والنظام، بدلا من تقرير عن أدائها التحليلية وفائدة سريرية. على سبيل المثال، يمكن أن تكون العينة بدءا البلغم، والرواسب تطهير والثقافات الصلبة أو السائلة - شرطلميكروأري التضخيم هو ببساطة أن الأحماض النووية المستخرجة هي amplifiable بواسطة غير المتماثلة، المضاعفة PCR. بعض الباحثين أو الأطباء قد تجد شيئا يذكر لولا قيمة السريرية في الكشف عن rpsL أو الطفرات embB التي تمنح مقاومة ضد الستربتومايسين والإيثامبوتول، على التوالي، ومقاومة فقط لريفامبين أيزونيازيد وتحديد السل المقاوم للأدوية المتعددة. وبالتالي، فإن هذه الاشعال PCR وتحقيقات ميكروأري يمكن استبدالها مع الاشعال وتحقيقات التي تستهدف الجينات والطفرات التي تمنح المقاومة للمضادات الحيوية الأخرى أولا أو الخط الثاني. فمن الممكن لكتابة الخوارزمية التقارير لتوفير للمستخدم مع معلومات مفصلة عن الطفرات المحددة التي يتم الكشف عنها في عينة معينة، بدلا من "المقاومة الكشف عن" بسيطة أو "المقاومة لم يتم الكشف عن" نتيجة. بالنسبة لأولئك الباحثين المهتمين في استخدام هذا الاختبار محددة لتحليل M. يعزل السل، فمن الممكن أيضا لتوفير البيانات التنميط الجيني حتى لو كان عنصر IS6110 ليس كشفهاد في العينة.

بغض النظر عن الفحص والإبلاغ التبديلات الممكنة، تم تصميم ميكروأري التضخيم وبروتوكول الموصوفة هنا لتبسيط سير العمل بشكل كبير ميكروأري من خلال الجمع بين عدة خطوات البيولوجيا الجزيئية في رد فعل كيميائي حيوي واحد وغرفة ميكروفلويديك. إظهار بيانات تمثيلية فعالية النهج عن طريق تضخيم تسع مناطق الجينوم السل المقاوم للأدوية المتعددة والكشف عن تلك amplicons غير المتماثلة مع منخفض الكثافة عنصر هلام ميكروأري. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم إجراء الغسيل السائبة التي يتطلب من المستخدم لإزالة جسديا طوقا والغطاء زلة من ميكروأري التضخيم قبل الغسيل، وبالتالي فهي أكثر ملاءمة للتطبيقات استخدام البحوث فقط بدلا من التشخيص السريري. كما هو موضح في مكان آخر، ومع ذلك، فمن الممكن بالتأكيد أن تدرج خطوة الغسيل على الرقاقة باستخدام FLUIDICS الوحشي تدفق 33 وبالتالي تحتفظ الاستهلاكية AMPLICON مغلقة تماما، بما فيuding واحد التي يمكن إدراجها بسهولة في عينة في الإجابة من نظام التشخيص الذي يتناسب مع نقطة من الرعاية التطبيقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) في إطار منحة RC3 AI089106.

وقدمت السل المقاوم للأدوية المتعددة الأحماض النووية من قبل برنامج الأمم المتحدة للطفولة برنامج / صندوق الأمم المتحدة للتنمية / البنك الدولي / منظمة الصحة العالمية الخاص للبحوث والتدريب في مجال أمراض المناطق المدارية، جنيف، سويسرا.

نشكر الدكتور توم Shinnick من المراكز الامريكية لمكافحة الامراض والوقاية منها لتوجيهات بشأن الجينات والطفرات محددة لتدرج في مقايسة النموذج.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
  2. World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
  3. Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
  4. Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
  5. Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
  6. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  7. Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
  8. Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. 3292-3297 (2012).
  9. Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
  10. Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
  11. Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
  12. Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
  13. Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
  14. Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
  15. Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
  16. Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
  17. Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
  18. Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
  19. Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
  20. Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
  21. Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
  22. Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
  23. Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
  24. Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
  25. Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
  26. Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
  27. Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
  28. Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
  29. Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
  30. Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
  31. Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
  32. Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
  33. Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
  34. Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
  35. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
  36. Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics