Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Усиление микрочипов сочетает асимметричный ПЦР-амплификации и микрочипов гибридизации в одной камеры, что значительно упрощает микрочипов рабочий процесс для конечного пользователя. Упрощение микрочипов рабочий процесс является необходимым первым шагом для создания микрочипов методы диагностики, которые могут быть обычно используются в средах ниже ресурсами.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Упрощение микрочипов рабочий процесс является необходимым первым шагом для создания МЛУ-ТБ микрочипов методы диагностики, которые могут быть обычно используются в средах ниже ресурсами. Усиление микрочипов сочетает асимметричный ПЦР-амплификации, выбор целевой размер, целевой маркировки и микрочипов гибридизации в рамках одного решения и в единый микрофлюидных камеры. Метод пакетной обработки демонстрируется с 9-Plex асимметричной мастер-микса и низкой плотности гель элемента микрочипов для генотипирования с множественной лекарственной устойчивостью микобактерий туберкулеза (МЛУ-ТБ). Протокол, описанный здесь может быть завершена в 6 часов и обеспечивают правильную генотипирование с по крайней мере 1000 клеток эквивалентов геномной ДНК. Включение на чипе стадий промывки является возможным, что приведет к совершенно закрытым способом ампликона и системы. Степень мультиплексирования с амплификации микрочипов, в конечном счете ограничены по количеству пар праймеров, которые могут быть объединены в один мастер-мIX и до сих пор достичь желаемого чувствительность и специфичность метрики производительности, а не от количества датчиков, которые, иммобилизованных на матрице. Кроме того, общее время анализа можно укорачивать или удлинять в зависимости от конкретной цели использования, вопрос исследования и желанных пределов обнаружения. Тем не менее, общий подход значительно упрощает микрочипов рабочий процесс для конечного пользователя за счет уменьшения количества вручную интенсивных и трудоемких этапов обработки, и обеспечивает упрощенную биохимический и микрофлюидных путь для перевода микрочипов методы диагностики, в повседневной клинической практике.

Introduction

Раннего выявления и быстрого лечения считаются наиболее эффективные стратегии, направленные на снижение микобактерии туберкулеза (МТБ) передачи 1, и в настоящее время существует широкий консенсус в обществе ТБ, что точка ухода (ЛОК) или вблизи теста ЛОК одновременно диагностировать туберкулез и лекарственная устойчивость (DR) не требуется. Такие технологии, как GeneXpert Cepheid и других испытаний нуклеиновых кислот усиления сократить время постановки диагноза для многих больных туберкулезом, и обеспечивают быстрое считывание, показывающее устойчивость к рифампицину или отдельных мутаций, придающих устойчивость к другим первой или второй линии препаратов 2. Хотя в режиме реального времени и изотермический нуклеиновых кислот тесты амплификации предназначены для выявления мутаций лекарственной устойчивости, которые приводят к МЛУ-ТБ, спектр мутаций они обнаруживают, часто бывает неадекватной для разработки индивидуальной схеме наркотиков, соответствующую профилю лекарственной устойчивости пациента, и технические ограничения, связанныек оптическому перекрестных помех или сложности амплификации и отчетности химических 3-7 может ограничить число локусов или мутаций, которые были обнаружены. Таким образом, технологии обнаружения с высокой емкостью мультиплексирования требуются для решения известных пробелов в МЛУ-ТБ диагностики POC.

Microarrays и ВОЗ одобрила Hain линия зонда анализы могут обратиться к "несколько генов, множественные мутации" вызов диагностики МЛУ-ТБ 8-29. К сожалению, эти гибридизации основе, мультиплексированных платформы обнаружения использовать многоступенчатой, сложной и открытой Amplicon протоколы, которые требуют значительной подготовки и квалификации в молекулярных методов. Усиление микрочипов 30 был разработан, чтобы решить некоторые из этих микрочипов рабочий процесс и оперативных проблем. Упрощающие струйные принципы для усиления, гибридизации, и обнаруживать цели нуклеиновых кислот в пределах одного микрофлюидных камеры. Пользователь вводит кислоты и усиления мас нуклеиновыхтер смешать в текучей камере с помощью пипетки и начинает протокол тепловой велоспорт. Для метода пакетной обработки, показанной здесь, микрочипы которые затем промывают в объеме раствора, сушат и образ. Это исследование демонстрирует функциональность амплификации микрочипов с использованием тест МЛУ-ТБ микрочипов для гена rроВ (30 мутаций), katG (2 мутации), Инга (4 мутации), RPSL (2 мутации), embB (1 мутация), IS1245, IS6110 и внутреннее усиление и управление гибридизации. По крайней мере один подобранная пара из микрочипов зондов (дикого типа (WT) и одного нуклеотида мутантных (MU)) включена в каждый мутации интерес. Очищенные нуклеиновые кислоты от множественной лекарственной устойчивостью М. туберкулез от TDR туберкулеза штамма банк 31. Гель элемент микрочипы изготавливаются на стеклянных подложках сополимеризацией существу, как описано в другом месте 32, за исключением того, мы используем 4% мономера и 0,05 мм каждый зонд в polymerizAtion смесь. Массивы окружены 50 мл прокладки до использования. После термоциклирования, гибридизации и промывки шагов, усиления микрочипы изображаются на Akonni портативного анализатора. Фоновые коррекцией, интегральные интенсивности сигналов получаются из сырой. TIF изображений с помощью фиксированный алгоритм круг. Шума для каждого элемента гель рассчитывается как три раза стандартного отклонения фонов местных месте. Генные цели, как правило, считается обнаружить для сигнала к шуму (SNR) значения ≥ 3. Для того, чтобы определить наличие или отсутствие определенной мутации в гене или каждого кодона, дискриминант коэффициент рассчитывается по значениям SNR как (WT-MU) / (WT + MU). Дискриминантные отношения <0 свидетельствуют о лекарственной устойчивости мутации в локусе, в то время как отношения> 0 указывают на последовательность дикого типа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Для лабораторий, которые следуют универсальные ПЦР меры предосторожности, это оперативно более эффективно включать в себя несколько микрочипов усиления и прокладки на подложке и мыть все усиления микрочипов одновременно в контейнере для массовых грузов, как описано здесь. Расходные форматы доступны для выполнения пост-амплификации шаги микрочипов стиральные в совершенно закрытой, замкнутой теста ампликона, как сообщает в другом месте 30,33.

1. Настройка

  1. Извлечение и очистить нуклеиновых кислот из образца при соответствующих условиях биобезопасности с методом выбора. Это требование заключается в том, что нуклеиновые кислоты иметь достаточную чистоту для асимметричной, мультиплексной ПЦР-амплификации.
  2. Подготовить рабочее место, протирая поверхности и оборудование с обеззараживающих растворов.
  3. Наведите усиления реагенты на льду или холодной блока.
  4. Этикетка стерильный 1,5 мл пробирке для усиления мастер-микса, и маркировать стерильный 0,2 мл Microfuge ТУбыть для каждого образца.
  5. После реагенты оттаивают, кратко вихрь и собирать содержимое в нижней части трубы с широтно-спина в мини-центрифуге. Не вихрь Taq-полимеразы. Аккуратно вылить трубку, чтобы смешивать и следовать с широтно-спина в мини-центрифуге.
  6. Подготовка амплификации основной смеси с использованием реакционных объемов за образца, показанного в таблице 1. Для учета возможных неточностей пипетки, готовить по крайней мере еще ​​один реакционный объем, чем общее количество обрабатываемых образцов. Обратите внимание, что мастер микс содержит дополнительные Taq-полимеразы, сверх того, что предусмотрено с muliplex ПЦР буфер. Только добавить элемент управления усиления / ингибирования на мастер-микса после того как все другие реагенты объединяются, и фондовый реагентов трубы вернулся на хранение.
Реагент Пер-Sample Объем (мкл) <сильный> Финал []
Количеством залов буфера для ПЦР с HotStar Taq Plus 25 1x
Бычий сывороточный альбумин (БСА) 0.55 0,6 мг / мл
Формамид 3.8 7,6%
Дополнительная Taq полимеразы 0.8 единиц / мкл (всего 4 единицы)
МЛУ-ТБ грунт смесь 15.75 -
РНКазы H 2 O 2.1 -
Усиление / Торможение управления 1 5.0 фг / мкл
Общий 49

Таблица 1. Усиления микрочипов мастер состав смеси МЛУ-ТБ.

  1. Vortex Master Mix и собирать содержимое в нижней части трубы с широтно-спина в мини-центрифуге.
  2. Объедините 49 мкл мастер-микса и 1 мкл М. туберкулез ДНК в каждой из пробирок с шагом 1.4, выше. Для внешнего, никакого контроля шаблон (NTC), не использовать 1 мкл молекулярной класса биологии воды вместо М. туберкулез образец ДНК. Vortex и пульс-спин трубка (ы), когда закончите.

2. Загрузите усиления Microarrays

  1. Добавить 48 мкл каждого из мастер-микс / образец на центр их соответствующих микрочипов, стараясь не трогать саму микрочипов.
  2. Поместите покровное на вершине микрочипов прокладкой и прокладкой, стараясь не ловушку любые пузырьки воздуха в микрочипов камеры. Пузырьки воздуха может негативно сказаться на эффективности усиленияи может создать артефактов или шума в последующем микрочипов изображения.

3. Тепловая Велоспорт

  1. После того как все микрочипы загружаются с образцами, место подложек на плоской блока термоциклер. Убедитесь, что опция подогревом крышка поворачивается "Выкл." Оборудование получено из Akonni биосистем уже будет предварительную квалификацию для использования. В противном случае, это очень важно, чтобы убедиться, что квартира блок термоциклер (ы) обеспечить (ы) форму, в соответствии отопление во всех микрочипов субстратов.
  2. Откройте программу термоциклер, выберите соответствующую программу, введите "50 мкл" для реакционного объема, и инициировать перспективе. Протокол термоциклирование описано здесь состоит из:
    Тепловые Велоспорт шаги
    1 88 ° C 5 мин
    2 88 ° C 30 сек
    3 55 ° C 1 мин
    4 65 ° C 30 сек
    5 Повторите шаги (2-4) в течение 50 циклов
    6 65 ° C 3 мин
    7 55 ° C 3 часа
  3. Общее количество термических циклов и 55 ° C после амплификации время удержания независимые переменные, которые пользователь может изменить, как необходимо или целесообразно для конкретного эксперимента. Поскольку Master Mix MDR-TB создает асимметричные (преимущественно одноцепочечные) ампликонов, как правило, полезно включить более термических циклов, чем в противном случае могут быть использованы для обычного протокола, экспоненциальной амплификации ПЦР.
  4. Когда езда на велосипеде и гибридизации программа тепловой завершена, завершить программу, удалите усиления микрочипов, закрыть программное обеспечение, и выключите термоциклер (ы).

4. Вымойте и высушите

  1. Для промывания до 24 подложек одновременно, подготовить по крайней мере 250 мл 1x SSPE - 0,1% Тритон Х-100 промывочным буфером, и два контейнера с по меньшей мере 250 мл деионизированной или Milli-Q воду, содержащую в каждой. Промывочный буфер может быть подготовлен заранее.
  2. Осторожно снимите крышку скольжения и прокладку от каждого усиления микрочипов камеры с использованием плоским конечных щипцов. Этот шаг является точка, в которой есть наибольший риск физически разрушительных массивов гель элементов. Используйте соответствующие средства управления загрязнения ПЦР для предотвращения распространения усиленных нуклеиновых кислот в рабочей среде.
  3. Наведите микрочипов подложки в держателе гистология слайд, и поставить все слайды в моющем бен содержащей промывочный буфер. Накройте контейнер с крышкой.
  4. Промыть микрочипов в течение 10 мин при комнатной температуре и осторожном встряхивании.
  5. Опустите микрочипов по три раза в двух последовательных промываний деионизированной илиMilli-Q класса вода, и воздух сухой.

5. Изображений

Асимметричный МЛУ-ТБ грунт смесь генерирует Су3 меченные ампликоны. Гель элемент микрочипы могут быть отображены с любым стандартным микрочипов томографа, способного изображений Cy3. Следующая процедура визуализации является специфическим для мастер-микс МЛУ-ТБ, поля Dx2100 портативного тепловизора, и автоматизированное программное обеспечение анализа предоставленной Akonni.

  1. Убедитесь, что сетевой кабель от тепловизор подключается к компьютеру.
  2. Включите тепловизор. Выключатель питания расположен на задней панели прибора. Синие светодиоды на передней тепловизор будет гореть, когда тепловизор включен.
  3. Включите компьютер.
  4. На рабочем столе компьютера дважды щелкните значок программного обеспечения для запуска автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений.
  5. Подождите, пока программное обеспечение, чтобы установить связь с тепловизора камеры. После того, как соединение установлено, кнопка Анализ становится доступным, исообщение "Подключение Успешная" появится в левом нижнем углу экрана.
  6. Вставьте высушенного усиления микрочипов с микрочипов отворачиваясь от пользователя, и к объективной линзы. Если микрочипов неправильно ориентирована относительно объектива и камеры, автоматизированный анализ программного обеспечения не сможет размещать сетку на изображении флуоресценции.
  7. Закройте крышку доступа. Предварительный просмотр будет доступна на экране компьютера.
  8. Выберите сценарий анализа МЛУ-ТБ от выпадающем меню и введите нужные Выдержка (в миллисекундах). Типичный отправной точкой для гель элементов усиления микрочипов является 100-500 мс.
  9. Насыщенные пикселей будет отображаться на Предварительный просмотр в красный цвет. Регулировка времени экспозиции, чтобы минимизировать количество насыщенных пикселей в отдельных точках.
  10. Нажмите Анализ приобретать и проанализировать изображение флуоресценции. Программное обеспечение автоматически разместитьМЛУ-ТБ анализ конкретных сетки на изображения, извлекать интегральной интенсивности и фоновые значения, и сообщить о лекарственной устойчивости и генотипирования результаты. Автоматизированный анализ обычно занимает несколько секунд. Для сложных изображений, содержащих царапин, пыли, флуоресцентные артефакты, или физический ущерб особенностей микрочипов, программное обеспечение может потребоваться до 1 мин для завершения анализа.
  11. После завершения анализа, нажмите кнопку Сохранить, выберите папку назначения, вид в имени файла и нажмите кнопку ОК. Основные данные микрочипов сохраняются как. Файл XLS и могут быть экспортированы для офф-лайн анализа, если это необходимо.
  12. После завершения анализа, удалите усиления микрочипов с тепловизором, и нажмите кнопку Создать, чтобы начать следующий анализ.
  13. После завершения сбора данных, закрыть программное обеспечение, выключить компьютер и выключите тепловизор.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Качественный анализ изображений может обеспечить понимание источников экспериментального шума или изменчивости, которые сложно определить в таблицах данных, генерируемых автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений. Таким образом, это может быть полезно, чтобы визуально убедиться, что 1) все элементы гель целы и не повреждены, 2) глобальный фон свободен от люминесцентных артефактов, которые могут повлиять на индивидуальный сигнал-шум (SNR) значения, 3) нет доказательств образование пузырьков или неравномерное усиление / гибридизации через массив и 4), что программное обеспечение точно определены все пятна на микрочипов изображения. Пример МЛУ-ТБ усиления микрочипов изображения показано на рисунке 1, иллюстрирующая массив высокого качества и артефактов, которые могут возникнуть из-за физических повреждений или пузырьков при термоциклировании. Стандартное программное обеспечение анализа микрочипов изображения, как правило, в состоянии поставить сетку и извлечь интегральной интенсивности и фоновое данные даже из качественных изображений бедных, таких как шсамостоятельно на рисунке 1b, так это возложено на исследователя установить критерии контроля качества и показатели для принятия или отклонения микрочипов изображения из дальнейшего анализа. Резервирование зонд может помочь улучшить эти вопросы. Тем не менее, полностью автоматизированная, диагностики МЛУ-ТБ алгоритм отчетности усиления микрочипов в противном случае объявить тест из фиг.1В как "инвалид".

Значения SNR Усиление микрочипов для серии разведений дикого типа H37Ra геномной ДНК приведены в таблице 2. В 6,25 пг входного геномной ДНК на реакцию или примерно 1,25 · 10 3 клеточных эквивалентов, все зонды дикого типа легко обнаружить. Значения SNR для каждого из внутреннего усиления и торможения управления варьировались от 98,48 (гроВ) в 967,24 (Akonni-поставляется внутренний положительный контроль), указывая, что все цели генов в асимметричной мультиплексной реакции амплификации усиливаются и обнаружению. Нетуправления шаблона были отрицательными (SNR <3) для всех зондов в амплификации микрочипов. Генотипирования отношения на 6,25 пг входного ДНК варьировались от 0.18-1.00 для всех зондов пар WT / MU, что свидетельствует правильное поведение WT и MU зондов и соответствующей генотипирования.

Репрезентативные данные генотипирования на панели Всемирной организации здравоохранения эталонных штаммов известного генотипа показаны в таблице 3. Если один нуклеотидный полиморфизм (SNP) представлена ​​на гель элемента микрочипов, то тест усиление микрочипов точно обнаруживает соответствующую мутацию в MDR -ТБ генома. Некоторые из усиления микрочипов зондов также чувствительны к ближней соседних мутаций, которые явно не представленных на массив как уникального зонда. Например, изолировать TDR-0129 содержит мутацию S531E в гене гроВ, но не специфический зонд на амплификации микрочипов для S531E. Тем не менее, пять других зонды SNP targetinг кодон 531 показывают, что мутация присутствует в кодоне 531 - усиление микрочипов поэтому правильно указывает, что этот изолят рифампицин устойчивы. Похожие чувствительность к мутации гроВ S513W очевидно для изолята TDR-0148. С другой стороны, некоторые зонды SNP не чувствительны к вблизи мутаций соседние, как показано на изолята TDR-0148 и мутации гроВ S512G, и изолировать TDR-0011 и мутацию katG S315R. Мы подозреваем, что этот тип поведения зонда является следствием вторичной и третичной структуры в одноцепочечной ампликона и / или зонда 34, и не то, что можно предсказать заранее. Тем не менее, чувствительность датчика к близким мутаций соседних аналогично использованию неаккуратных молекулярных маяков для обнаружения множественные мутации лекарственной устойчивости с минимальным набором ПЦР в реальном времени зонды 35,36, и может быть диагностически выгодно при условии, что тест не создает ложных срабатываний отноTive к фенотипической лекарственной чувствительности.

Рисунок 1
Рисунок 1. (А) Пример усиления микрочипов на изображение для 100 пг дикого типа М. туберкулез H37Ra геномной ДНК и 100 раз мс экспозиции. Cy3 маяки (для автоматизированного Gridding и сегментации программного обеспечения) находятся на периферии изображения. (B) Изображение амплификации микрочипов показывая флуоресцентный гало артефакт в результате образования пузырьков при термоциклировании, и повреждены гель элементы / мусора. Программное обеспечение автоматизированных анализа изображений по-прежнему в состоянии поместить сетку и извлекать данные из этого образа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

<TR>
Компания Номер по каталогу
Akonni биосистем Спрашивать
Qiagen # 206143
Qiagen # 201207
Qiagen # 206143
Thermo Fisher Scientific, Inc # BP227-500
Sigma-Aldrich # 3B6917
Akonni биосистем Спрашивать
Akonni биосистем Спрашивать
Thermo Fisher Scientific, Inc # BP1328-4
Thermo Fisher Scientific, Inc # BP151-500
Текущие Technologies, Inc # BRSPRAY128
Decon Labs, Inc # 8416
Компания Номер по каталогу
Akonni биосистем 100-20011
100-10021
ArrayIt Горячее водоснабжение
Thermo Fisher Scientific, Inc # 10-300
VWR # 3365040
VWR # 93000-196
Центральный Пневматический # 95630

Таблица 2. Необходимые материалы и оборудование.

69 "> 329,09 <класса тд = "xl69"> 109,90 р: нет "> 816,64
Кодон Зонд
ID
WT зонд SNR Значения 500 пг 100 пг 50 пг 25 стр. 12.5 пг 6.25 пг
гроВ 507 1 900,22 644,46 523,17 431,08 364,49 287,47
3 1016,37 699,38 600,16 525,07 446,51 361,64
511 5 867,67 611,97 529,90 451,73 403,76 307,68
512 8 810,69 544,04 488,85 436,89 391,62 257.46 г>
513 11 824,36 547,04 496.00 472,01 408.96 242.25
515 15 715,48 536.59 416,96 335,81 267,48 189.10
516 17 723,83 496,44 402.95 270.10 201.98
522 27 674,37 413.33 360,40 316.75 236.19 153.40
524 29 269,46 153.69 117.71 118.02 110.13 51.22
526 31 136.37 82.63 76.76 53.61 37.76
531 44 219,92 136.31 109.16 96.18 80.58 26.44
533 51 130.54 83.60 76.03 63.47 61.35 41.54
RPSL = "Xl71"> 43 54 10.41 12.75 53.30 767,18 5.39 362,42
88 56 655,54 542,79 527,43 690,34 403,86 456,05
katG 315 58 1037,03 873,46 974,83 811,79 876,47
embB 306 66 940,81 781,13 788,75 837,65 787,05 696,69
Инга 8 82 1069,43 934,38 862,58 936,88 809,85 682 0,56
15 85 1111,66 931,88 918,22 957,87 795,72 723,16
17 87 1114,49 926,03 920,60 970,70 854,15 744,41

Таблица 3. Сигнал-шум для дикого типа зондов и серии разведений М. туберкулез H37Ra геномной ДНК. значения SNR> 3 считаются обнаружено.

ntent "FO: держать-together.within-страницу =" всегда "> Таблица 4
Таблица 4. Представительства данных генотипирования с МЛУ-ТБ изолирует известного генотипа при 25 пг на реакции амплификации микрочипов. Звездочки идентификации мутаций, которые не представлены на уникальной зонда на элемент микрочипов геля. WT = дикого типа последовательность нуклеиновой кислоты. Отрицательные значения (жирный и затененные) свидетельствуют о мутации, следовательно фенотипической лекарственной устойчивости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Степень мультиплексирования с амплификации микрочипов, в конечном счете диктуется эффективности мультиплексной асимметричной ПЦР, а не микрочипов. По нашему опыту, 10-12 уникальных пары праймеров может быть легко мультиплексирован в формате усиления микрочипов. Поэтому обычные праймеров и зонда конструкции критерии применяются к новым анализов, за исключением того, необходимо также учитывать потенциальных взаимодействий между раствор фазы нуклеиновых кислот и иммобилизованных зондов, микрочипов тепловой эффективности термоциклер, и поведение зонд гибридизации в буфере ПЦР что также содержит ПЦР праймеры и низкие артефакты молекулярные веса усиления. Высоко мультиплексированных подходы усиления, такие как всей усиления генома не способствуют протокола амплификации микрочипов однокамерного для ряда технических причин, в том числе помехи между случайными гексамеров и иммобилизованных зондов и неэффективного гибридизации длинных двухцепочечных ампликонами. Тамтакже взаимосвязь между простотой в использовании, время общего анализа и пределов обнаружения, что отдельные пользователи должны будут учитывать при разработке пользовательских анализов или используя тест МЛУ-ТБ, описанный здесь. Например, уменьшение количества циклов амплификации и даже устранение гибридизации шаг после амплификации позволит значительно сократить общее время анализа, но за счет чувствительности теста. С другой стороны, достижение воспроизводимый 10 генов предел обнаружения копия может потребовать больше циклов амплификации или время гибридизации, таким образом расширяя общее время анализа за одну рабочую смену.

Гены, мутации, тепловизор, программное обеспечение для анализа и отчетности алгоритм, описанный здесь, являются иллюстративными метода амплификации микрочипов и системы, а не отчет о своей аналитической работы и клинической полезности. Например, исходный образец может быть мокроты, обеззараживать осадка, твердых или жидких культур - требованиеДля амплификации микрочипов просто, что извлеченные нуклеиновые кислоты амплификации путем асимметрического, мультиплексированных ПЦР. Некоторые исследователи или врачи могут найти практически нет клиническое значение в выявлении RPSL или embB мутации, которые придают устойчивость к стрептомицину и этамбутол, соответственно, только устойчивость к рифампицину и изониазиду определить МЛУ-ТБ. Таким образом, эти ПЦР-праймеры и зонды микрочипов может быть заменен праймеров и зондов, предназначенных гены и мутации, придающие устойчивость к другим первой или второй линии антибиотиков. Можно написать алгоритм отчетности, чтобы предоставить пользователю подробную информацию о конкретных мутаций, обнаруженных в образцах, что, а не простого «сопротивления обнаруженного" или "сопротивление не определяется" результат. Для тех исследователей, заинтересованных в использовании этой конкретной анализа для анализа М. туберкулез изолирует, это также можно предоставить данные генотипирования даже если IS6110 элемент не detecteг в образце.

Независимо от возможных анализа и отчетности перестановок, усиление микрочипов и протокол, описанный здесь предназначен для значительного упрощения микрочипов рабочий процесс путем объединения нескольких шагов молекулярной биологии в единый биохимической реакции и микрофлюидных камеры. Представительные данные демонстрируют эффективность подхода, усиливая девять МЛУ-ТБ геномные регионы и обнаружения этих асимметричных ампликоны с низкой плотностью гель элемента микрочипов. Протокол, описанный здесь использует процедуру промывки объемной, что требует от пользователя физически удалить прокладку и покровного стекла от усиления микрочипов до мытья, и поэтому больше подходит для исследования использования только для приложений, а не клинической диагностики. Как описано в другом месте, однако, это, конечно, возможно включить стиральную шаг на-чипе с использованием струйной боковая потока 33 и, следовательно, сохранить полностью закрытую Amplicon расходные, вклuding тот, который может быть легко включены в систему диагностики выборки в ответ отъезда, который подходит для точка-санитарной помощи приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (NIH) под грант RC3 AI089106.

МЛУ-ТБ нуклеиновые кислоты были предоставлены Программой развития / Фонда Организации Объединенных Наций / Всемирного Специальной программы банк / World помощи детям Организации Объединенных Наций организации здравоохранения по исследованиям и подготовке специалистов в области тропических болезней (ТБИ), Женева, Швейцария.

Мы благодарим доктора Тома Шинник из Центров США по контролю и профилактике заболеваний для руководства о конкретных генов и мутаций, чтобы включить в анализе прототипа.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
  2. World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
  3. Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
  4. Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
  5. Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
  6. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  7. Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
  8. Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. 3292-3297 (2012).
  9. Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
  10. Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
  11. Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
  12. Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
  13. Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
  14. Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
  15. Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
  16. Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
  17. Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
  18. Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
  19. Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
  20. Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
  21. Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
  22. Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
  23. Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
  24. Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
  25. Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
  26. Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
  27. Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
  28. Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
  29. Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
  30. Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
  31. Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
  32. Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
  33. Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
  34. Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
  35. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
  36. Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics