Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Использование беспозвоночных Galleria mellonella в качестве модели инфекции для изучения комплекса туберкулеза микобактерий

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

Journal (Immunology and Infection)

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Journal (Immunology and Infection)

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Click here for the English version

Использование беспозвоночных Galleria mellonella в качестве модели инфекции для изучения комплекса туберкулеза микобактерий

Article DOI: 10.3791/59703-v

June 30th, 2019 •

Masanori Asai*¹, Yanwen Li*¹, Jasmeet Singh Khara^1,2, Camilla A. Gladstone¹, Brian D. Robertson³, Paul R. Langford*¹, Sandra M. Newton*¹

¹Section of Pediatric Infectious Diseases and Allergy, Department of Medicine, Imperial College London, ²Department of Pharmacy, National University of Singapore, ³MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Department of Medicine, Imperial College London

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

June 30th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Galleria mellonella была недавно создана как воспроизводимая, дешевая и этически приемлемая модель инфекции для комплекса mycobacterium tuberculosis. Здесь мы описываем и демонстрируем шаги, предпринятые для создания успешной инфекции G. mellonella с биолюминесцентными Mycobacterium bovis BCG lux.

Transcript

Этот протокол описывает использование Galleria mellonella в качестве альтернативной модели инфекции для изучения туберкулеза, уменьшая количество моделей млекопитающих, используемых в исследованиях. По сравнению с обычными моделями млекопитающих, такими как мыши, Galleria mellonella является более дешевой, этически приемлемой и более доступной моделью для изучения туберкулеза. Дальнейшая оптимизация этой модели позволит скрининг эффективности и токсичности препарата-кандидата и будет способствовать разработке срочно необходимых новых терапевтических средств от туберкулеза.

Galleria mellonella обладает сложной врожденной иммунной системой, сравнимой с системой млекопитающих. Изучение взаимодействия хозяина и патогена может еще больше выявить роль врожденного иммунитета при туберкулезе. Использование Galleria mellonella в качестве инфекционной модели не ограничивается туберкулезом и широко используется для других бактериальных и грибковых патогенов в течение последнего десятилетия.

Для начала разморозите замороженный 1,2-миллилитровый глицерол запас Mycobacterium bovis BCG lux, штамм вакцины в Монреале, преобразованный с шаттл плазмидным pSMT1, несущим гены luxAB. В помеченной 250-миллилитровой колбе Erlenmeyer прививают 15 миллилитров бульона Middlebrook 7H9 с разморощенной 1,2-миллилитровой алицита BCG lux. Поместите колбу в герметичный контейнер для биобезопасности и инкубировать при 37 градусах цельсия в орбитальном инкубаторе шейкера при 220 об/мин в течение 72 часов.

После инкубации приготовьте 1:10 разбавления культуры в фосфатно-буферном солевом растворе в люминометровых трубках, вихре и загрузите люминометрические трубки в люминометр. Загрузите субстрат 1%n-дециляльдегид в абсолютный этанол в платформу инжектора и измерить биолюминесценцию. Преобразование биолюминесценции в колониообразующие единицы для проверки роста культуры люкс BCG.

Передача культуры в центрифугу трубки и центрифуги на 2, 175 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки. Откажитесь от супернатанта в соответствующее дезинфицирующее средство с известной микобактериоцидной активностью. Вымойте клеточные гранулы дважды в 50 миллилитров PBS-T путем центрифугирования в 2, 175 раз г в течение 10 минут, чтобы предотвратить бактериальное слипание.

После окончательной стирки, декант отходов supernatant и повторно mycobacterial ячейки гранулы в требуемом объеме PBS-T разбавить микобактериальной подвески до желаемой плотности клеток. Затем приготовьте 10-кратное серийное разбавление инокулума в 24-х пластинах с помощью PBS-T. Плита из 10 микролитров каждого разбавления на Middlebrook 7H11 агар пластин в дублировать перечислить инокулума CFU рассчитывает.

Поддерживайте приобретенные личинки instar в темноте при 18 градусах по Цельсию по прибытии и используйте в течение одной недели после покупки. Определите и выберите здоровых личинок для экспериментов на основе равномерного цвета крема, соответствующего размера и веса, высокой подвижности, и обладающих способностью исправить себя при включении. Используя пинцет тупого конца, тщательно подсчитайте здоровых личинок в чашку Петри выстроились с слоем фильтровальной бумаги и хранить при комнатной температуре в темноте до использования.

Подготовьте платформу впрыска, приклеив круглую фильтровальную бумагу диаметром 94 миллиметра к плоской, поднятой поверхности. Аспирировать три тома 70% этанола в 25-микролитер микросирол для стерилизации, отбрасывания и дальнейшего полоскания с тремя томами стерильных PBS-T. Затем, resuspend подготовленный BCG люкс inoculum и аспирировать 10 микролитров в стерилизованной микросырья.

Используйте отдельный шприц для аспирации PBS-T для отрицательного контроля. После 10 инъекций, повторно использовать BCG люкс inoculum для обеспечения равномерной подвески клеток. Используйте пинцет, чтобы забрать одну личинку и поместить на платформу инъекций.

На платформе переверните личинку на спину и обездвиживайте, закрепив голову и хвост пинцетом. Найдите последний левый пролег, отсчитывание от головы личинки и тщательно вставьте кончик иглы глубиной от пяти до шести миллиметров под углом от 10 до 20 градусов к горизонтальной плоскости. Ввимить инокулум из шприца.

После каждой инфекции перенесите зараженную личинку в чашку Петри, облицованную слоем фильтровальной бумаги. Одна 94-миллиметровая чашка Петри может вместить до 30 личинок. Храните чашку Петри в вентилируемой темной коробке внутри инкубатора при 37 градусах Цельсия с 5%углекислым газом.

Следите за выживаемость личинок каждые 24 часа. Личинки считаются мертвыми, когда они не могут двигаться в ответ на прикосновения. Завехать выживаемость и оценить статистическую значимость с помощью теста Мантел-Кокс.

Каждые 24 часа, случайным образом выбрать пять инфицированных личинок и использовать ватный тампон, пропитанный 70% этанола мягко стерилизовать личиночинок поверхностей. Поместите личинки по отдельности в двухми миллилитровые лизайные матричные трубки, содержащие 800 микролитров стерильных PBS. Затем используйте гомогенизатор для гомогенизации личинок в течение 60 секунд при шести метрах в секунду.

Центрифуга лисинг трубки на 3, 500 раз g в течение пяти секунд, чтобы удалить гомогенат из крышки и тщательно декант гомогената в пять стерильных люминометр трубки индивидуально. Зарезервировать 100 микролитров гомогената в стерильной 1,5-миллилитровой реакционной трубке. Восстановите оставшийся гомогенат путем мытья лизных матричных трубок одним миллилитром PBS-T и пипеткой в соответствующие люминометрические трубки.

Вихрь люминометра труб и измерения биолюминесценции гомогенатов на люминометре. Затем приготовьте 10-кратное серийное разбавление зарезервированных 100 микролитров гомогената в 24-колодец культурных пластин с помощью PBS-T. Pipette 10 микролитров разбавления на каждой агарной пластине Middlebrook 7H11 и использовать стерильный пластины распределитель для распространения.

Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение двух недель. После этого подсчитывайте колониообразующие единицы. Определите RLU к CFU отношение BCG lux следуя за инфекцией in vivo.

В этом эксперименте, BCG люкс доза зависит вирулентность наблюдалась в личинках G.mellonella в течение 96-часового инкубационный период. Смертельная доза, необходимая для 50%ларвал смертности было установлено, что один раз 10 к власти семь CFU. Контрольные группы, вводимые с 10-микролитерной дозой PBS-T или те, которые просто кололи, имитируя травмы иглы, не повлияли на здоровье личинок и не привели к увеличению смертности.

Для личинок, инфицированных два раза 10 к власти семь CFU дозы BCG люкс, меланизация личинок спинной линии наблюдалось от 48 часов после инфекции и системной меланизации наблюдалось от 96 часов после инфекции. Инфекция с одним раз 10 к власти семь CFU дозы BCG люкс привело к первоначальному снижению биолюминесценции в течение первых 72 часов после инфекции. Однако, после 72 часов после заражения, биолюминесценция BCG люкс начал плато, что свидетельствует о создании стойких инфекции.

В этой конкретной инфекционной системе коэффициент in vivo RLU и CFU колебался от 2:1 до 5:1 при среднем 4:1 в течение 168-часового курса. Во время инъекции не забудьте обезопасить личинки так, чтобы свести к минимуму риск чрезмерного протенетирования. Случайный прокол кишечника может привести к увеличению смертности.

Проводя гистопатологический анализ, можно визуализировать введение микобактерий с клетками-хозяинами. Дальнейший транскриптомный анализ может выявить взаимодействие на геномном уровне. Использование этой инфекционной модели может позволить быстрое тестирование новых кандидатов наркотиков на ранней стадии разработки, значительно сократив количество животных, используемых в скрининге наркотиков.

Эта модель инфекции требует использования шприца, который может быть связан с травмой иглы палкой. Мы рекомендуем использовать нашу технику инъекций, чтобы свести к минимуму такой риск.

X

Simple Hit Counter