乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

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Summary

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。

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Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

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Abstract

エストロゲンは乳腺発達および乳癌進行において重要な役割を果たしている。これは、に結合し、エストロゲン受容体(ERの)を活性化することによってその機能を媒介ERαおよびERβ。 ERαは、しばしば、乳癌においてアップレギュレートし、乳癌細胞の増殖を駆動する。 ERは、転写因子として機能し、遺伝子発現を調節する。タンパク質をコードする遺伝子のERαの規制が十分に確立されているのに対し、マイクロRNA(miRNAを)の非コードの、その規制が少ない探検です。 miRNAは、それらの翻訳を阻害すること又はそれらのmRNAを分解する遺伝子の転写後調節において主要な役割を果たす。 miRNAは、癌遺伝子や癌抑制として機能することができ、また、バイオマーカーを期待されている。利用可能なmiRNAアッセイの中で、マイクロアレイおよび定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、広範囲のmiRNAレベルを検出および定量するために使用されている。乳癌、目にエストロゲンシグナル伝達によって調節されるmiRNAを同定するためにERα陽性乳癌細胞株をμParafloマイクロ流体マイクロアレイおよびデュアル標識プローブ低密度アレイの両方を使用して、エストロゲンの活性化の前後で比較したEIR発現。結果は、シアニン色素系および二重標識プローブベースの化学の両方を適用し、特定の定量PCRアッセイを用いて検証した。さらに、時間ポイントアッセイは、経時的に規則を識別するために使用した。本研究で使用したmiRNAアッセイアプローチの利点は、それがさらに制限されたサンプル量で、多数の試料中の成熟miRNA規制の高速スクリーニングを可能にすることである。特定の細胞培養のための条件とエストロゲン治療、生物学的および技術的反復、および大規模なスクリーニングを含むレイアウトは、別々の技術を使用して、詳細な確認をした後、miRNAの規制のロバストな検出が保証され、偽陽性やその他の成果物を除去します。しかし、変異または未知のmiRNA、またはプライマリおよび前駆体転写産物のleveの規制Lは、検出されません。ここで紹介する方法は、エストロゲン媒介miRNA調節の徹底的な調査を表しています。

Introduction

エストロゲンは乳腺発達の間には重要であるホルモンです。エストロゲンはまた、乳癌1の開発、保守、リスク、および治療 ​​において重要な役割を果たしている。エストロゲンは転写因子であり、特定の標的遺伝子を調節するのERへの結合によってその機能を発揮する。 2つの受容体の変異体のうち、ERαは乳癌細胞のエストロゲン依存性増殖に必須である。ほとんどの乳癌は、ERα陽性であり、成長のためのエストロゲンに依存します。これはエストロゲンシグナル伝達およびホルモン受容体陽性乳癌の治療のため、ERα標的になった。 ERαの基本的なメカニズムを理解することは、治療成績を向上させ、治療に対する抵抗性を克服し、乳がんが発展方法を理解することが重要です。

miRNAは、原因転写後遺伝子調節にその大きな影響を細胞機能において重要な役割を果たしている。 miRNAは、19〜24ヌクレオチド短く、一本鎖、最初にプライマリのmiRNA転写産物(プリmiRNA)にRNAポリメラーゼIIによって転写される非コードRNA。それらは、短ヘアピン前駆体のmiRNA(プレmiRNA)へのDroshaにより核内で処理された後、ダイサーによって処理され、細胞質中の成熟miRNAを形成するために一本鎖に分離される。一本鎖の成熟miRNAがRISC複合体を形成するアルゴノートタンパク質に転写される。次いで、miRNAは翻訳を遮断または標的mRNA 分解することによって2転写後調節をもたらす、標的mRNAの3'-非翻訳領域(3'-UTR)とハイブリダイズすることができる。

によるエストロゲンおよびmiRNAの両方が正常であるか破壊されたエストロゲンシグナル伝達に関連するmiRNAを同定する、腫瘍の進行に果たす重要な役割に発展の我々の理解を高め、乳癌の治療を改善するために重要である。 ERαは、タンパク質をコードする遺伝子を制御する方法を十分に理解、拡張がありますがとRNAの規制非コードの詳細は徹底的に調査されていない。乳癌細胞株におけるmiRNAのERα調節を解明することを目的と初期の研究では、同一の細胞株は3-6分析された場合であっても、矛盾する結果が得られている。これは、様々な治療、生物学的な変形、異なる技術の使用、およびmiRNAの小さいサイズはそれらを分析するために挑戦させるという事実の結果であってもよい。ここで、変動及び方法の成果物用のコントロールプロトコルが記述されている。

miRNAはエストロゲンによって調節されるかを識別するために、ERα活性の明確に定義された乳癌モデルのプロファイリングは、最初のステップである。いくつかの細胞株は、臨床的な乳癌の大多数と同様のエストロゲンに依存するヒトERα陽性乳癌腫瘍から生成されている。 ERαおよびその下流標的の発現を含むこれらの細胞株のうちの2つT47DおよびMCF7の分子特性、プロゲステロンホルモン受容体(PR)、膜受容体HER2の発現の欠如は、エストロゲン応答及び管腔の上皮分化遺伝子の発現とともに、乳房腫瘍7-10の管腔サブタイプのモデルは、それらに適したものにする。 17β-エストラジオール(E2)は、エストロゲンの主要な形態であり、ERαの転写活性化のための最適な濃度および時点は、複数の研究において特徴付けられている。このプロトコルでは24時間、10nMのE2処理は、乳癌細胞におけるERα1活性のためのモデルとして使用され、T47D及びMCF7れる。また、時間依存性のmiRNAの規制は、具体的には、例えば 1〜72時間の時間間隔で分析することができる。

第二に、分析のmiRNAは、その短いサイズに部分的には、別々の課題があります。定期的なグアニジンthiocyanate-phenol/chloroform/isopropanolたRNA沈殿を行った場合、またはSTれるときmiRNAは良く、全RNA調製に保持されていませんandard列精製は使用されている。特別な措置は維持またはRNAの小さな部分を濃縮するために注意する必要がある。遠心分離(-80°C)の前に温度を下げ、イソプロパノールの体積を増大し、70%エタノールでの洗浄を省略することにより、miRNAの保持は、沈殿中に向上させることができる。あるいは、miRNAを含むトータルRNAの高品質と堅牢調製のための特定の列および緩衝液を用いることができる。また、分析の自身のために、彼らの短いサイズは、課題を作成します。マイクロアレイ、定量PCR、次世代シーケンシング:ゲノムワイドなmiRNAスクリーニングのために、3つの一般的な中から選択する技術をプロファイリングmiRNAがあります。各技術は、アーチファクトを導入する別のリスクにそれぞれ、複数の異なるプラットフォームを使用して行うことができ、異なるサンプル調製が必要である。 miRNAのマイクロアレイでは、スライドは、オリゴヌクレオチドの数千でスポットまたは合成さ​​れる。これらのオリゴヌクレオチドはプローブとして使用され、プローブの各々sが、特定のmiRNA配列にハイブリダイズするように設計されている。この研究で実行されるようにマイクロアレイのためのサンプル調製は、最初のmiRNAのために豊かにしてからのmiRNAの上のCy5およびCy3ラベリングを紹介します。マイクロアレイは、同時に多数の遺伝子の相対的発現レベルを観察する機会を与え、迅速かつ多数の試料をスクリーニングするのに適しているが、唯一のマイクロアレイ上に配列が存在し、分析することができ、 例えば、変化を検出しないであろう未知のまたは変異miRNAは。このプロトコルで実行されるようなマイクロアレイ分析はまた、分析用試料当たりの全RNA、比較的大量の、約5μgを必要とする。低密度のqPCR miRNAプロファイリングは、少ない材料(700 NG /サンプルおよび複製)を必要とし、miRNAの検出および定量化を可能にします。転写レベルを決定することができる、および量は、絶対量又は相対量であることができる。 qPCR分析は、第ここでループを用いて、cDNAへのmiRNAの変換を必要とするだけ成熟したmiRNAの解析を確実にそれぞれの特定のmiRNAのためのプライマー。これは、miRNA特異的順方向プライマーおよびループ配列に相補的なユニバーサルリバースプライマーを用いて増幅することができる、より長いテンプレートを生成し、その特異性について二重標識プローブの包含を抱くことができる。定量PCRは、数百のmiRNAが、各々のウェル11内の個々のプライマー対を有する1つまたはいくつかの384ウェルプレートを用いて並行して検出することができる低密度形式で使用することができる。次世代シークエンシングは、一方では、試料中の全てのRNAが11を配列決定することができるように新規な変異または編集されたmiRNAの発見を可能にするこれらの技術のみである。しかしながら、この技術は、低分子RNAを豊かにし、それらのサンプル間の相対的な発現レベルを調節する後続の強化されたリスクにリンカーライゲーションおよび精製のいくつかのステップを使用して小RNAライブラリーを生成するために複数のステップを必要とする。それはまた、有意なbioinformatiを必要とCS分析。 miRNAプロファイリングのための様々な技術を考えると、最も適切な方法は、アプリケーションによって異なります。材料は比較的豊富で、関心は既に知られているmiRNAの発現差を定義するときにマイクロアレイが最も適しています。試料の限られた量が使用可能であり、低発現miRNAの高感度が要求される場合に、低密度のqPCRアレイが最も適している。配列決定により、変異した未知のmiRNA、またはmiRNAの異なるアイソフォームの分析が必要な場合に最適です。

乳癌におけるエストロゲン制御されたmiRNAの研究では、2つのモデル細胞株は、大量のRNAは、容易に入手可能であるT47D及びMCF7を、使用されている。各細胞株は、治療の技術的反復において、それぞれ異なる通路を使用して、複製された細胞培養物中で分析した。これは再現性、ERα調節性miRNAの堅牢な検出を可能にする。相対的なmiRNAの発現レベルは、両方のmiRNAマイクロアレイを用いて比較した二重標識プローブ - 低密度アレイ(DLP-LDA)とシアニン色素とDLPの化学的性質の両方を使用して、特定の定量PCRの結果を検証しました。 miRNAの規制はその後さらにエストロゲン誘導規制からランダムまたは概日変動を差別化し、二次的効果から主な効果を示すことができます時間をかけてその正確なレギュレーションを定義するために、時系列で分析した。 ERαのクロマチン結合の研究とバイオインフォマティクスの比較は二次的影響に対する原発の分化をさらに助けることができます。アッセイは、それが24時間のE2処理タンパク質をコードする転写産物の後に容易に調節されたが、成熟したmiRNAは1に影響与えていなかったことを確立することができたのmiRNA規制の信頼できる評価が得られた。しかしながら、選択されたmiRNAの1の時系列分析で実証されるように、miRNAは後述の時点で調節されることが可能である。詳細はさらに検討する必要があり、ここに提示プロトコルはローバスを提供乳癌細胞株における成熟miRNAのホルモン調節を研究するためのtの方法。

Protocol

1。細胞培養培地の調製

  1. T47D細胞株培養液の場合:
    1. オートクレーブした1Lボトル500mlのF12を[DMEM/F12(1:1)]で500ミリリットルダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を混ぜる。
    2. ウシ胎児血清を50ml(これは、5%FBSを行う)、その後、ペニシリンストレプトマイシンを10ml(これは、1%PESTとなる)を添加する。内容物を完全に混合します。
    3. 4℃で保存する
  2. MCF7細胞株培養液の場合:
    1. FBS(5%FBS)の25ミリリットル、およびペニシリンストレプトマイシン(1%PEST)の後、5ミリリットルと500ミリリットルのDMEMを混ぜる。
    2. 4℃で保存する
    3. 還元血清培地の場合:
      1. T47Dの場合:オートクレーブした1Lボトルに500ミリリットルのF12(1:1)で500ミリリットルのフェノールレッドを含まないDMEMを混ぜて、5%DCC-FBSのためにデキストランコート活性炭処理(DCC)、FBSの50ミリリットルを追加します。 0.5%DCC-FBSのために5ミリリットルDCC-FBSを別のボトルを作る。次に、各ボトルにPEST(1%PEST)の10ミリリットルを追加。完全に内容物を混合、STOR4℃でのE
      2. MCF7の場合:100×L-グルタミン(200mMの最終濃度)の5ミリリットルと500ミリリットルのフェノールレッドを含まないDMEMを混ぜる。 DCC-FBS(5%DCC-FBS)の25ミリリットルを追加します。 2.5ミリリットルのDCC-FBS(0.5%DCC-FBS)を別のボトルを作る。次に、各ボトルにPEST(1%PEST)の5ミリリットルを追加。 4℃で、完全に店を内容物を混合
    4. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液の場合:
      1. 超純水や蒸留水で1Lのオートクレーブガラスボトルを埋める。
      2. 1 PBS錠を追加し、タブレットが溶解するまで、時々横に振る。
      3. 室温でのPBS溶液とストアオートクレーブ。
    5. リガンド株式の調製:
      1. 無菌1.5 mlのマイクロ遠心チューブに100μlのエタノールまたはDMSOに17β-エストラジオールの2.72ミリグラムを溶解することによってE2の100 mMストック溶液を調製し、静かに内容物を混合。簡単にスピンと10ミリ得段階希釈(1:10)を作成、1 mmであり、0.1 mM保存concentr溶剤を使用して管理ポイント。 -20℃で、すべてのE2の原液を保存
      2. 無菌1.5 mlのマイクロ遠心チューブに100μlのエタノールまたはDMSOにICI 182,780の6.07ミリグラムを溶解することによって、ICIの100 mMストック溶液を調製し、静かに内容物を混合。簡単にスピンと10 mMの、1 mMの、溶剤を使用して0.1 mMストック濃度を得るために段階希釈(1:10)します。 -20℃で、すべてのICI原液を保存
      3. 車両は、溶媒(エタノールまたはDMSO)である。 -20℃で滅菌した1.5​​ mlのマイクロ遠心チューブ、およびストアで100%エタノールまたはDMSO 0.5〜1ミリリットル置き

2。細胞培養および治療

技術的反復のための二重または三重のプレート内の各処理を行う。この細胞株の生物学的複製として役立つ同じ細胞株の異なる通路を用いた細胞培養手順および処理を繰り返す。 REPLとは異なる細胞株を使用して手順を繰り返します複数の細胞株での調査結果をicate。すべての細胞培養技術は、層流フード内で無菌条件下で実施すべきである。

  1. 細胞培養の起動
    1. 無菌温水浴中で37℃にメディアを温めます。
    2. T47DまたはMCF7細胞の凍結バイアルを解凍する。
    3. 70%エタノールでバイアルとメディア瓶の外側を洗浄した後、無菌層流フード内でバイアルとボトルの両方を置く。
    4. (フード内)に応じて、無菌のT-75フラスコにラベルを付けます。
    5. (その表面が完全にメディアに覆われていることを確認)、滅菌血清学的ピペットを用いてフラスコ内に適切なメディア12〜15 mLを加え。
    6. フラスコにバイアルから細胞を転送し、穏やかに混合。
    7. 5%のCO 2に付属の37℃のインキュベーターにフラスコを置きます。
  2. 治療のための細胞の調製
    1. インキュベーターから細胞を取り出し、細胞が少なくとも80%の共あることを確実にするために顕微鏡下で観察するnfluent。これは、実験のための十分な細胞が存在することを保証することである。無菌フードにフラスコを転送します。
    2. 真空に接続し、滅菌パスツールピペットを用いてフラスコからメディアを取り出します。優しくPBSで2回付着した細胞を洗う。
    3. フラスコに温かいトリプシン-EDTAの1ミリリットルを追加し、2分間インキュベーターにフラスコを入れた。これは、細胞がフラスコから切り離すようにすることです。
    4. フラスコに約3〜4ミリリットル適切な温かみのメディアを追加し、5ミリリットル血清学的ピペットを用いて分離した細胞を粉砕​​する。血清学的ピペットで細胞を取り、圧力を増加させるため、フラスコの底部に配置されたピペットの先端を用いて細胞を放出することにより粉砕物。これは、単一の細胞に離れて細胞を破壊することです。
    5. 製造業者のプロトコルに従って、細胞カウンターを用いて、例えば 、細胞を計数。
    6. (必要に応じて)100mmプレートにラベルを付け、プレートに約10ミリリットルメディアを追加します。プレート約2.0×10 6細胞/プレート。 GEにより細胞を配布ntleプレート渦巻く。
    7. 約80%コンフルエントになるまで、24〜48時間、細胞をインキュベートします。
    8. 80%の集密度で、PBSで2回細胞を洗浄し、適切な5%DCC-FBS培地を追加します。その後、24時間、細胞をインキュベート。
    9. 24時間後、PBSで2回細胞を洗浄し、適切な0.5%DCC-FBS培地を追加します。その後、さらに48時間細胞を培養する。
  3. セル処理
    1. 48時間後、PBSで2回細胞を洗浄。可能な限りのPBS限り除去してください。
    2. 15ミリリットルコニカルチューブ内で、適切な0.5%DCC-FBS培地の10ミリリットルを追加します。その後、10nMの最終濃度0.1 mMのリガンドストック(E2またはICI)の1を添加する。また、対照実験のために別のチューブに10ミリリットルのメディアに車両の1を添加する。
    3. 優しくチューブ内に内容物を混合し、プレート内の細胞に加える。これはプレート当たり1のリガンドである必要があります。
    4. 選択した時点(0〜72時間)、細胞をインキュベートします。
<Pクラス= "jove_title"> 3。 RNA抽出および品質管理

  1. RNA抽出
    1. 処置が所望の期間の終了後、プレート中の細胞は約1〜2ミリリットルグアニジンチオシアネート - フェノール溶液を追加し、次いで、PBSで細胞を2回洗浄する。注意:グアニジニウムチオシアネート - フェノール溶液は吸入により、皮膚や眼との接触により有毒である、または飲み込む。適切な保護服および、手袋、眼/顔面保護具を着用し、ドラフト内で使用しています。
    2. 細胞の体積はグアニジンチオシアネート - フェノール溶液の体積の10%以下ではない、そしてプレートを溶液で覆い、1分間静置することを可能にしていることをことを確認する。次に、ゴム製スクレーパーを用いて細胞をこすり取るとマイクロ遠心チューブに移す。細胞が週間-80℃でこの溶液中で保存することができる。
    3. 抽出し、スピンカラム精製およびDNase続いグアニジニウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム法を用いて、各処置からトータルRNAを精製動物細胞用I DNA分解法。
    4. 抽出後、細胞を60μlのRNaseフリー水中に溶出される。 -80℃での定量分析や店舗RNAについて分量1〜2μLのRNA
    5. RNA及びaspectrophotometerの1μLを用いて、RNA濃度を測定します。任意の測定が行われる前に撮影し、ブランクがあることを確認します。また、完全に測定が行われている分光光度計の到達時間を拭く。濃度は通常NG /μLに示されている。 RNA濃度を示す結果を保存します。
  2. RNAの品質管理
    1. マイクロチューブ内の各サンプルと場所の約100 ngのRNAを取る。
    2. バイオアナライザを用いたRNAの完全性を測定します。通常12サンプルは、バイオアナライザでの1時間に実行することができます。ランは通常約25分かかります。
    3. RNAは、実験のためによいことを保証するために、RNAラダーと結果を比較します。保存して、印刷結果。

4。トリートの確認MENT:タンパク質をコードする遺伝子の定量PCR

  1. cDNA合成
    1. 500 ngのか(各サンプルの)1μgの全RNAを取り、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに入れ。 RNaseフリー水を用いて10μlに各チューブの最大のボリュームを持参してください。
    2. 10分間70℃に50μMのランダムヘキサマープライマーと熱管の2を添加する。
    3. 5分間氷にチューブを転送します。
    4. 各サンプルについて、5X第一鎖緩衝液4μl、0.1MのDTT、10 mMのdNTPを、上付きIIIの0.5μL、および1.5μlのRNaseフリー水を1μLの1μLを加える。
    5. 10分間25℃のヒートブロックまたはウォーターバスに置きチューブ。
    6. 1時間46℃のヒートブロックへ移送管。次いで、15分間70℃のヒートブロックへ移送管は、反応を停止させた。
    7. -20℃での希釈および保存のためのRNaseフリー水を使用した(全RNA入力を使用して計算された)5 NG /μL株式に対するcDNAを希釈
  2. 定量PCR
    1. 関心とリファレンス遺伝子の遺伝子のためのプライマーを得る。プライマーは、プライマーの容易NCBI-BLASTプログラム12上のプライマー設計ツールを用いて設計することができる。これは通常、目的の各遺伝子についてのフォワードおよびリバースプライマーを生成します。プライマーは長さが18-22塩基対であるべきで、52〜58°Cの溶融温度を有する40〜60%のGC含量を有し、100〜180塩基対のアンプリコンの長さ。
    2. 各ウェル定量PCR反応のため、10 ngのcDNAを(ステップ4.1.7からのストック濃度から2μl)を添加し、順方向のそれぞれの1ピコモルと(ステップ4.2.1)から、目的とする遺伝子のリバースプライマー、および5μlのシアニンは、2×PCRマスターミックスを染める。各ウェルのための反応は、10μlの最終反応容量を持つ必要があります。
    3. (技術的反復のために)各遺伝子の各サンプルの三連ウェルが存在することを確認してください。 96ウェル反応プレートを使用することができる。
    4. 定量RT-PCRシステムソフトウェア上で、比較を選択して、反応容量を入力し、レポーターおよびターゲットを割り当て閾値サイクル(ΔΔCT)法、およびサンプルウェルを定義します。
    5. 1特定の断片の増幅を確認するために、すべてのシアニン色素の実行のために融解曲線解析を実行してください。実行のデフォルト設定を使用して、プレートを実行します。
    6. 実行後の結果、およびエクスポートデータ(MS Excelに特にCT値)を保存します。
  3. ΔΔCT式を用いたqPCRデータ分析
    相対的mRNA発現の変化は、次の手順を使用して、各サンプルのために、Excelに制御するために倍数変化として計算することができる。
    1. 上記のqPCRからエクスポートされたすべての結果は、Ct値が含まれている必要があります。以下の式を使用してΔCT値を計算します。
      • ΔCT= CT(標的遺伝子) - CT(参照遺伝子)
      これは、各サンプルのために行われるべきである。標的は、目的の遺伝子またはmiRNAである。
    2. 次に、各試料の総標準偏差(SD)を算出する。最初の計算参照遺伝子のためのSD、次いで標的遺伝子のためのSDを計算する(これはCT値にSTD DEV関数を使用してエクセルで行うことができる)。次に、この式を使用して、各サンプルの合計のSDを計算します。
      • 総SD =(SD2(ターゲット)+ SD2(参照))1/2
    3. することにより、遺伝子(ターゲット)内の各サンプルのΔΔCTを計算します。
      • ΔΔCT=ΔΔCT(処置/試験サンプル) - ΔΔCT(コントロール/較正試料)
      較正試料は、未処理のサンプルです。
    4. 最後に、式を使用して、各サンプルの倍数変化(FC)の値を計算します。
      • FC = 2-ΔΔCT
      各サンプルの倍数変化値は、参照遺伝子および対照試料に対して正規化された遺伝子/ miRNAの相対的発現を与える。
    5. スチューデントのt検定、両側分布および二標本不等分散を用いて統計分析のために使用することができるパラメータ:(P <0.001(***)P <0.01(**)、及びP <0.05(*))。これは、Excel上で達成することができる。治療はmiRNAプロファイリングを進める前に、既知のターゲットのレギュレーションをもたらしたことを確認してください。

5。 miRNAプロファイリング分析

  1. miRNAのマイクロアレイ
    1. 車両またはリガンドのいずれかで処理した細胞から単離されたRNA5μgのを取り、マイクロチューブに入れます。 20μlにチューブ内の音量を調整します。それぞれの比較は、重複や三重で行われるべきである。
    2. 上記のRNAサンプルを使用したmiRNAマイクロアレイを実行します。 miRNAのマイクロアレイ発現プロファイルはμParafloマイクロ流体バイオチップ技術によるヒトのmiRNAマイクロアレイデュアルカラーサンプルアレイ(サンガーmiRBaseリリース14.0)13を使用して決定されるべきである。
    3. 結果は、示差的に発現miRNAを示すべきである。はp <0.05.p値<0.10がさらに共ために考慮することができる場合に有意なmiRNAの式を考慮する定量PCRを使用してnfirmatory分析。定量PCRによるさらなる検証のために、このmiRNAのリストを保存します。
  2. miRNAプロファイリング:DLP-LDA
    1. 各サンプルは、重複または三重に分析する必要があります。車両またはリガンドのいずれかで処理した細胞からの全RNA 700 ngのを取り、マイクロチューブに入れます。 3μlにチューブ内の音量を調整します。
    2. 二重標識プローブのmiRNAアッセイ法および10xのRTプライマーを用いてcDNA合成を実行する。各反応の総容積は7.5μLである必要があります。
    3. PCRシステムサーモ反応管を配置し、二重標識プローブのmiRNAアッセイ法に示されているように推奨パラメータに設定されています。ファイル名を指定して実行を開始します。これは、cDNAを生成します。 cDNAは、少なくとも1週間-20℃で保存することができることに注意してください。
    4. RT反応の実行中に、DLP-LDAプレートを取り出し、室温で座ることができます。各アレイ板は、固有のmiRNAプライマーおよびコントロールプライマーが含まれている384井戸が含まれています。
    5. 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに6(5.2.3)からのcDNAのμLと場所を取る。二重標識プローブ2XユニバーサルPCRマスターミックス450μlのを追加し、444μlのRNaseフリー水を加える。
    6. 内容物を混合する6回程度のチューブを反転し、スピンダウン。
    7. DLP-LDAプレートは、8つの各々に室温、100μlの負荷に達したときに、プレートの「ポートを埋める」。その後、アレイ板を遠心する。
    8. 定量RT-PCRシステムを開いて、ブロックであることを確認することを384ウェルプレート用。 SDSソフトウェアを使用して実行]を設定します。相対定量(CT)を選択し、井戸の数と配列型を選択して、井戸を定義するには、サンプルの説明を入力します。
    9. デフォルトの熱サイクル条件を使用してアレイを実行します。実行が終了すると、MS Excelに結果およびエクスポートを保存し、ΔΔCT式(ステップ4.3)を使用して、さらなる分析のために保存します。

6。セパレートを使用したmiRNAの規制の確認定量PCR解析

  1. シアニン色素定量PCR解析
    1. 希望のmiRNA解析用の設計プライマー。フォワードプライマーに等しい成熟miRNAの配列は、14 mirbase.orgから得ることができる。 「T」に、すべての「U」に変換します。
    2. cDNAを調製:1.5ミリリットルの遠心管中の全RNAと場所の1μgのを取る。ポリAがmiRNA第一鎖cDNA合成と定量RT-PCRのプロトコルからテーリングやmiRNAの第一鎖cDNA合成のための指示に従ってください。 -20℃で得られたcDNA(1:10)とストアを希釈
    3. 1 96ウェル反応プレートを取得します。
    4. 各miRNA定量PCR反応のためだけでなく、キットからのステップ6.1.2からポリAのcDNA(ステップ6.1.2)からの16 NG(ステップ6.1.1からの)特定のフォワードプライマーのそれぞれの2ピコモルおよびユニバーサルプライマー(追加)と、2倍のqPCRマスターミックス5μL。最終反応容量/ウェルに10μlである。
    5. (技術的反復のために)各miRNAのために各サンプルの三連ウェルが存在することを確認してください。また、参照遺伝子(通常はU6 snRNA遺伝子)が含まれていることを確認してください。
    6. 定量RT-PCRシステムソフトウェア上で、レポーターおよびターゲットを割り当てて反応容量を入力し、比較閾値サイクル(ΔΔCT)メソッドを選択して、サンプルウェルを定義します。
    7. 実行のデフォルト設定を使用して、プレートを実行します。すべてのシアニン色素の実行のために融解曲線解析を実行してください。各融解曲線は、ある特定の断片の増幅を確認するために、1つの特定のピークを示すべきである。複数のピークまたは明確なピークが観察される場合、プライマーは特異的ではなく、データは使用できない。
    8. 実行後の結果、およびエクスポートデータ(MS Excelに特にCT値)を保存します。
  2. 二重標識プローブの定量PCR解析
    1. 0.2ミリリットルのマイクロチューブに5μlの容量と所定の位置に、それぞれの総RNA 10 ngの、それぞれを取る。
    2. 二重標識プローブマイクロを使用して逆転写(RT)を実施する上でのプロトコルからの指示に従ってくださいRNAの逆転写酵素キット15。各総反応容量は15μLである必要があります。二重標識プローブのRT反応のために、研究される各miRNAに特異的なプライマーがあることに注意してください。
    3. PCRシステムサーモ内の場所の反応管を、ステップ上記の6.2.2に示したプロトコルに従ってパラメータを設定します。ファイル名を指定して実行を開始します。これは、約70〜80分を取る必要があります。
    4. RT反応後に1:5の比率で試料cDNAを希釈し、-20℃の暗所ですべてのcDNAを格納
    5. 1 96ウェル反応プレートを取得します。
    6. 二重標識プローブ10μlの2XユニバーサルPCRマスターミックス(ステップ5.2.5と同じ試薬)、RNaseフリー水の7.67μL、20×リアルタイムアッセイプライマーの1μL:各miRNAのqPCR反応のためによく、次のように追加(各miRNAに特異的)、および上記のステップ6.2.4からのcDNAの1.33μL。これは20μlの最終反応容量でなければなりません。優しく内容物を混合し、スピンダウン。
    7. その目を確保ERE(技術的反復のために)各miRNAのために、各サンプルの三重井戸です。また、参照遺伝子(通常はU6 snRNA遺伝子)が含まれていることを確認してください。
    8. 定量RT-PCRシステムソフトウェア上で、比較閾値サイクル(ΔΔCT)メソッドを選択し、反応容量を入力し、目的の各miRNA(ターゲット)のためにレポーター(FAM)とクエンチャー(NFQ-MGB)を割り当て、およびサンプルウェルを定義します。
    9. 二重標識プローブマイクロRNAアッセイプロトコールから実行qPCRのためのパラメータを設定するための指示に従ってください。その後、実行を開始する。実行後の結果、およびエクスポートデータ(MS Excelに特にCT値)を保存します。

Representative Results

アプローチの概観を図1に提示され、様々な試料調製および各技法に必要な核酸修飾の比較を図2に視覚化される。

ホルモンを用いた治療前の細胞の状態や環境ホルモン16の実際の効果を決定するのに重要である。いくつかの培地および血清は、結果に影響を与える可能性の成長因子を含有するので、細胞は、全てのホルモンの影響が最小限に抑制されていることを確認するために、血清飢餓状態である。 E2で処理する場合に従って、観察された効果は、E2-関連することを、より確実性がある。重要な因子は、細胞 - 細胞接触および例えば細胞 - 細胞シグナル伝達および増殖などの行動に影響を与える細胞の密集度である。細胞を、80%コンフルエント( 図3A)であることが許され、よく成長を可能にし、その後の洗浄およびメディアchの中の細胞の損失を回避するために取り付けられたANGE。

RNA抽出および貯蔵中の条件は、RNAの品質およびその後の分析のために重要である。また、細胞数、抽出方法、およびmiRNAのGC含量がmRNAおよびmiRNAの17の両方の収量と品質に影響を与えることが知られている。したがって、RNaseフリーの状態の間にRNA抽出を実行し、実験を開始する前に、RNAの品質を確認する必要がある。抽出後、RNAの定量化は収率の観察を可能にするトータルRNA(mRNAおよびmiRNAの両方を含む)の濃度に関する情報を提供する。また、 図3Bに示すように、結果のグラフィック表現を提供し、これは(通常は一つのピーク、上部パネルで示される)試料の純度の観察を可能にする。 RNAの貧しい収量は260 nmの( 図3B、下のパネル)で特定の吸収を生じないでしょう。 RNAは、高品質でRNAであるかどうかを確認するには整合性を測定した。 9月10日の間のRNA完全性番号(RIN)は、RNAが分解されない、最適な品質であることが保証されます。また、RNAのグラフィカル表現が観察されるべきであり、 図4(中央パネル)に示すように、18Sおよび28S rRNAがピークを有するべきである。ラダー( 図4、上のパネル)と比較すると、ピークの大きさを識別します。分解されたRNAは、それほど明確なピークおよび18Sおよび28S rRNAの( 図4、下のパネル)の減少した相対的な量を持っているでしょう。小さなRNAの画分をさらにアジレントスモールRNAキットを使用して確保することができる。それは、miRNAのスクリーニングに進む前に、指定された実験条件下で、治療後のエストロゲン応答を検証することをお勧めします。定量PCRは、cDNAテンプレートを使用して、例えば、pS2の又はSPINK4 18として知られているER標的遺伝子に対して行うことができる。このような遺伝子は、通常のE2処理後の1月24日時間以内にアップレギュレートされる。 RNAの品質とエストロゲン応答回さらなる実験を行うことができ、評価されている。

マイクロアレイは依然として細胞におけるmiRNA発現のための大規模なスクリーニングのために広く使用される技術である。例えば、一度使用したmiRNAマイクロアレイは四つ子1の894の成熟miRNAと50のコントロール独自のプローブを含んでいた。ハイブリダイゼーションは、色素スワップ手順で重複して行った。 miRNAのマイクロアレイの結果は、通常、グラフィカルヒートマップにより表される。 図5Aは 、車両及びE2処理サンプル間でのmiRNAマイクロアレイの比較からのデータを表すヒートマップを示している。赤は緑がmiRNA(下式)のダウンレギュレーションを示しながらのmiRNAは、E2処理試料(より高い発現)に上方制御されることを示しています。 miRNAの選択は、通常、発現におけるそれらの重要性に依存するが、通常0.05以下のp値未満を有意と考えられる。示差的に発現することが示されているmiRNAは、さらにワット検証する必要がありますi番目の定量PCRは、偽陽性と区別するため。

DLP-LDAアレイは、一方で、384ウェル形式で調節されたmiRNAをスクリーニングするための定量PCRベースの方法を使用する。通常、2つの384ウェルプレート(カード)プールA、提供されており、B.プールAは、各miRNAの相対レベルは、1つのmiRNAがにつき分析する定量PCRにより決定されるプールBよりもmiRNAを通常よりよく特徴付け含有し、より高度に発現さウェル( 図5B)。上位のCt値が低いmiRNA発現を示している。多くのmiRNAマイクロアレイのように、DLP-LDAから得られた結果は、さらに精度を確保するために検証される必要がある。

検証をqPCRを用いて行うことができる。ここでは、2つのqPCR検出方法は、方法の偏りを防ぐために、徹底した確認およびmiRNA規制の調査を可能にするために記載されている。シアニン染料ベースの検出化学は、DLP-LDAプロファイリングの基になっているのDLPとは異なる動作し、確認のために適していますATION目的。それは、すべての増幅された二本鎖DNAを検出すると、それはあまり特異的であり得るが、サンプルの均質性は、融解曲線分析を行うことにより評価することができる。 図6A(左パネル)miRNAの融解曲線分析を示す図であり、a明確に定義された均一なピークが見られる。プライマーは、プライマー-ダイマーの非特異的又は有意な量である( 図6A、右パネル)が形成されている場合は、複数のピークが観察されるであろう。一方、DLPのmiRNAアッセイは、miRNAのが検出されたターゲットの唯一の増幅など、より具体的である。 図6Bに例示されるように、各ターゲットmiRNAの増幅プロットを観察することができる。融解曲線分析を使用して、複数の増幅産物の発生を制御するためのオプションが、この化学的性質を有するが、利用できず、シアニン色素定量PCRは、安価である。シアニン色素やDLP定量PCRアッセイは、時々わずかに異なる結果を生成します。定量PCRアッセイ、REFEとの比較の両方についてrence遺伝子は、2つのサンプル間の遺伝子の相対的発現を決定するために必要とされる。また、ハウスキーピング遺伝子とも呼ばれる参照遺伝子は、その発現が変更されず、目的の遺伝子と同様のレベルで発現される遺伝子であるべきである。これらの乳癌細胞株における適切な参照遺伝子の例は、ARHGDIA、Rhoタンパク質のGDP / GTP交換反応が機能するのRho GDP-解離阻害剤である。 図6C(上)で観察されたように、ARHGDIAのmRNAレベルは、車両およびリガンド処理試料との間で変化しない。その高発現するcDNAストックの別々の1:500希釈を必要とするので、あまり適切ではあるが、18S rRNAのも、使用することができます。 miRNAの分析のために、明確に定義された参照遺伝子についての議論が依然として存在する。今のところ、U6 snRNAを広くmiRNAの分析のために受け入れられている参照遺伝子である。 U6 snRNAを核プレ-mRNAのsplで機能〜110ヌクレオチド長、小さい非コードRNAである核アイシング19。 図6C(下)で観察されたように、U6発現レベルは、このように、miRNAの可変レベルの計算を可能にする、示されたすべてのサンプルにわたってほぼ同じである。 U6基準に正規化されている車両およびE2処理細胞との比較のためのmiRNAのqPCR結果のグラフを図6Dに観察することができる。これは、24時間の処理後にE2非規制として検出されたmiRNAを示すが、そのゲノムの場所の近くにERクロマチン結合部位を保有し、時系列分析は、治療後に有意レギュレーション72時間を同定する。

図1
図1。乳癌細胞におけるmiRNAのホルモン調節の検出のために用いられる方法の概要。

図2
図2。各miRNAの検出技術のための様々な試料調製および核酸操作の比較。 (A)μParaflo技術の方法を用いてmiRNAのマイクロアレイは、濃縮、ポリ-テーリングおよび連結標識を含む。(B)DLP技術サンプル調製および検出方法は、変性工程の後に延びるループcDNA合成プライマーを含み、保有するより長い断片を提供するリバースプライマーとプローブ配列(C)シアニン染料技術サンプル調製及び検出方法は、ポリA-テーリング、ユニバーサル5 '配列を含むオリゴ-dTプライマーによるcDNA合成を含む。

図3
図3。細胞培養およびRNA抽出。 (A)の配位子で処理する前に必要とされる80%の密集度を説明するための培養細胞(B)抽出後のRNAの濃度および純度のグラフ表示。各ピークは、試料を表し、成功した抽出プロセスは、純粋なRNA(上部パネル)を得る。不十分抽出したRNAを、260nm(下のパネル)での明確な吸収ピークを示さない。

図4
図4。&#160; RNAの品質管理ラダー(上)、良好な品質のRNA(中央)とに分解したRNAサンプル(下)のためのグラフィカル表現を示すRNA完全性の分析からの結果。

図5
図5。 miRNAプロファイリングの結果の図。 (A)示差的に発現されるmiRNAに対するmiRNAマイクロアレイ結果のヒートマップ表現。赤で示されているように緑色で示されているようにするmiR-D、E、F、GはE2処理サンプルで下方制御されている間は、miR-A、B、Cは、E2処理された試料においてアップレギュレートされている。各々に対する(B)の増幅プロットをDLP-LDAの結果からのmiRNA。 Rnの値の増加によって示されるように検出されたmiRNAは、増幅される。

図6 図6。 miRNAの規制のqPCR分析。(A)融解曲線分析のmiRNAのために、試験した全てのサンプルの均質性(左)と、複数の断片(右)の増幅を示す、シアニン色素検出を用いて分析した。(B)は、各サンプルについての増幅プロットをmiRNAは。これは、シアニン色素、またはDLPの検出方法の中からいずれかになります。サンプル間の有意な発現差異を示さないmRNAを解析ARHGDIA(上)用およびmiRNA解析のsnRNA U6の(下)のための適切な参照遺伝子の(C)のバーグラフ表示、(D)時間経過にわたってのmiR-135aの相対的な発現レベルの比較を説明するためのmiRNA qPCRの結果は。 図6Dは、エルゼビアの許可を得てKatchy 1から復刻されています。値は、通常、別々のexperの平均であるSD±iments(生物学的重複)。 *はp <0.05:Studentのt検定を、有意性を実証するために使用される。

Discussion

乳癌細胞におけるmiRNAのホルモン調節する機構を決定することは、この疾患を理解するためのプラットフォームを提供することができ、乳癌の潜在的な治療を提供することができる。ホルモン作用のための最適条件を提供するために、これらの細胞を培養することは非常に重要である。ここで、目的のホルモン(エストロゲン)が治療前に除外し、E2の最適用量について説明したが、治療中に適当な時間のために使用されたことをしたことを確実にするプロトコル。他のホルモンおよび成長因子の効果は徐々に血清レベルを低下させ、そのホルモン、サイトカインおよび増殖因子のほとんどが取り除かれているFBSでDCC-FBSを用いて最小限に保った。フェノールレッドを含まない培地は、さらに、フェノールレッドがエストロゲン活性を有し、細胞株20,21内の特定の機能に影響することが報告されていることを考えると、他の非ホルモンの影響を最小にするために使用した。ホルモンに対する細胞の曝露時間は非常に重要である。遺伝子のエストロゲンに関連する調節のために、以前の24 hrexposureは、乳癌細胞1,18における直接の標的遺伝子の有意な応答を生じることが示されている。 miRNAは、RNAポリメラーゼIIによって転写されるので、mRNAのように、これはまた、miRNAの直接の調節を検出するための適切な時点であると考えられる。なお、これらのmiRNAは、乳癌細胞におけるこれらの公知のER標的の発現にどのように影響する場合には、まだ決定されていない。

miRNA発現プロファイリングが原因のmiRNA、成熟miRNA配列は、プリmiRNAおよびプレmiRNAでも見つけることができるという事実の相対的なサイズが小さい挑戦すること、およびため、そのGC含量22内の不均一性のことができます。いくつかのプロファイリング技術および化学物質はこの困難を克服するために使用されてきた。これらの中で、マイクロアレイおよびqPCR分析の異なるアプローチ( 図2)である。マイクロアレイは広く全ゲノム肛門のために受け入れているがysis、それは偽陰性を提供することができ、化学から印刷技術23に至るまで、可能なプラットフォーム間の相違が存在する。 mRNA転写物の何万と比較して、何千もカウントされる比較的少数のmiRNA遺伝子を解析する際にも、正規化処理は課題を提示する。定量PCRは、一方では、より感受性であり、少数の遺伝子があるとみなされるべきであるときに良好に適用される。プレートごとに1つの技術的反復で、大きな384ウェルプレートにおいて実施ところが、複数のプレートは、分析が高価になり、各試料について分析する必要がある。また、我々の手で、より多くの偽陰性の結果は、マイクロアレイと比較して、DLP-LDA分析を用いて得た。成熟miRNA配列がプリmiRNAおよびプレmiRNA配列中に存在することを考えると、それはPCR法24を用いてこれらの転写物を区別するために重要である。 DLPプローブは、事前のmiRNA、およびSPのためにも利用できますecificプライマーはまた、シアニン染料定量PCR技術を用いて、異なる変異体の成熟または前駆体を排除するように設計することができる。

定量PCRは、プロファイリング結果から発現差の検証のための黄金の標準です。定量PCRの有効性は、しかしながら、RNA抽出、RNAの完全性(品質)、cDNA合成、プライマー設計、検出方法(化学)、およびデータ正規化のための1,22,25参照遺伝子を含むいくつかのパラメータに依存する。短いmiRNA配列の長さがはるかに別のプライマー設計のための余地を与えないので、miRNAの分析のためのプライマー設計のための選択肢は非常に限られており、唯一つのプライマーは、この短い配列内に保持することができる。従って、 図2に示されるような別の操作が必要とされている。技術的反復は、増幅方法および使用されるプロセスの堅牢性を検証するために重要である。生物学的複製は、一般的な生物学的variatioの表現のために必要とされるnは、リガンド処理し、細胞内で見られた効果が再現可能であることを示すために変数の応答を含む。我々の経験に基づいて、細胞培養の間のmiRNA発現の変動が発生する可能性があります。通常、これらの違いは1.3倍未満であり、その平均値とそれに対応するSDは、自然と技術の変化を識別します。この変化は、細胞密度および細胞機能が通路に通路から変更される可能性があるという事実を含む様々な要因から生じうる。 p値が0.05未満である場合、リガンド処理から生じる統計的に有意な表現を識別するために、広く受け入れられている意義がある。ここで、両側分布および二標本不等分散パラメータを用いて生物学的および技術的反復にスチューデントt検定が使用されている。他のT-テストパラメータが存在し、選択は実験装置26に依存します。

成熟miRのホルモン規制を評価する上で詳細なプロトコル乳癌細胞におけるNAが提供されている。プロファイリングにおけるこれらのmiRNAの表現を検証し、重要な技術や化学が明確に説明されています。乳癌細胞におけるmiRNAの研究のために選択された技術は、最終的に正確に調査されているかに依存する。

Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

我々は彼らのmiRNAの専門知識を共有するため、博士カリンEdvardsson、カロリンスカ研究所、スウェーデン、博士Eylem Aydogduに、LC科学のmiRNAマイクロアレイプラットフォームへのアドバイスを提供するため、ヒューストン大学博士Xiaolianガオ、ヒューストン大学に感謝しています。この刊行物で報告された研究が受賞番号R01CA172437の下で国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。この作品はまた、合意の下で、テキサスエマージングテクノロジーファンドからの補助金によって支えられている。 300-9-1958。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

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