DNA交联聚丙烯酰胺水凝胶的制备

Biology

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Summary

我们的实验室已开发的DNA交联聚丙烯酰胺水凝胶,动态水凝胶体系,以更好地了解调节组织硬度对细胞功能的影响。这里,我们提供了示意图,说明和协议来制备这些凝胶。

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Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).

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Abstract

力学生物学是一个新兴科学领域,解决物理线索中指导细胞的形态和功能中的关键作用。例如,组织的弹性对细胞功能的影响是力学生物学研究的一个主要领域,因为组织硬度调制与疾病,发展和损伤。静态仿组织材料,或材料,可以不改变刚度一旦细胞接种,都主要是用于研究组织刚度对细胞功能的影响。虽然从静态研究收集到的信息是有价值的,这些研究并不表示体内细胞微环境的动态性质。为了更好地解决对细胞功能的动态劲度的影响,我们开发了一种DNA的交联聚丙烯酰胺水凝胶系统(DNA凝胶)。不像其他动态基底,DNA的凝胶具有降低或制造之后增加刚度而不刺激的能力。 DNA凝胶组成的DNA crossl的被聚合成聚丙烯酰胺骨干油墨。加入并经由输送的单链DNA的去除交联允许的时间,空间,和凝胶弹性的可逆控制。我们已经表明在以前的报告中说动态DNA琼脂糖凝胶弹性的影响调制成纤维细胞和神经细胞的行为。在这份报告和视频,我们提供的示意图描述的DNA制备凝胶的DNA琼脂糖凝胶的交联机理,并一步一步的指示。

Introduction

静态和动态的基材是两类生物材料的开发,以研究组织的弹性或刚性对细胞功能的影响的。静态基板无法它们被制造之后和/或一旦细胞被镀改变其物理性质。聚丙烯酰胺(PA)的凝胶进行合成的力学生物学研究5,17的被所述第一二维的,静态的基板。 PA凝胶是易于制备,价廉,通用性,并且可以与宽范围的弹性模量来制造。虽然这些技术的优点使PA胶凝共同施加的基板,静基板并不表明细胞外基质(ECM)和周围的细胞环境在体内的动态特性。例如,细胞外基质经历刚度的改变如损伤,发展,或疾病的结果。因此,动态的衬底作为力学生物学研究仿组织基底模型青睐

许多合成的,天然的,二维的,三 ​​维的,静态的和动态的生物材料已经被开发,以模仿组织硬度1,3,6,16,23,26。一些动态基板需要加热,紫外线,电流,离子和pH值的变化,以改变其机械性能2,4,7,8,12,15,16,但这些刺激可以限制水凝胶的生物应用。 DNA的交联聚丙烯酰胺水凝胶(DNA凝胶)是动态的二维弹性基材。 DNA的交联允许进行DNA凝胶刚度通过加入单链DNA(ssDNA)的时间,空间,和可逆调制到媒体或缓冲9-11,13,14,18,21。不像其中施加于弹性调制刺激上述的动态凝胶,将DNA凝胶依赖于应用的ssDNA为弹性的改变的扩散。因此,上部凝胶表面,其中细胞生长,是调制的,因为速度ø第一区域˚F弹性调制取决于凝胶的厚度。

DNA凝胶相似,其PA凝胶同行,他们有一个聚丙烯酰胺的骨干,但是双丙烯酰胺交联被替换为交联的DNA( 图1)组成。两个的ssDNAs(SA1和SA2)杂交与交联剂链(L2),以弥补凝胶的DNA交联。 SA1和SA2有两个包含Acrydite修饰的5'末端进行有效的结合到PA的网络不同序列。用于制备凝胶,SA1和SA2的单独聚合成PA骨架,随后聚合的SA1和SA2一起混合。 L2,交联剂,将被添加到SA1和SA2混合物。在L2的碱基序列互补的两个SA1和SA2的序列和二级杂交与SA1加上SA2以形成DNA交联。最初,DNA琼脂糖凝胶的弹性是由两个二级浓度和交联( 表1确定2)。含有L2,SA1,SA2和相等化学计量的量的DNA的凝胶是硬的凝胶,因为SA1和SA2是100%的交联用L2(被指定为100%的凝胶)。对二级导致DNA交联的比例较低,因此较低的浓度,柔和的DNA凝胶。凝胶低至50%的交联的(指定为50%凝胶)已经构建9-11。

图1
图1中的DNA凝胶的交联和uncrosslinking概略9-11,13,14,18,21步骤1:SA1(红色)和SA2(蓝色)分别聚合成聚丙烯酰胺主链(黑色)。聚合后,SA1和SA2的聚合溶液混合在一起。步骤2:L 2(绿色),并将与SA1加上SA2杂交以形成凝胶的交联。第3步:R2的杂交与T他立足点L2的。步骤4:R2的立足点杂交推动L2的从SA1和SA2的解压。

与PA的凝胶,DNA凝胶可以变硬和合成后软化。出于这个原因,生长在DNA凝胶的细胞可以进行动态刚度的改变。变硬细胞粘附凝胶,L2可以加入到低百分比的凝胶培养基中,以增加交联点的百分比。软化细胞粘附凝胶,L2可以除去以减少交联点10,13,21的百分比。 L2具有在3'端附加的立足点序列以允许L2从SA1和SA2中( 表1)uncrosslink。去除L2的被逆转链称为R2的杂交来实现的。 R2是互补的L2的全长,并与L2立足点第一杂交。立足点杂交推动L2的从SA1和SA2的解压,这消除了交联,降低了凝胶的硬度。

在这份报告中,并视频,一步接一步提供了用于加固和软化的DNA凝胶的制备中说明。而100%和80%的凝胶制剂进行了描述,此协议可定制,以创建其他的最初和最后的交联百分比的DNA的凝胶。在一般情况下,100%和80%凝胶剂的制备,固定于盖玻片上,官能化的,并且接种有细胞。 L2加至80%凝胶介质和R2加至100%的凝胶剂,电镀后48小时的媒体。加L2的媒体变硬80%凝胶,以100%的交联,而加入R2到媒体软化100%的凝胶,以80%的交联。硬化的凝胶被指定为80→100%的凝胶和软凝胶中指定的文本100→80%的凝胶。为控制或静态凝胶,单链DNA组成的Ts或由于被传递到另一组的100%和80%的凝胶。至少两天下列弹性调制后,细胞可以进行处理和分析。

DNA交联 #基地 序列( 立足点 修改 熔化温度(Tm值,℃) 评论
5'→3'
设计1 SA1 10 GCA CCT TTGç 5'Acrydite 34.9
SA2 10 GTC AGA ATGá 5'Acrydite 23.6
L2 30 TCA TTC TGAç 气相色谱AAA级转肽酶的GC 摹CTA CAC得志 56 10 bp的立足点序列包括在内。
R2 30 CAA GTG豪CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2是互补的二级
设计2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5'Acrydite 46.​​9
SA2 14 GTT TCC民航局TCA GA 5'Acrydite 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA交流 教学专业议会注册税务师TGC CAC摹 GT交铁通卡特彼勒C 65.9 一个12碱基序列的立足点是包括在内。
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAGá 65.9 R2是互补的二级
DESIGñ3 SA1 20 ACG GAG GTG达GCA ATG TC 5'Acrydite 55
SA2 20 猫GCT TAG GGA CGA CTG GA 5'Acrydite 56.6
L2 40 台泥AGT CGT CCC认证TAA贲门癌的TG 摹ACA TTG猫ACA建CCG牛逼 68.8 立足点不包括在内。
控制 控制 20-40 AAA AAA( ),或
TTT TTT( 等等

对单链DNA 9-11,13,14,18,21。细胞和机械的研究中采用了多种ð 表1中相应序列ifferent交联的设计,产生了一系列的静态和动态力学性能的DNA凝胶。调制的交联点的设计参数是碱基序列和序列长度或交联的长度。粗体和斜体字体说明SA1和L2之间和SA2和L2,分别之间的碱基配对。

设计
1 2 3
丙烯酰胺浓度(%) 10 10 10 4
SA1加上SA2杂交到二级(%交联) 50 80 100 50 80 100 100 100
<STRONG>弹性(千帕,平均值±标准差) 6.6±0.6 17.1±0.8 29.8±2.5 5.85±0.62 12.67±1.33 22.88±2.77 25.2±0.5 10.4±0.6

表2 DNA的凝胶9-11,13,14,18,21。丙烯酰胺浓度,交联百分比,和交联长度的杨氏模量(E)的可调制中的DNA凝胶。设计1,2,和3具有20,28和40碱基的交联​​长度,分别为。 100%的凝胶对于所有的设计也有类似的弹性模量表示的交联长度,不影响凝胶的弹性。但是,不同的丙烯酰胺浓度改变DNA的凝胶弹性。

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Protocol

注:从凝胶制备细胞处理整个协议至少需要六天。估计时间用于凝胶制备是8小时加一个O / N培养。预计时间为凝胶固定化和DNA退火8小时加一个O / N漂洗步骤。预计时间为凝胶的官能为2小时。时间对细胞电镀和生长是依赖于培养的类型和应用,但至少四天是必需的。

1,制备的DNA凝胶的

注:制备DNA凝胶在三个不同的步骤。首先,单独聚合SA1和SA2单链DNA成PA的中坚力量。这些溶液分别称为SA1聚合溶液和SA2的聚合溶液,(§1.1)。第二,溶解的交联剂的,可逆的链,并且控制ssDNAs的。溶解冻干二级单链DNA(交联剂)。这就是所谓的100%的二级溶液并用于制造100%凝胶(§1.2)。稀释的100%的二级溶液的等分试样到80%。这就是所谓的80%L 2溶液并用于制造80%的凝胶。溶解冻干R2(可逆链)和控制的单链DNA在§4使用。第三,混合SA1聚合溶液,SA2的聚合溶液,以及100%或80%的L2溶液中的10:1的比例:10:6(SA1:SA2:L2),形成100%和80%凝胶剂,分别。 (§1.3)。

1,准备SA1和SA2聚合解决方案

  1. 选择并订购相应的SA1,从表1表2 SA2,L2和R2的碱基序列。碱基序列与序列长度进行了优化,在以前的报告中9-11,13,14。
  2. 计算所有溶液制剂( 表3-4)。注:精心计算的文件,为了排除故障。 Excel模板的施工建议,可重复使用的用于DNA的凝胶制剂。请参阅表3表4的制表为设计2的一个例子(表1表2)。表4中指定的卷将被用于整个协议,但体积会随着冻干单链DNA的每一个等分。
解决方案 溶液浓度股票 的储备溶液在SA1或SA2聚合溶液百分比(体积/体积) 解决方案的SA1或SA2聚合解决方案的最终浓度
丙烯酰胺(无双丙烯酰胺) 40% 25 10%
SA1或SA2解决方案 100% 60 60%
TBE缓冲液 10倍 10 1个
TEMED 20% 2.5 0.50%
黄芪多糖 2% 2.5 0.05%

表3。制造SA1或SA2聚合解决方案的百分比。第一列显示了制定的DNA凝胶的解决方案。第二列显示了库存浓度的这些解决方案。第三列表示的储备溶液在SA1或SA2中聚合溶液的比例(体积/体积)。最后一栏反映最终浓度SA1和SA2的解决方案。

单链解决方案(§1.1) <TR>
解决方案组件
解决方案 股权集中度 最终溶解浓度 计算 添加量 评论
SA1解决方案 320.7冻干SA1单链DNA的纳摩尔 3.00毫米 320.7纳摩尔/ 3.00纳摩尔微升-1 = 107微升 107微升TE缓冲液中,以冷冻干燥的ssDNA SA1溶液是SA1聚合溶液的60%。
107微升/ 0.600 = 178微升
178微升是SA1聚合的溶液( 表3)的总体积。
SA2解决方案 324.4冻干SA2单链DNA的纳摩尔 3.00毫米 324.4纳摩尔/ 3.00纳摩尔微升-1 = 108微升 108微升TE缓冲液中,以冷冻干燥的ssDNA SA2溶液是SA2聚合溶液的60%。
108微升/ 0.600 = 180微升
180微升是SA2聚合的溶液( 表3)的总体积。
100%的L2解决方案 657.4冻干二级单链DNA的纳摩尔 3.00毫米 657.4纳摩尔/ 3.00纳摩尔微升-1 = 219微升 219微升TE缓冲液中,以冷冻干燥的ssDNA 稀释100%L 2的等分试样,以80%的L2溶液
80%的L2解决方案 加入80μl的100%L2的ssDNA 80% - 20微升TE缓冲液中,以80微升的100%的二级溶液
控制解决方案 332.6冻干纳摩尔多聚T或单链DNA 3.00毫米 332.6纳摩尔/ 3.00纳摩尔微升<SUP> -1 = 111微升 111微升TE缓冲液中,以冷冻干燥的ssDNA
R2的解决方案 193.8冻干R2的单链DNA的纳摩尔 3.00毫米 193.8纳摩尔/ 3.00纳摩尔微升-1 = 64.6微升 64.6微升TE缓冲液中,以冷冻干燥的ssDNA
聚合解决方案(§1.2)
SA1聚合解决方案 40%的丙烯酰胺 10% 178μL×0.25 = 44.5微升 45微升计算基础的178微升总体积的丙烯酰胺,TBE,APS和TEMED量(见上文和表3)。
10X TBE 1个 178μL点¯x0.10 = 17.8微升 18微升
100%SA1解决方案 60% - 107微升 SA1溶液是SA1聚合溶液的60%(见上文和表3)。
2%的APS 0.05% 178μL点¯x0.025 = 4.45微升 4.5微升添加和添加TEMED前将APS。
20%TEMED 0.50% 178μL点¯x0.025 = 4.45微升 4.5微升
SA2聚合解决方案 40%的丙烯酰胺 10% 180μL×0.25 = 45微升 45微升计算基础为180微升总体积的丙烯酰胺,TBE,APS和TEMED量(见上文和表3)。
10X TBE 1个 180μL点¯x0.10 = 18微升 18微升
100%SA2解决方案 60% - 108微升 SA2溶液是SA2聚合溶液的60%(见上文和表3)。
2%的APS 0.05% 180μL点¯x0.025 = 4.5微升 4.5微升添加和添加之前混合的APS TEMED
20%TEMED 0.50% 180μL点¯x0.025 = 4.5微升 4.5微升
凝胶溶液(§1.3)
100%的凝胶溶液 100%SA1聚合解决方案 10份 - 10微升组成100%的凝胶具有下列SA1:SA2:L 2的比例为10:10:6。
100%SA2聚合溶胶ution 10份 - 10微升
100%的L2解决方案 6件 - 6微升
80%的凝胶溶液 100%SA1聚合解决方案 10份 - 10微升构成80%的凝胶具有下列SA1:SA2:L 2的比例为10:10:6。
100%SA2聚合解决方案 10份 - 10微升
80%的L2解决方案 6件 - 6微升
动态凝胶(§3-4)
80→100%硅胶 80%的凝胶 100%的锗升计算1: 1微升的100%L 2溶液进培养基计算是基于具有在盖玻片上20微升凝胶。首先,转换为100%的L2解决方案的部分在20微升凝胶成微升。其次,计算出所需要的交联的额外20%100%二级液的量(微升)。收藏此金额的100%,二级的解决方案凝胶。
(20微升/ 26份)×6份= 4.6微升
计算方法2:
5微升×0.2 = 1微升
100→80%的凝胶 100%硅胶 80%的凝胶计算1: 1微升的100%R 2溶液进培养基计算是基于具有在盖玻片上20微升凝胶。首先,转换吨他部分中的20微升的凝胶成微升100%L2溶液。其次,计算需要拆下来组成一个20%的凝胶100%,二级液的量(微升)。添加这一数额R2的解决方案,以凝胶。
(20微升/ 26份)×6份= 4.6微升
计算方法2:
5微升×0.2 = 1微升
100%的凝胶(对照) 100%硅胶 100%硅胶 - 1微升的控制液为培养基的对照溶液量等于加入R2溶液的量。
80%凝胶(对照) 80%的凝胶 80%的凝胶 - 1微升的控制液为培养基的控制液量相当于100%的L2溶液的添加量。

设置表4中实施例的计算进行DNA凝胶制剂。模拟数字来说明计算为80%,100%的制备中,100→80%,80→100%的凝胶。 DNA的凝胶是在表1设计2。

  1. 离心机冻干SA1的ssDNA在2000×g离心15秒以确保所有的单链DNA是在样品瓶的底部。注意:适当浓度的SA1的解决方案是DNA凝胶法合成的关键。
  2. 通过加入107微升1个的Tris-EDTA中,pH 8.0的缓冲液(TE缓冲液)到小瓶( 表3-4)制备毫SA1的3溶液。
  3. 在70℃下进行5分钟或直到ssDNA的粒料热SA1在TE缓冲液中完全溶解。注意:加热温度至少应为5℃以上的熔融温度(Tm值),以确保DNA是单链的状态。
  4. 加上40%的丙烯酰胺和1准备SA1聚合解决方案为0x的Tris-硼酸-EDTA(TBE)缓冲液中的指定百分比( 表3)。在本实施例中,添加45和18微升,分别以107微升SA1溶液( 表4)。
  5. 脱气,用氮气进行3分钟,以促进混合。插入连接在氮气源到溶液P200的前端,慢慢地使氮气通过该溶液。测试的氮气的流速在之前脱气SA1溶液,以防止飞溅的水。
  6. 离心15秒,在2000 XG收集溶液。
  7. 加入4.5微升2%的过硫酸铵(APS, 表3-4)以引发凝胶聚合。
  8. 颠倒管数次​​混匀。
  9. 离心15秒,在2000 XG搜集与均相聚合解决方案。
  10. 加入4.5微升20%四甲基乙二胺(TEMED, 表3-4)的催化聚合。
  11. 反转管几次以混合。
  12. 离心15秒,在2000 XG搜集与均相聚合解决方案。
  13. 脱气,用氮气3-5分钟以完成聚合反应,并尽量减少未反应的单体。
  14. 孵育10分钟,溶液在室温下完成聚合。注意:此溶液称为SA1聚合的溶液。
  15. 重复与冻干SA2的ssDNA步骤1.1.3-1.1.16,但添加45,18,4.5,和4.5微升的丙烯酰胺,TBE,APS和TEMED,分别以108微升SA2溶液( 表3-4)。注:SA1和SA2的聚合溶液可以储存在4℃下进行长达一个月。

2,准备工作的L2,R2和控制解决方案

  1. 重复步骤1.1.3-1.1.5用冻干R2的单链DNA,但添加64.4微升TE缓冲液中( 表4)。
  2. 重复步骤1.1.3-1.1.5用冻干控制的单链DNA而添加111微升TE缓冲液中( 表4
  3. 重复步骤1.1.3-1.1.5用冻干L2的ssDNA而添加219微升TE缓冲液中( 表4)。注意:这是100%的L2解决方案。加入100%的L2解决方案SA1和SA2聚合解决方案(见§1.3)将形成100%的DNA交联凝胶(100%硅胶),因为SA1,SA2,和L2将化学计算当量。
  4. 通过加入20μl的1X TE缓冲液中,以80微升的100%的二级溶液( 表4)稀释的100%的二级溶液的等分试样到80%。注:此方案是80%,二级的解决方案。加入80%的L2溶液到SA1和SA2的聚合溶液(见§1.3)将形成一个80%的交联DNA的凝胶(80%凝胶),因为只有80%的SA1和SA2的将被交联到L2。溶液可以储存在4℃下进行长达一个月。

3,制备凝胶解决方案

  1. 热SA1,并在70℃,直到溶液的粘度SA2聚合的解决方案减少(约1分钟)。提高温度至80℃c如果解决方案仍是太粘到吸管。
  2. 加10微升或10份SA1聚合溶液以10微升或10份SA2聚合溶液( 表4)。注:SA1和SA2的聚合溶液是非常粘稠,不易吸移管。由于浓度是至关重要的凝胶形成,使用容积式移液管从该点向前或看到其他处理技术的讨论。此外,吸液管中的多个小等份(> 20微升),而不是一个单一的,大体积。
  3. 混合SA1和SA2的聚合溶液通过(在70℃,15秒)交替加热和搅拌(15秒用移液管尖端),总共1分钟在一起。
  4. 加入6微升或6份的100%L 2溶液,以形成100%的凝胶( 表4)。
  5. 交替加热和如在步骤1.3.3中所述搅拌混合。
  6. 热凝胶的最佳退火温度1小时(35℃)。计算通过减去5℃的单链DNA序列具有最低的熔化温度( 见表1)nnealing温度。
  7. 100%的凝胶吸取到60毫米的培养皿。
  8. 允许DNA的交联键以继续孵育凝胶为4小时,在室温至rehybridize。
  9. 封面凝胶含有钙和镁的PBS孵育在o / n RT。注:啫喱会膨胀约3倍的初始音量。此外,凝胶将与缓冲液和过量的丙烯酰胺平衡会扩散到凝胶的出。钙和镁的PBS中稳定DNA杂交,防止凝胶爆裂(见讨论的toubleshooting凝胶爆裂)。
  10. 取下培养皿中剩余的缓冲区。
  11. 制造80%的凝胶,重复步骤1.3.1-1.3.10,但更换100%的L2解决方案步骤1.3.4用80%的L2解决方案。存储100%和80%凝胶剂,在4℃下进行长达一个月。注:在80%至100%的凝胶的硬度差别物理上可区分。
  12. </ OL>

    2,胶固定在玻璃上

    注:定身的100%或80%的凝胶分装到玻璃盖玻片上( 图2)。

    1. 加热100%的凝胶在70℃下进行约30秒或直至凝胶是粘性小的移液管。
    2. 地方玻璃盖玻片到70℃的热块,并允许以加热1-2分钟。
    3. 加一滴光学胶的每一个玻璃盖片。
    4. 加入20μl100%的凝胶中,以各玻璃盖玻片( 表4)。注:10-30微升可以在每个盖玻片进行分配。
    5. 允许凝胶熔化和分散在玻璃盖玻片。注:如果凝胶拓扑甚至不融化后出现,压平胶用硅化玻璃盖玻片。然而,附加的肿胀会发生在后续步骤中,并有助于凝胶不均匀性。
    6. 取下散热块和地点含玻璃胶在24孔组织培养皿。
    7. 重复步骤2.1-2.6 8 0%的凝胶。
    8. 热凝胶1小时,在最佳退火温度(35℃)。注:这是正常的凝胶变得干燥,这将在凝胶中培养的PBS得到解决。
    9. 露出含80%和100%的凝胶,以紫外(UV,365 nm)的光进行15分钟板。注:紫外线照射同时固化胶水和消毒凝胶。如果紫外线交联室不可用,凝胶可以放置在该装备在生物安全柜中的紫外线。紫外线照射后,在生物安全柜中执行此协议的后续步骤,以保持凝胶不育。此外,使用无菌溶液,从这里开始。
    10. 允许的DNA交联到rehybridize在室温搅拌4小时。
    11. 添加PBS孵育在o / n 4℃。注:PBS漂洗培养,达到平衡,再膨胀胶,因为反复加热可脱水凝胶。

    51323 / 51323fig2highres.jpg“/>
    图2示意凝胶固定化和官能化。后的DNA凝胶(灰色)的制备,凝胶附着于玻璃盖玻片(白色)通过光学胶(绿色)。凝胶被同时固化并通过UV光杀菌。溶胀后,凝胶剂是大约1毫米厚。接着,凝胶官能化在一个两步骤的过程(红色轮廓框)。首先,磺基SANPAH缀合的丙烯酰胺凝胶的表面通过UV光曝光。第二,凝胶温育与胶原或聚-D-赖氨酸,它重视在磺基SANPAH的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯。这一数字已经从10。

    3,凝胶功能化

    注:DNA凝胶的官能化所需的细胞粘附,因为聚丙烯酰胺凝胶上是惰性的材料( 见图2)。在本节中,凝胶剂将官能化在两个步骤。首先,N -Sulfosuccinimidyl-6(4#39; - 叠氮-2'-硝基苯基氨基)己酸或磺基SANPAH将共价由硝基苯基叠氮基团的光解作用的DNA凝胶的聚丙烯酰胺主链相连。第二,在胶原蛋白或聚-D-赖氨酸的伯胺将附着在磺基SANPAH的磺基N-羟基酯的蛋白质附着到凝胶表面。

    1. 删除缓存中的井用吸管,小心不要吸胶。注意:不要进行负压吸引术,以减少吸胶的可能性。
    2. 可选的)洗凝胶三次15分钟,在室温以除去过量的丙烯酰胺单体,TEMED和APS。
    3. 加入约300微升磺SANPAH的每张凝胶。
    4. 露出凝胶紫外线(365纳米)为5分钟。
    5. 删除磺SANPAH。
    6. 漂洗凝胶一次,用PBS洗涤以除去过量的磺基 - SANPAH。
    7. 重复步骤3.3-3.6。
    8. 孵育凝胶在约300微升的聚-D-赖氨酸的0.2毫克/毫升的1小时在室温或O 2 / N在4℃下。注:另外,孵化用的凝胶型胶原蛋白1 O / N在4℃的0.2毫克/毫升。
    9. 用PBS洗两次凝胶5分钟,以除去过量的聚-D-赖氨酸。
    10. 孵育在约300微升的介质的凝胶30分钟,以平衡凝胶。
    11. 立即电镀细胞前取出介质。

    4,细胞培养和成像

    注:在本节中,我们提供了关于软化或细胞接种后硬化凝胶的详细信息。未提供详细的细胞培养协议有以下几个原因。首先,大量的细胞类型能够坚持到DNA的凝胶和不同的细胞类型,需要由研究人员对细胞电镀具体的调整。其次,用于这些实验的标准细胞和组织培养技术,可在众多的原创文章,技术文章和参考书籍中找到。用于特异性镀成纤维细胞和神经元上的DNA凝胶技术可在previ中找到项出版物9-11,19-21。

    1. 板块细胞。有关解剖这篇文章中提到的神经元或成纤维细胞和/或培养协议,请参考下列出版物9-11,19-21之一。
    2. 至少48小时后,用移液管加入1μl的控制,L2或R2溶液接近凝胶( 表4)调制的凝胶硬度。
      1. 从80%硬化的凝胶,以100%的交联(80→100%凝胶)中,加入1微升100%L2溶液接近凝胶加L2的剩余的20%至80%的凝胶。
      2. 从100%变软的凝胶,以80%的交联(100→80%凝胶),添加R 2,加入1微升100%R2溶液接近凝胶以除去由100%的凝胶的交联的20%。
      3. 为对照,加入1微升的对照溶液接近凝胶的对照溶液等体积增加100%和80%凝胶剂的子集。
    3. 之后执行所期望的细胞处理和数据分析最少48小时的。

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Representative Results

在此之前我们的研究,细胞外基质的相互作用,观察静态兼容生物材料或不可逆的单向动态基板。这些衬底不准确地反映细胞微环境的动态性质。我们的工作提供了研究的细胞外基质相互作用的软化和硬化动态生物材料更生理模型转移现有的技术范式。在以往的研究中,我们通过研究各种细胞的形态和表型上这些凝胶上分析细胞活力衬底的效果。在一个例子中,我们通过评价成纤维细胞形态学上的动态DNA凝胶确定衬底补强对成纤维细胞的影响。 L929细胞,小鼠来源的成纤维细胞株,接种在80%和100%的凝胶( 3)11。电镀后两天,20%额外的L2溶液加入到80%的凝胶介质变硬的凝胶,以100%的交联(80→100%,中心面板)。 100%的凝胶和另一组的80%凝胶上接收到的控制单链DNA,以保持静态(左和右面板,分别)。光镜图像被抓获的DNA传递给媒体后两天。图像模糊,如在图3中看到的那样,是由于凝胶的表面凹凸,是典型的和不可避免的。凝胶溶胀和收缩,从加法缓冲器和L2 18,21的产生,有利于凝胶化不均。形态与ImageJ的软件(美国国立卫生研究院,贝塞斯达,MD)进行了评估,并担任功能的指标。生长在加固胶(80→100%),成纤维细胞中有高宽比没有变化,但呈现出较大的投影面积比增长100%凝胶11的成纤维细胞。有趣的是,生长在静态凝胶成纤维细胞的形态是不同的,以生长在动态凝胶成纤维细胞的形态。生长在100%的凝胶成纤维细胞具有较小的投影面积,以及较大的纵横比大于生长在80%凝胶成纤维细胞。这些重sults表明成纤维细胞的行为依赖于微环境的动态性质。在另一项研究中,基底软化对神经元的影响,通过分析神经元表型,包括枝晶数,枝晶的长度,和轴突长度( 4)10进行测定。源于大鼠的脊髓神经细胞的生长在100%和50%的凝胶。电镀后四天,50%R2加至100%的凝胶介质软化凝胶70%的交联(100→50%,中心面板)。 50%的凝胶和另一组的100%的凝胶接收控制单链DNA,以保持静态(右侧和左侧板,分别)。三天后,神经元进行固定和免疫染色用树突状标记(MAP2,顶部小图),一个轴突标记(头,中间小图),和细胞核(DAPI,底部小图)来评价表型。生长在软化凝胶(100→50%)的神经元中过一次枝晶号码或轴突长度没有差异,但表现出了比神经元生长Ø短初级树突 Ñ​​50%的凝胶。在成纤维细胞的研究,静态凝胶神经表型不同,以动态凝胶神经表型。生长在50%凝胶神经元有少量初级树突和轴突长比增长100%硅胶的神经元。最后,成纤维细胞和神经元的图像表明,多种细胞类型可以研究上的动态和静态的DNA凝胶,DNA凝胶不均匀性会导致成像的挑战,标准的形态学和免疫组化技术是可行的,而且最重要的细胞的行为依赖于底物动力学。

图3
图3:成纤维细胞生长在静态和动态的DNA凝胶。的L929成纤维细胞的代表性的光显微镜图像上生长80%(左面板),80→100%(中图),和100%的凝胶(右图)。比例尺为100微米。这一数字已经从11。HREF =“htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg”目标=“_ blank将”>请点击这里查看该图的放大版本。

图4
图4神经元生长的DNA凝胶。生长在100%(左面板)脊髓神经细胞的代表性的荧光图像,100→50%(中心板),和50%(右图)的凝胶。 MAP2免疫染色表明树突(上图),τ-1免疫染色表明轴突(中图)和DAPI染色表明核(底部小图)。比例尺为100微米。这一数字已经从10。 请点击这里查看该图的放大版本。

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Discussion

DNA凝胶的能力来软化或硬化之前和之后细胞粘附使得他们研究的动态组织硬度在细胞功能中的作用的理想模型。所有三种设计中采用了机械和生物学研究。然而,所有三个设计具有各种交联百分数类似弹性,表明交联长度不影响DNA的凝胶弹性( 表2)。与此相反,丙烯酰胺浓度影响的弹性。这些设计可以不同交联动力学自凝胶破裂的倾向,或凝胶的倾向,在媒体或者缓冲溶解,随增加交联点的长度。对DNA凝胶但是动能的信息是有限的,但我们知道交额外30%发生二级交付50%的DNA凝胶11后的两天。然而,从凝胶软化和硬化膨胀和收缩力的产生,分别是不可避免的,并且不能被解耦18,21。应力21 100→70%凝胶生成大约0.5帕,而50→100%的凝胶,因为需要更多的能量来形成三个机架的ssDNA 18之间键仅产生约0.04帕的压力。因此,结果的解释需要的应力和应变的硬化和凝胶剂的软化产生的代价。

准备的DNA凝胶时可能出现的技术挑战。最常见的技术问题是凝胶破裂。凝胶破裂可发生在DNA的凝胶制剂的几个阶段,包括凝胶溶胀,存储和细胞生长。硅胶破裂是由多种因素造成的。首先,凝胶破裂可以是不当溶液组合物的结果。常见的错误包括冻干的单链DNA和不当的移液的粘性液体的不足溶解。为了避免移液误差,提高加热温度,以减少凝胶粘度的解决方案更容易吸取或分装所需的时'mount SA1和先于第二氮气鼓泡步骤SA2中的聚合溶液中。此外,该聚合溶液的反复加热可部分蒸发该溶液,并增加溶液的粘度。加TE缓冲液中几微升有助于降低粘度。其次,硅胶破裂可以是DNA质量差的结果。 QA / QC报告必须经常查看。如果QA / QC报告是可以接受的,凝胶爆裂仍然发生,高效液相色谱纯化的单链DNA可以提高DNA的质量。第三,凝胶破裂可导致DNA的退火不充分。我们已经减少了凝胶破裂的发病率,包括退火步骤和rehybridization步骤,在原来的协议(见步骤1.3.6和2.8,1.3.8和2.10,分别)。凝胶破裂可能通过延伸退火和冷却时间被防止。然而,更多的暴露在热量蒸发水分,使玻璃增加了凝胶分离时的凝胶重新膨胀。如果脱离过度任何退火时,安伊令的步骤可以被消除(1.3.6和2.8)。

遇到的另一个常见的​​技术问题是不充分的细胞粘附。溶胀的凝胶比未溶胀凝胶( 2)18 ​​制作的细胞粘附难以柔和。此外,由于不同的细胞类型的反应不同,以组织硬度,一些类型的细胞可能会遇到此技术的困境,而其他类型的细胞没有。如果要解决粘附问题的一​​些后续步骤,应考虑:(1)使用高接种密度,(2)交替地偶联至磺基SANPAH的ECM蛋白,(3)调制的刚度参数,(4)提高细胞外基质蛋白或磺基SANPAH浓度,以及(5)增加孵育时间。残留的有毒物质,如丙烯酰胺单体,APS和TEMED还有助于缺乏粘附和细胞死亡的凝胶。我们没有经历过这样的问题,因为纳入协议的广泛洗就已足够,但我们建议表现orming可选步骤3.2如果发生这个问题。

DNA的凝胶可用于更有效地研究了多种细胞功能的动态或静态条件下。我们已经表明,成纤维细胞及神经元的生长在DNA凝胶受凝胶弹性的调制。因为细胞 - 基质相互作用通常是三维接口,从三维动态矩阵研究的信息,有利于生产更多的生物相关的数据。因此,我们目前正在将这一技术应用到三维支架。我们正在开发替代聚丙烯酰胺骨干以更加生物相容性材料,在保持DNA的交联技术的技术。这种新支架将作为一个三维的,动态模型和组织工程支架。其生物相容性将打开医疗设备应用的机会。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

作者要感谢:弗兰克博士姜大卫林博士,伯纳德Yurke博士和乌代Chippada博士为他们开发的DNA凝胶技术的贡献;诺雷尔Hadzimichalis博士,斯密特·沙阿,金佰利彼得曼,罗伯特·阿特尔的意见和这份手稿的编辑;资金来源包括新泽西州委员会对脊髓损伤研究(批准#07A-019-SCR1,NAL)和新泽西州神经科学研究所(MLP);与组织工程的出版商,A部分为许可转载图2图4生物材料的许可转载如图3所示

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com
Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com
T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com
12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com
NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com
C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com
13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com
F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/
NI 5.0UH-R

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