Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Immunology and Infection
 

Summary

Leukozyten-Rekrutierung in die Leber tritt innerhalb der spezialisierten Kanäle der Lebersinuskurven, die durch einzigartige hepatischen sinusoidalen Endothelzellen ausgekleidet sind. Phasenkontrast-Mikroskopie von Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel unter physiologischen Bedingungen der Schubspannung kann die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die diesen Prozess zugrunde liegen, zu erleichtern.

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Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. J. Vis. Exp. (85), e51330, doi:10.3791/51330 (2014).

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Abstract

Leukozyten-Infiltration in menschlichem Lebergewebe ist ein gängiges Verfahren in aller erwachsenen entzündlichen Lebererkrankungen. Chronische Infiltration kann die Entwicklung der Fibrose und die Progression der Zirrhose zu fahren. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Leukozyten-Rekrutierung in die Leber vermitteln könnten wichtige therapeutische Ziele für Lebererkrankungen zu identifizieren. Der Schlüssel Interaktion während Leukozyten-Rekrutierung ist, dass der Entzündungszellen mit Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung. Recruitment der Leber tritt innerhalb der geringen Scher Kanäle der Lebersinuskurven, die durch Lebersinus Endothelzellen (HSEC) ausgekleidet sind. Die Bedingungen in den Lebersinuskurven können durch Perfusion Leukozyten durch die Kanäle durch menschliche HSEC Monoschichten an bestimmten Flussraten ausgekleidet rekapituliert werden. Unter diesen Bedingungen Leukozyten durchlaufen eine kurze Anbindung Schritt, gefolgt von der Aktivierung und feste Haftung, gefolgt von einem Schritt kriechen und nachfolgende Transmigration durch die endothelialeSchicht. Mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie, kann jeder Schritt dieser "Adhäsionskaskade 'visualisiert und aufgezeichnet, gefolgt von Offline-Analyse werden. Endothelzellen und Leukozyten können mit Inhibitoren vorbehandelt, um die Rolle von spezifischen Molekülen während dieses Prozesses zu bestimmen.

Introduction

Es ist nun bekannt, dass Leukozytenrekrutierung im Allgemeinen folgt dem Paradigma der mehrstufigen Kaskadenhaftung ein. Dies beinhaltet die Erfassung von Leukozyten aus Blut fließt durch Endothelzellen der Gefäßwand. Zunächst Leukozyten durchlaufen einen Walzschritt, der durch Selektin-Rezeptoren oder Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie vermittelt wird. Dies ermöglicht G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), das auf der Oberfläche von Leukozyten am Endothel Chemokine Glykokalyx dargestellt aktiviert. Dies führt zur Veränderung der Integrin-Bestätigung zu einem "hohe Affinität" Zustand auf der Oberfläche der Leukozyten und verhaften und feste Adhäsion an das Endothel. Firm Haftung wird dann durch Formänderung und Crawling der Leukozyten an der Gefäß gefolgt. Der letzte Schritt ist durch das Trans endothelialen Monoschicht, die über den parazellulären oder transzellulären Route erfolgen kann.

Während der mehrstufigen Kaskadenhaftung beschreibens der allgemeine Mechanismus der Leukozyten-Rekrutierung innerhalb des Körpers gibt es organspezifische Unterschiede. In der Leber der Großteil der Leukozyten-Rekrutierung erfolgt innerhalb der Lebersinuskurven im Gegensatz zu anderen Organen, wo Rekrutierung innerhalb der Post-Venolen 2 tritt in der Regel. Die Lebersinuskurven sind ein niedriger Scher Umwelt und Leukozyten unterziehen eine kurze Tethering Schritt vor, um die Haftung, die Selektin wird unabhängig 2 festigen. Diese Kanäle werden durch die Lebersinus Endothel, die diskontinuierlich und enthält fenestrae, offenen Poren 100-200 nm im Durchmesser gefüttert, und es fehlt eine Basalmembran 3. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel vermitteln könnte organspezifische therapeutische Ziele für entzündliche Lebererkrankungen zu identifizieren.

Flow-Adhäsions-Assays sind wesentliche Instrumente bei der Untersuchung Leukozytenrekrutierung. Sie erlauben die Rekonstruktion der Leukozyten recruitment in Gegenwart von Scherbeanspruchung, um die Haftung unter definierten Kräfte zu analysieren. Die häufigste Verwendung für den Test ist die Untersuchung Leukozytenadhäsion zu kultivierten Endothelzellen Monoschichten oder gereinigten Substraten. Im Handel erhältliche Strömungskammern werden verwendet, um Zellen unter Bedingungen einer laminaren Strömung zwischen zwei ebenen Flächen durchströmen und dann visualisieren den dynamischen Prozess der Haftung auf ein Mikroskop 4. Zurück Gruppen haben gezeigt, dass bestimmte adhäsive Wechselwirkungen unter Fluss nur stattfinden, und kann nicht in statischen Tests 5,6 sucht werden.

Wir haben diese Technik verwendet, um die Lebersinuskurven zu rekapitulieren und zu studieren Leukozytenrekrutierung unter Bedingungen geringer Scherbeanspruchung. Primäre humane HSEC in Mikroobjekttragerglaschen Leukozyten kultiviert und kann dann über diese Monoschicht bei einer Fließgeschwindigkeit berechnet, um die Scherspannung in Sinusleber reproduzieren perfundiert werden. Die Scherspannung ist eine Spannung, die parallel oder tangential zu einer Oberfläche aufgebracht wird oppauf Normalspannung, die senkrecht osed. Jedes Fluid, das entlang einer Grenze bewegt wird eine Scherbeanspruchung auf dieser Grenze auszuüben. Scherbeanspruchung ist gezeigt worden, eine wesentliche Komponente der Lymphozytentrans 7 sein. Unter diesen Bedingungen wird jeder Schritt des Adhäsionskaskade durch Phasenkontrastmikroskopie visualisiert werden. Dieses Verfahren hat wichtige Einblicke in die Rekrutierung von Leukozyten in der Leber einschließlich der Untersuchung der herkömmlichen Adhäsionsmoleküle 8, die Rolle von Chemokinen und Chemokinrezeptoren 9-11 und atypische Adhäsionsmolekülen wie dem vaskulären Adhäsionsmolekül-1 (VAP-1 erlaubt ) 8,12 und gemeinsame Lymph-und vaskulären endothelialen Rezeptor-1 (CLEVER-1) 13. Während dieser Assay wurde in mehreren Publikationen unserer Gruppe erwähnt wurde, hat seine Beschreibung war kurz und wir haben diese Gelegenheit genutzt, um eine detaillierte Schritt für Schritt Anleitung zur Verfügung stellen, um bei der Fehlersuche helfen und verhindern, dass technische Fehler beim Versuch,ten des Assays. Darüber hinaus haben wir vor kurzem die Beschaffung von Mikroobjektkammern, die genauen Änderungen in der Scherbeanspruchung ermöglicht verändert. Wir glauben, dass dies erweitert die Anwendbarkeit des Assays zu anderen Immunzellen und Endothelzellen. Das folgende Verfahren beschreibt die Herstellung und Verfahren zur Durchführung einer flussbasierten Haft Assay mit menschlichen Lebersinus Endothelzellen und Lymphozyten des peripheren Blutes.

Protocol

1. Mikroobjekt Vorbereitung

  1. Vorstrich ein Sechskanal-Mikroobjekt mit Rattenschwanz-Kollagen Typ I (RTC, in PBS 1:100 verdünnt geben eine Arbeitsverdünnung von 220 pg / ml). Dies wird durch Einspritzen von 30 &mgr; l verdünnt RTC-Lösung direkt in die Kanäle und Inkubation für 2 h bei 37 ° C, gefolgt von drei Waschungen mit PBS durchgeführt.

2. Seeding Zellen in Mikroobjekt

  1. In Trypsin-EDTA dissoziiert einer konfluenten T75-Flasche von kultivierten humanen hepatischen sinusoidalen Endothelzellen (HSEC) (aus Lebergewebe isoliert, wie zuvor beschrieben, 13), Waschen mit PBS und Resuspendieren in 3 × 10 6 Zellen / ml in Komplettmedium (human endothelial Grundmedium mit 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100μg/ml Streptomycin, 10% hitzeinaktiviertes AB Humanserum, 10 ng / ml vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor und 10 ng / ml an Hepatozyten-Wachstumsfaktor) supplementiert. Spritzen Sie 30 ul Zellsuspension directly in jeden Kanal.
  2. Lassen Zellen für 1 Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 anhaften ° C mit 5% CO 2-Atmosphäre auf einer Folie Rack. Nachdem die Zellen anhaften zu füllen die Ports auf jeder Seite jedes Kanals mit Vollmedium (Fig. 1).

3. Cytokin-Stimulation von Zellen

  1. Lassen Zellen in Inkubator für 24 Stunden. Bewerten Zellwachstum mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop. 24 Stunden vor dem Adhäsionstest, Stimulation der endothelialen Monoschichten mit Cytokin durch Austausch des Wachstumsmediums mit Vollmedium von Tumor-Nekrose-Faktor alpha und Interferon-gamma ergänzt, die beide bei 10 ng / ml.

4. Isolierung von Lymphozyten aus peripherem Blut

  1. Isolierung von Lymphozyten aus peripherem Blut Vollblut durch anfängliches Reinigen der einkernigen Fraktion durch Dichtegradientenzentrifugation über eine geeignete Zelltrennmittel Zentrifugation für 25 min bei 800x g. Die Zellen auf Kunststoff für 1 h inkubiert, um die Einhaltung von Monozyten zu ermöglichen.
  2. Nach Einhaltung der Kunststoff absaugen Lymphozyten angereicherten Überstand. Waschen der Lymphozyten und resuspendieren sie (üblicherweise 1 x 10 6 Zellen / ml in Strömungsmedium (Endothelial Basal Medium, enthaltend 0,1% (v / v) Rinderserumalbumin (BSA)).

5. Vorbehandlung von Endothel oder Leukozyten mit Inhibitoren

  1. Vorbereitung empfohlenen Verdünnungen Funktion blockierende Antikörper oder niedermolekularen Inhibitoren der endothelialen media/0.1% (v / v) BSA. Ersetzen Sie Vollmedium mit blockierenden Antikörper / Inhibitor-Lösung in ausgewählten Mikroobjekt Kanal 30 min vor Test fließen.
  2. Wobei die Vorbehandlung von Chemokin-Rezeptoren auf Lymphozyten sind geplant, resuspendieren isolierten Leukozyten in RPMI-Lösung, die 0,1% (v / v) BSA und Inkubation mit 200 ng / ml Pertussistoxin auf G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität von Chemokin-Rezeptoren blockieren, alternativ verdünnen spezifischen Funktionblockierenden Antikörpern oder niedermolekularen Inhibitoren von Chemokin-Rezeptoren bei den empfohlenen Verdünnung. Leukozyten Bei 37 ° C für 30 Minuten, dann waschen und resuspendieren in Strömungsmedium.

6. Setup-Flow-Testsystem

  1. Vorwärmen eine thermostatisch gesteuerte transparente Kammer 37 ° C. Die Kammer sollte Öffnungen zum Einführen Silikonschlauch und Elektronikversorgung für eine elektronische Schaltmagnetventil, das zwischen den Zellen und Medien können praktisch ohne Totvolumen. Die Kammer ist auf einem inversen Mikroskop, damit montiert Phasenkontrastmikroskopie. Fig. 2 zeigt die Strömungsanalysekammer und Mikroobjekt Mikroskop und auf dem Mikroskoptisch platziert.
  2. Prefill eine 50 ml Glasspritze mit Luer-Lock mit 10 ml sterilem destilliertem Wasser und legen eine Länge von 25 cm Silikonschlauch mit dem Spritzenkanal. Legen Sie in eine Spritzenpumpe. Verändern die Abzugsgeschwindigkeit des Spritzenpumpe nachAnweisungen des Herstellers Mikrodia einer Scherbelastung von 0,05 Pa (0,5 dyn / cm 2, Fig. 3) zu halten.
  3. Nehmen Sie zwei 5-ml-Spritzen, entsorgen Sie die Kolben und befestigen Sie die Fässer mit den beiden in-Flussöffnungen eines elektronischen Magnetventil mit Silikonschlauch.
    1. Bringen 12 cm Silikonschlauch an den Abfluss Ventil. Das Ventil ermöglicht Wechsel zwischen einem zellfreien Waschpuffer (endothelial media/0.1% (v / v) BSA) und der Lymphozytensuspension.
    2. Spülen der elektronischen Magnetventils durch Einsetzen Waschpuffer in beiden Spritzenzylinder und die Gewährleistung Puffer aus einem Zylinder durch das Ventil und in den Abfluss Silikonschlauch fließt.
    3. Verwenden Sie den Ventilschalter auf die andere Trommel abwechselnd und sicherzustellen, dass die Puffer fließt und dass alle Luftblasen aus dem System entfernt. Entfernen Waschpuffer von einem der Fässer und ersetzen mit Lymphozytensuspension 4a.
  4. Schließen Sie das Silikon Tubing aus der Spritzenpumpe an einem Port eines ausgewählten Mikroobjektkanal über einen Mikroobjektteil. Dann verbinden Sie den Silikonschlauch von der Ablaufventil auf der gegenüberliegenden Hafen über einen Mikroobjektteil. Stellen Sie sicher, dass die Silikonschlauch und die Adapter mit Waschpuffer vor der Verbindung gefüllten Luftblasen in das System (Abbildung 4b) zu verhindern.
  5. Einmal auf das Flusssystem angeschlossen, stellen Sie den Mikroobjekt auf dem Mikroskoptisch und bringen mit Clips oder Klebeband auf die Bewegung zu verhindern. Stellen Sie das Mikroskop auf die 10X-Objektiv zusammen mit der entsprechenden Phase-Einstellung. Sicherstellen, dass die endotheliale Monolayer visualisiert und Fokus mit der Augenlinse. Bilder sorgen kann über eine Kamera, die mit dem Mikroskop, wobei Bilder auf einem Monitor weitergeleitet und aufgezeichnet werden angebracht erfasst werden.

7. Flow-Assay-Technik und Aufzeichnung der Haftung für Analysis

  1. Perfundieren das Endothel mit Waschpuffer für 2 min von Beginn withdrawal der Spritzenpumpe, um jeglichen Schmutz oder ungebundenen Antikörper zu entfernen Sperrung und wechseln Sie dann das Ventil, um eine 5 min Bolus von Leukozyten-Lösung bei einer konstanten Wandschubspannung von 0,05 Pa ermöglichen
  2. Während der letzten 2 min der Leukozyten-Bolus, notieren 10 Zufallsfelder entlang der Länge des Mikroobjekt. Dies ermöglicht die Offline-Analyse von Lymphozyten-Roll / Tethering auf dem Endothel-Monolayer. Nehmen Sie jedes Feld für ca. 10 Sek., bevor Sie zum nächsten und sicherzustellen, dass Aufnahmen gegen die Strömungsrichtung der Aufnahme den gleichen Roll Zelle zweimal schnell hintereinander zu vermeiden.
  3. Folgen der Leukozyten Bolus mit einem 5 min Bolus Waschpuffer durch Rückkehr des Ventils in seine Startposition. Während der letzten 2 Minuten des Bolus Durchführung einer zweiten Aufnahmephase durch die Wahl mindestens 10 zufällig ausgewählten Bereichen entlang der Länge des Mikroobjekt. Nehmen Sie jedes Feld für ca. 5 sec, bevor Sie zum nächsten und sicherzustellen, dass die endotheliale Monolayer und haft leucocytes sind in klaren Fokus. Dies ermöglicht die Offline-Analyse des Musters der Adhäsion.

Representative Results

Dieser Assay bietet die Möglichkeit, den mehrstufigen Strömungs Adhäsionskaskade visualisieren und Aufklärung der molekularen Mechanismen, durch den Vergleich der Ergebnisse der Kontrollexperimente, um solche mit Molekularinhibitoren. Verschiedene Gefäßbetten kann, indem spezifische Endothelzellen und die Änderung Scherstressbedingungen rekapituliert werden.

Jeder Schritt des Adhäsionskaskade können offline durch folgenden Aufzeichnungsverfahrens in dem Protokoll beschrieben analysiert werden. Der erste Schritt des Adhäsionskaskade ist das Rollen der Leukozyten, die als Prozentsatz der gesamten haftenden Zellen exprimiert werden können. Offline-Analyse kann die Anzahl der adhärenten Zellen, die in jedem Bereich aufgezeichnet während der Leukozyten-Bolus aufgezählt werden. Die Wiedergabe des Bildes ermöglicht den Vergleich von Zellen, die fest haftenden und diejenigen, die unterzogen werden eine Rollbewegung durch das Endothel sind. Rollbewegung kann mit dieser Technik dargestellt werden, wird jeder Bereich für mindestens 10 Sekunden aufgezeichnet. Rollende Zellen werden durch ihre reduzierte Geschwindigkeit über die endothelialen Oberfläche im Vergleich zu fließenden Zellen identifiziert. Dieses Verhalten ist für mindestens 5 sec ohne Ablösung nachgewiesen werden. Die Haftung Kaskade innerhalb der Lebersinuskurven erfolgt in einer geringen Scher Umwelt-und in-vivo-Studien haben nur geringen Roll mit einer kurzen Tethering Schritt bestätigt. Wir haben bestätigt, dass die Strömungs Assay spiegelt die Umgebung der hepatischen Sinusoiden durch den Nachweis, dass weniger als 10% der adhärenten Leukozyten anhaltend rollen stimulierte HSEC in diesen Assays.

Der nächste Schritt des Adhäsionskaskade ist eine feste Haftung. Insgesamt kann die Einhaltung der zweiten Stufe der Aufzeichnung während des Waschpuffers Bolus (Schritt 7.3) ermittelt werden. Offline-Analyse ermöglicht die Gesamtzahl der fest adhärenten Zellen, die in jedem Bereich (Abbildung 5) gezählt werden. Fest haftenden Zellen werden als Zellen, die stationär oder mit langsamen Kriechen Verhalten shapechanged sind definiert.Die durchschnittliche Anzahl von Zellen pro Feld kann dann berechnet werden. Diese Zahl kann dann verwendet werden, in Verbindung mit der Gesamtoberfläche des Sichtfelds (bestimmt unter Verwendung eines Rasters oder Äquivalent), die Konzentration von Lymphozyten (typischerweise 1 x 10 6 Zellen / ml) und die Durchflussrate, um das Ausmaß auszudrücken Lymphozytenanhaftung als adhärente Zellen / mm 2/10 6 Zellen perfundiert.

Studieren Sie das Muster der Haftung umfasst die Analyse der letzten beiden Schritte die Haftung Kaskade einschließlich Formänderungen, Krabbeln und transendotheliale Migration. Leukozyten Anhänger der oberen Fläche der HSEC Monophasen hell erscheinen, während diejenigen, die durch die Monoschicht migriert haben, erscheinen dunkle Phase (Abbildung 6). Die Zellen können dann als "statische" Haftung (nonmigrated / Runde) zeigen "-Form-verändert" Morphologie klassifiziert werden, oder als "migriert" und einzelnen Kategorien werden dann als Prozentsatz der AusdruckGesamthaft Bevölkerung.

Figur 1
Fig. 1 ist. Monolayer von primären humanen Lebersinus Endothelzellen in Flusskammer. A) Mikroobjekttragerglaschen mit Medien, die Monoschicht von Endothelzellen vor Beginn der Strömung Adhäsionstest. B) Phasenkontrastbild konfluenten endothelialen Monoschicht gefüllt ist, sollte Endothelzellen in die Mikroobjekt vorbeschichtet wurden ausgesät werden (für den menschlichen Leberendothelzellen sollte dies sein mit Rattenschwanz-Kollagen Typ 1) und es ist wichtig, dass die Endothelzellen sind gesund in Kultur und konfluent. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 2 2. Durchflusskammer-Assay. A-Flow-Assay Kammer Set-up ist hier zu sehen, es besteht aus einer transparenten Kammer, die auf einem inversen Mikroskop montiert ist. Eine Heizung in der Kammer platziert und sollte thermostatisch gesteuert werden, um eine Temperatur von 37 ° C zu halten Es sollte Ports zur Verfügung Silikonschlauch von einem Mikroobjektträger innerhalb der Kammer, um eine Spritzenpumpe, die außerhalb angeordnet ist, zu verbinden. Die Mikroobjekt wird direkt auf den Mikroskoptisch gelegt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 3
3. Spritzenpumpe. Eine Spritzenpumpe ist zu verbindenüber Silikonschlauch auf die Strömungskammer ed. Die Pumpe auf eine spezifische Entzugsrate in Abhängigkeit von der für den Test erforderlich gewünschte Schubspannung eingestellt ist. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 4
4. Anschlussventil zur Flusskammer. A) Ein elektronisches Magnetventil ermöglicht das Umschalten zwischen zwei Spritzenzylinder, die entweder Zellen oder Medien praktisch ohne Totvolumen. B) Sobald das Ventil gespült wird und die beiden Fässer sind eingerichtet, die Silikonschlauch vom Ventil an die Strömungskammer angeschlossen. Entscheidend ist, dass beim Anschluss des Adapters an der Siliconschlauchleitung mit dem Anschluss an der Strömungskammer befindet sich eine Flüssigkeit / Flüssigkeit-Grenzfläche. <a href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 5
5. Messung des Gesamt-Leukozyten-Anhaftung. Während der letzten zwei Minuten des Waschpuffers Bolus Schritt (wie in dem Protokoll beschrieben), sollte ein Minimum von zehn zufälligen Feldern aufgezeichnet. Diese können off-line analysiert werden, und die Gesamtzahl der fest haftenden Zellen können in jedem Bereich gezählt werden. Gesamthaftung von Leukozyten zwischen Steuerkammern und solche mit blockierenden Antikörpern vorbehandelt verglichen werden, hier zeigen wir einen repräsentativen Bereich von einem Steuerschieber und eine Rutsche mit intrazellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1)-blockierenden Antikörper vorbehandelt. Arrows wurden hinzugefügt, um die anhaftenden Leukozyten zu markieren, in der Vertretertive Feld von der Steuerschieber gibt es insgesamt 25 Leukozyten identifiziert und in der ICAM-1-Block Schlitten gibt es insgesamt 13 Leukozyten identifiziert. Maßstabsbalken = 100 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 6
6. Analyse des Musters der Leukozytenadhäsion an Endothelzellen-Monoschichten durch Phasenkontrastmikroskopie. Offline-Analyse der aufgezeichneten Felder können auch verwendet werden, um die Richtung und die Geschwindigkeit der Leukozyten-Adhäsion zu untersuchen. Konkrete Schritte des Adhäsionskaskade visualisiert und quantifiziert mittels Phasenkontrastbildgebung werden. Phase hellen Zellen, die fest haftenden, aber nicht aktiviert sind, können "runde" Haftung, die Zellen, die activate sind bezeichnet werdend und Phasen hell kann 'Form verändert "bezeichnet werden und die Zellen, die dunkle Phase sind die Zellen, die transendotheliale Migration unterzogen haben und kann bezeichnet werden" migriert ". Das Bild zeigt Beispiele der einzelnen Muster der Haftung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

Der kritischste Schritt für eine erfolgreiche Durchführung Flow-Assay wird sichergestellt, dass eine gesunde und konfluente Monoschicht von Endothelzellen bereit ist vor der Durchfluss Adhäsionstest. Primäre Endothelzellen schwierig, Kultur und sensibel auf Veränderungen in der Kultivierungsverfahren sein kann. Es ist wichtig, dass 1) Strömungskammern ausreichend und gleichmäßig mit endothelialen Zellen in einer Monoschicht beschichtet ist, für HSEC wir Rattenschwanzkollagen vom Typ I, aber dies kann für andere endotheliale Populationen unterscheiden, 2) Kulturmedium für die Zelltyp geeignet, für HSEC haben wir unsere Komplettmedium in der Protokoll-Abschnitt beschrieben. Weitere wichtige Schritte sind die Festlegung der Spritzenpumpe mit der entsprechenden Rate auf physiologische Werte der Scherspannung zu reflektieren.

Während des Flow-Assay ist es notwendig, Luftblasen innerhalb des Strömungskreislaufs, der die endotheliale Monoschicht beschädigen oder Streifen Immunzellen aus dem Endothel Oberfläche zu verhindern. Dies kann durch en verhindert werdenSüring, dass alle Silikonschlauch und Adapter sind mit Waschpuffer vor der Verbindung durchblutet, dass alle Luftblasen entfernt werden und dass die Medien vor der Verwendung vorgewärmt. Wenn die Adapter an die Anschlüsse auf der Mikroobjekt ist es sehr wichtig, dass es eine Flüssigkeit / Flüssigkeit-Grenzfläche während der Verbindung, wenn es irgendeine Luft, dann wird dies einen Luftspalt innerhalb des Systems, die den endothelialen Monoschicht während der Spritze Rückzug stören wird auszubilden Schritt. Die Leukozyten-Lösung in den Spritzenzylinder regelmässige Bewegung zu gewährleisten, dass die Zellen sich nicht absetzen, wodurch die Aufrechterhaltung einer konstanten Zelldichte während des gesamten Experiments.

Während der Aufzeichnungsschritte ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Bild der endothelialen Schicht ausreichend scharf und klar, präzise Offline-Analyse zu ermöglichen, und dass während des zweiten Schritts des Flow-Assay (post Leukozyten-Bolus), dass genügend Zeit während des Waschpuffer übrig Phase vor der Aufzeichnung wieder aufgenommen wird, um sicherzustellen, dassAlle nicht-adhärenten Leukozyten entfernt werden. Ebenfalls ist es wichtig, Endothelzellen Verwendung in einer Monoschicht von geeigneter Dichte, um den Verlust von Zellen, die mit Strömungsmuster in engen Kapillaren stören können, zu verhindern und auch schwer aus größeren anhaftenden Leukozyten unter Phasenkontrastmikroskopie diskriminiert werden. Wir haben optimale Aussaatdichte für den menschlichen Lebersinus Endothelzellen beschrieben, aber das kann zwischen verschiedenen Populationen und Arten endothelialen variieren.

Bedeutende Fortschritte bei der Untersuchung Leukozytenrekrutierung in Tiermodellen mit Intravitalmikroskopie gemacht worden. Der Hauptvorteil der Strömungshafttestverfahren ist, dass Leukozyten-Rekrutierung in einem binären System mit primären humanen Endothelzellen untersucht werden. Darüber hinaus können diese Wechselwirkungen unter physiologischen Ebenen in die Scherbeanspruchung untersucht werden. Es ist wichtig, Ergebnisse der Intravital-Studien an Tieren mit menschlichen Zellsysteme zu bestätigen, da es sein kann differences in Endothelzellen Eigenschaften zwischen den Arten. Eine der Einschränkungen des Flow-Assay ist, dass Leukozytenrekrutierung ist in einem einzelligen Umgebung der endothelialen Monoschicht untersucht. Darüber hinaus, wenn die Leukozyten haben halten und durch das Endothel transmigrierten sie nicht in ausreichender Zahl in den isoliert und nachgelagerten Prozessen unterzogen werden anwesend sein.

Trotz dieser Einschränkungen, wenn die Strömungs Adhäsionstest bewältigt wurde sie entwickelt werden können, um eine weitere Analyse der Leukozytenadhäsion Kaskade durchzuführen und geeignet ist, einen multizellulären Umgebung zu rekapitulieren. Längerer Aufnahme von einzelnen Feldern und den Einsatz von Tracking-Software verwendet werden, um kriechen Verhalten der Leukozyten zu analysieren. Ferner nach Beendigung des Flow-Assay kann unter Verwendung der Mikroobjekt konfokalen Laserrastermikroskopie und Immunfluoreszenz-Markierung zur Adhäsion und Trans genauer zu untersuchen abgefragt werden. Zusätzlich entwickeln wir bereits habened ein in vitro-Modell, bei dem fließenden Leukozyten konnte mit Leber Endothel durch die Anwesenheit von Hepatozyten Anlage interagieren. Dieser Test kann auch entwickelt, um Subpopulationen von Leukozyten zu untersuchen: hat unsere Gruppe mit Teilmengen, wie regulatorische T-Zellen, B-Zellen und Leber infiltrieren Leukozyten durchgeführten Studien.

Diese Studien belegen, dass die Strömung Haftung Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur allgemeinen und organspezifische Leukozytenrekrutierung in menschlichen Systemen zu studieren.

Disclosures

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen

Acknowledgments

SS wird durch ein Wellcome Trust Zwischen Clinical Fellowship, CW durch ein Wellcome-Trust-Programm Zuschuss finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Six channel microslide VI 0.4 flow chamber  Ibidi 80601 Other channel size and precoated slides are available depending on assay requirements.
Flow adaptors  microslide VI 0.4 Ibidi 80646
Flow assay chamber Solent Scientific 33-3322 These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. 
Inverted Microscope IX2 Olympus, UK Model IX50
Harvard Syringe Pump Harvard Apparatus, UK 702101
Electronic solenoid valve Lee Products Limited, UK Part Number LFYA1226032H
Silicon Tubing large Fisher Scientific FB50855 2 mm inner diameter, 4 mm outer diameter
Silicone Tubing-small Fisher Scientific FB50853 1 mm inner diameter, 3 mm outer diameter
Harvard Glass Syringe Harvard Apparatus, UK 55-0962
Cell separation medium/Lympholyte VH Bio CL-5020
Rat Tail Collagen Sigma Aldrich C3867-1VL

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References

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