Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Immunology and Infection
 

Summary

Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. J. Vis. Exp. (85), e51330, doi:10.3791/51330 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

İnsan karaciğer doku içine lökosit infiltrasyonu tüm yetişkin inflamatuar karaciğer hastalıklarında yaygın bir süreçtir. Kronik sızma siroza fibrozis ve ilerleme gelişimini sürebilirim. Karaciğer lökosit işe aracılık moleküler mekanizmaların anlaşılması karaciğer hastalığı için önemli terapötik hedefler belirlemek olabilir. Lökositlerin toplanması sırasında önemli etkileşim kesme stresi koşulları altında endotel olan inflamatuar hücrelerin olmasıdır. Karaciğer İşe karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (HSEC) ile kaplı olan hepatik sinüzoidler düşük kesme kanallar içinde gerçekleşir. Hepatik sinusoidler içindeki koşullar spesifik akış oranlarında insan HSEC tekkatmanlar ile kaplı kanallardan lökositler delinmesiyle değinmeyecek edilebilir. Bu koşullarda, endotelyal lökosit üzerinde bir tarama adımı ve sonraki göçü ardından aktivasyon ve sağlam yapışma ve ardından kısa bir birleştirme adımı, geçmesikatmanı. Faz kontrast mikroskobu kullanarak, bu 'yapışma çağlayan' her adımı görsel ve çevrimdışı analiz takip kaydedilebilir. Endotelyal hücreleri ya da lökositler, bu işlem sırasında özel moleküllerin rolü belirlemek için inhibitörleri ile muamele edilmiş olabilir.

Introduction

Bu şimdi de genel lökosit işe aşamalı yapışma kaskad 1 paradigma izler kurulmuştur. Bu durum, kap duvarını kaplayan endotel hücreler tarafından kan akışını lökositlerin yakalama içerir. İlk olarak, lökosit reseptörleri ya da imünoglobülin üst ailesinin üyelerini selektin aracılık ettiği bir haddeleme aşamasından geçen. Bu G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) endotel glikokaliks sunulan kemokinler ile aktive edilecek olan lökosit yüzeyinde ifade sağlar. Bu lökosit yüzey üzerinde bir 'yüksek afinite' durumuna integrin onay değişime yol açar ve tutuklama ve endotele firma yapışma. Firma yapışma sonra kabın üzerine lökosit şekli değişikliği ve taranmasına izlemektedir. Son adım paraselüler veya hücre üzerinden yolları ile de meydana gelebilir endotel mono-katman, bir göç yoluyla.

Aşamalı yapışma kaskad tarif ederkens vücut içinde lökosit işe genel mekanizma organa özgü farklılıklar vardır. Karaciğerde lökosit işe çoğunluğu genel olarak işe sonrası kılcal venüllerin 2 içinde ortaya çıkar diğer organlarda aksine hepatik sinüzoidlerdeki içinde gerçekleşir. Hepatik sinüzoidlerle düşük kesme ortam vardır ve lökosit bağımsız 2 Selektin olduğunu yapışma sıkılaştırmak için önce kısa bir birleştirme adımı tabi. Bu kanallar süreksiz ve Fenestrae, çapı açık gözenekler 100-200 nm içeren hepatik sinüzoidal endotel kaplı ve bir bazal membran 3 yoksundur. Insan hepatik sinüzoidal endotelyumda lökosit işe aracılık moleküler mekanizmaların tanıtılması organ enflamatuvar karaciğer hastalıkları için spesifik tedavi hedefleri belirlemek olabilir.

Akış yapışma deneyleri lökosit işe okuyan temel araçlardır. Onlar izin lökosit Recru yeniden inşasıiyi tanımlanmış kuvvetler altında yapışma analiz etmek için kesme geriliminin varlığında itment. Analiz için en sık kullanımı, kültürlü endotelyal ya da saflaştırılmış tek tabakaları alt-tabakalar için, çalışma lökosit yapışma sağlamaktır. Ticari olarak temin edilebilen akış gözlerinden iki yassı yüzey arasında laminar akış koşulları altında hücreleri perfüze edilmesi ve daha sonra mikroskop 4 yapışmasının dinamik işlemini görselleştirmek için kullanılır. Önceki gruplar belli yapışkan etkileşimler sadece akış altında yer aldığını göstermiştir ve statik deneylerinde 5,6 okudu edilemez.

Biz karaciğer sinüzoidlerde recapitulate ve düşük kesme stres koşulları altında lökosit işe çalışmak için bu tekniği kullandık. Primer insan HSEC Lam ve lökositlerden kültürlenir daha sonra karaciğer sinüzoidlerdeki içindeki kayma gerilmesi üretmek için hesaplanan akış oranında bu tek tabaka üzerinden perfüze edilebilir. Kesme gerilimi OPP yüzeyine paralel veya teğet uygulanan bir strestirdik normal stres osed. Bir sınır boyunca hareket herhangi bir sıvı olduğunu sınırında bir makaslama stres yaratacaktır. Kesme gerilmesi lenfosit göçü 7 önemli bir bileşeni olduğu gösterilmiştir. Bu koşullar altında yapışma kaskadının her adım faz kontrast mikroskobu ile görselleştirilebilir. Bu yöntem, geleneksel bir yapışma moleküllerinin 8'in çalışma, kemokinlerin ve kemokin reseptörlerinin rolü, 9-11, ve bu damar yapışma proteini-1 (VAP-1 gibi atipik yapışma molekülleri de dahil olmak üzere karaciğer içinde lökositlerin işe önemli bilgiler sağlamıştır ) 8,12 ve ortak lenfatik ve vasküler endotelyal reseptörü-1 (ZEKİ-1) 13. Bu tahlil, bizim grubun yayınlarının birkaç söz edilmiş olmasına rağmen, onun açıklama kısa oldu ve biz gidermede yardımcı ve teknik hataları önlemek için adım kılavuz detaylı bir adım sağlamak için bu fırsatı almış zaman denemesitahlil ing. Ayrıca, son zamanlarda kayma gerilmesi doğru değişiklikler sağlar mikroslayd odaları kaynak değişti. Bu endotel ve diğer bağışıklık hücreleri için tahlil uygulanabilirliğini genişletmektedir inanıyoruz. Aşağıdaki yöntem, insan karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ve çevresel kan lenfositleri ile bir akış göre yapışma deneyi gerçekleştirilmesi için hazırlanmasını ve teknik anlatılmaktadır.

Protocol

1.. Mikroslayd Hazırlık

  1. Ön Kaplama sıçan kuyruğu I tipi kolajen (220 ug / ml 'lik bir çalışma veren seyreltme 1:100 PBS içerisinde seyreltilmiş RTC) ile birlikte bir altı kanal mikroslayd. Bu da doğrudan bir kanal içine seyreltilmiş RTC çözeltisi 30 ul enjekte ve PBS ile üç kez, ardından 37 ° C'de 2 saat için inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir.

2. Lam içinde tohumlama Hücreleri

  1. Tripsin-EDTA (13, daha önce tarif edildiği gibi karaciğer dokusundan izole edilmiş) kültürlü insan karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin konfluent T75 şişesi (HSEC) ayrıştırmaları, tam ortam maddesi (insan endotel 3 x 10 6 hücre / ml 'de PBS içinde yıkama tekrar süspansiyon ve Bazal ortam 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve streptomisin 100ug/ml,% 10 ısı ile inaktive edilmiş insan AB serumu, vasküler endotelyal büyüme faktörü, 10 ng / ml ve hepatosit büyüme faktörü 10 ng / ml) ile takviye edilmiştir. Dire hücre süspansiyonu 30 ul enjektectly her kanal içine.
  2. Hücreler 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 1 saat boyunca yapışmaya bırak Bir slayt raf üzerinde% 5 CO 2 atmosferinde C °. Hücreler komple ortam (Şekil 1) ile her bir kanalın her iki tarafındaki bağlantı noktalarını doldurmak uymak için izin verildikten sonra.

3. Hücreler Sitokin uyarılması

  1. 24 saat boyunca kuluçka makinesi içinde hücreler bırakın. Bir ters faz kontrast mikroskop kullanılarak hücre büyümesini değerlendirin. Önce yapışma deneyi için 24 saat, tümör nekroz faktörü alfa ve interferon gama ile desteklenmiş tam ortam, 10 ng / ml 'de her ikisi ile büyüme ortamı değiştirerek sitokin ile endotelyal monokatmanlarına uyarır.

4. Periferal Kan Lenfositlerinin izolasyonu

  1. Ilk olarak, 800 ile 25 dakika boyunca bir hücre ayırma ortamı üzerine santrifüj yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile tek-çekirdekli fraksiyonu saflaştırılması kandan periferal kan lenfositleri izolex g. Monosit yapışmasını sağlamak için 1 saat boyunca plastik hücreleri inkübe edin.
  2. Plastik aspiratı bağlılığın ardından lenfosit süpernatant zenginleştirilmiş. Lenfositler yıkayın ve akış ortam içinde (tipik olarak 1 ila 6 x 10 hücre / ml (endotel bazal ortam ihtiva eden% 0.1 (v / v) inek serum albümini (BSA)) onları yeniden süspanse edin.

5. Inhibitörleri ile Endotelyumunun ya da lökositler Tedavi öncesi

  1. Endotel media/0.1 (% v / v) BSA işlevi bloke antikorlar veya küçük molekül inhibitörleri tavsiye edilen seyreltim dizileri hazırla. 30 dakika önce tahlil akmaya seçilen mikroslayd kanalda antikor / inhibitörü çözümü engelleme ile tam orta yerine.
  2. Lenfositler üzerinde kemokin reseptörlerinin ön-muamele planlanmaktadır yerlerde, (v / v),% 0.1 BSA içeren RPMI çözelti içinde tekrar süspansiyon izole lökosit ve kemokin reseptörlerinin G-protein kenetli reseptör aktivitesini bloke etmek Pertussis Toksin, 200 ng / ml 'si ile inkübe edilir, alternatif olarak, belirli seyreltik fonksiyonTavsiye seyreltmede antikor ya da kemokin reseptörlerinin küçük molekül inhibitörlerini bloke. Akış daha sonra ortam içinde tekrar süspansiyon ve yıkama, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin lökositleri.

6. Akış Deneyi sistemi ayar

  1. 37 için bir termostatik kontrollü şeffaf odası Prewarm ° C. Odası hemen hemen hiçbir ölü hacmi ile hücreler ve ortam arasında geçiş sağlayan elektronik bir solenoid valf için silikon tüp ve elektronik kaynağının yerleştirilmesi için bağlantı noktaları olmalıdır. Odacık izin vermek için, bir ters mikroskop üzerine monte edilir faz kontrast mikroskopisi. Şekil 2 mikroskopa yerleştirildi akış deney odası ve mikroskop ve mikroslayd gösterir.
  2. Steril damıtılmış, 10 ml su ile bir luer loc bulunan bir 50 ml'lik bir cam şırınga önceden doldur ve şırınga noktasına 25 cm silikon bir boru uzunluğu ekleyin. Bir şırınga pompası yerleştirin. Göre olan şırınga pompasının çekme oranı Alter0,05 Pa (0.5 din / cm 2, Şekil 3) bir kesme gerilimi korumak için mikroslayd üreticinin talimatları.
  3. , Iki adet 5 ml'lik şırınga al pistonu atmak ve silikon tüp kullanılarak bir elektronik solenoid valfinin iki akış bağlantı noktaları için varil ekleyin.
    1. Çıkış akış vanasına silikon boru 12 cm takın. Vana, bir hücre barındırmayan yıkama tamponu (endotelyal media/0.1% (v / v) BSA) ve lenfosit süspansiyonu ile almaşma izin verir.
    2. Her iki şırınga varil yıkama tamponu yerleştirmeden ve tampon bir varil vana ile ve dışarı akış silikon tüp içine akan sağlayarak elektronik selenoid vana yıkayın.
    3. Diğer alternatif namluya ve tampon akan ve tüm kabarcıklar sistemden kaldırılır sağlamak için valf anahtarı kullanın. Varil birinden yıkama tamponu çıkarın ve lenfosit süspansiyon Şekil 4a ile değiştirin.
  4. Silikon Tubin geçbir mikro adaptörü ile seçilmiş bir mikroslayd kanalın bir bağlantı noktasına şırınga pompası g. Daha sonra bir mikro adaptör ile ters bağlantı için çıkış valfinden silikon boru bağlayın. Silikon tüp ve adaptörleri hava kabarcıkları sistemi (Şekil 4b) girmesini önlemek için bağlantıdan önce yıkama tamponu ile dolu olduğundan emin olun.
  5. Bir kez akış sistemine bağlı, mikroskop sahnede mikroslayd yerleştirin ve hareketini önlemek için klipler veya bantla bağlamak. Uygun faz ayarı ile birlikte 10X objektif için mikroskop ayarlayın. Endotel tek tabaka görüntülenmiştir sağlamak ve odak oküler lens kullanarak. Emin olun görüntüleri görüntüler bir monitöre geçirilen ve kaydedilebilir sayede mikroskop bağlı bir kamera ile yakalanabilir.

7. Analiz için Yapışmasının Assay Tekniği ve kayıt akışı

  1. Withdrawa başlanarak 2 dakika boyunca yıkama tamponu ile endotel tabakası serpmekher kalıntı bağlanmamış bloke antikorunu çıkarın ve daha sonra 0,05 Pa sabit bir duvar kesme stresinde lökosit çözeltisi, 5 dakika bolus izin vermek için valfi geçmek için şırınga pompasının l
  2. Lökosit bolus son 2 dakika boyunca, Mikroslayd uzunluğu boyunca 10 rastgele alanları kayıt. Bu endotel tabaka üzerinde lenfosit haddeleme / bağlanıyor çevrimdışı analiz sağlar. Sonraki geçmeden önce yaklaşık 10 saniye boyunca her alanı kaydetmek ve kayıtları iki kez hızlı bir şekilde aynı yuvarlanma hücreyi kayıt önlemek için akış yönüne karşı yapılan emin olun.
  3. Kendi başlangıç ​​pozisyonuna vanayı dönerek yıkama tamponu 5 dk hap ile lökosit bolus izleyin. Bu bolus nihai, 2 dakika boyunca Mikroslayd uzunluğu boyunca en az 10 rastgele seçilen alanlar seçerek bir ikinci kayıt aşamasını gerçekleştirmek. Sonraki geçmeden önce yaklaşık 5 saniye boyunca her alanı kaydedebilir ve emin olun endotel tek tabaka ve yapışık leucocYtes net bir odak vardır. Bu yapışma Desenin çevrimdışı analiz sağlar.

Representative Results

Bu deney, çok aşamalı akış yapışma kaskad görselleştirmek ve molekül inhibitörleri ile kişilerce kontrol deneylerinin sonuçları karşılaştırarak temel moleküler mekanizmaları aydınlatmak için yeteneğine sahiptir. Çeşitli vasküler yatak belirli endotel hücrelerini içeren ve kayma gerilme durumlarını değiştirerek değinmeyecek edilebilir.

Yapışma kaskadının her adım protokolde belirtilen kayıt yöntemi izlenerek çevrimdışı analiz edilebilir. Yapışma kaskadının ilk adım toplam yapışık hücre yüzdesi olarak ifade edilebilir lökositlerin yuvarlanma olan. Çevrimdışı analiz yapışık hücre sayısı, lökosit bolus süresince kaydedilen her alanda numaralandırılmış sağlar. Görüntünün Çalma sıkıca yapışık ve endotel tabaka boyunca bir dönme hareketi geçirmekte olanlardır hücrelerin karşılaştırma sağlar. Yuvarlanma hareketi Bu teknik kullanılarak görüntülendi olabilir, her bir alan en az 10 saniye boyunca kaydedilir. Yuvarlanan hücreler akan göre endotel yüzeyi üzerindeki düşük hız ile tanımlanır. Bu davranış, ayrılma olmadan en az 5 saniye boyunca gösterilmelidir. Hepatik sinusoidler içinde yapışma çağlayanı düşük kesme ortamda gerçekleşir ve in vivo çalışmalar, sadece kısa bir bağlama adım minimal haddeleme doğruladı. Biz akış deneyi yapışık lökositlerin% 10 dan az ısrarla bu tahlillerde üzerinde HSEC uyarılmış rulo göstererek hepatik sinüzoidler ortamını yansıtan doğruladı.

Yapışma kaskadının bir sonraki adım sağlam bir yapışmanın sağlanmasıdır. Toplam yapışma yıkama tamponu bolus (adım 7.3) sırasında kayıt ikinci aşamasından hesaplanabilir. Çevrimdışı analiz sıkıca yapışan hücrelerin toplam sayısı (Şekil 5) Her alan sayılmıştır sağlar. Sıkıca yapışan hücreler, sabit ya da yavaş tarama davranışı ile shapechanged olan hücreler olarak tanımlanmaktadır.Alan başına ortalama hücre sayısı daha sonra hesaplanabilir. Bu rakam, daha sonra ölçüde ifade etmek için, lenfositler (tipik olarak 1 x 10 6 hücre / ml) konsantrasyonu ve akış hızını (gratikül veya eşdeğeri kullanılarak belirlenir) görüş alanındaki toplam yüzey alanı ile bağlantılı olarak da kullanılabilir yapışık hücre / mm olarak lenfosit yapışma 2/10 6 hücre perfüze edildi.

Yapışma desen incelenmesi yapışma kaskad, şekil değişikliği de dahil olmak üzere tarama ve transendotelyal göç son iki adım analizini içerir. HSEC tek tabaka üst yüzeyine yapışık Lökositler faz parlak tek tabaka boyunca göç etmiş olanlar iken faz koyu (Şekil 6) gibi görünür. Hücreler daha sonra, 'statik' yapışmasını (yer değiştirmemiş / yuvarlak) sergileyen olarak sınıflandırılan 'şekil değiştirdi' morfoloji veya 'göç' ve bireysel kategoriler daha sonra bir yüzdesi olarak ifade edilir edilebilirtoplam nüfus yapıştırıcı.

Şekil 1
Şekil 1. Akış odası içinde bulunan primer insan karaciğer sinusoidal endotelyal hücre tabakalı. Ortam önceki akış yapışma deneyinde konfluent tek tabaka endotel. B) faz kontrast görüntü başlamasından endotel hücrelerinin tek tabakasını ihtiva eden dolu A) Lam, endotel hücreleri (insan hepatik endotel hücreleri için bu konuda olmalıdır kaplanmış olan mikroslayd tohumlanmış olmalıdır sıçan kuyruğu kollajen tip 1) ve endotel hücreleri kültür ve kaynaşma sağlıklı olması esastır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2, Şekil 2. Deney odası akış. Bir akış deney odası set-burada görülebilir, bir ters mikroskop üzerine monte edilmiş şeffaf bir odadan oluşur. Bir ısıtıcı odasına yerleştirilir ve termostatik olarak 37 ° C'lik bir sıcaklığı muhafaza etmek üzere kontrol edilmelidir Dışında bulunan bir şırınga pompası için oda içinde bir mikro silikon boru bağlamak için bağlantı noktaları mevcut olmalıdır. Mikroslayd mikroskop sahnede doğrudan yerleştirilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Pompa şırınga. Bir şırınga pompa bağlamakakış haznesine silikon boru yoluyla ed. Pompa deney için gerekli istenen kayma strese bağlı olarak belirli bir geri çekilme oranı ayarlanır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4. Valf temizlendi ve iki varil vanasından silikon tüp, kurmak kez odasını akmaya vana bağlayarak. A) elektronik selenoid valf) neredeyse hiç ölü boşluk. B hücreleri ya da medya birini içeren iki şırınga varil arasında geçiş sağlar akış odasına bağlanır. Bu, akış odasının bağlantı noktasına silikon boru Adaptörü bağlanırken bir sıvı / sıvı arayüzü vardır önemlidir. <a href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target = "_blank"> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Şekil 5,. Total lökosit yapışma ölçümü. Yıkama tamponu bolus aşama (protokolde tarif edildiği gibi) son iki dakika boyunca, on rasgele alanların minimum kaydedilmelidir. Bu off-line analiz edilebilir ve sağlam bir şekilde yapışan hücrelerin toplam sayısı her alanda sayılabilir. Lökositlerin toplam yapışma kontrol odaları ve bloke edici antikor ile önceden tedavi olanlar arasında mukayese edilebilir, burada biz bir kontrol slayt temsili bir alan ve hücre içi adezyon molekülü-1 (ICAM-1) engelleme antikor ile hazırlanmış bir slayt göstereceğim. Oklar temsilcisi olarak, yapışkan lökositleri vurgulamak için eklenmiştirKontrol slayt alanını çabaya verilen belirlenen 25 lökositlerin toplam vardır ve ICAM-1 blok slayt belirlenen 13 lökositlerin toplam vardır. = 100 mikron Ölçek bar. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 6,
Şekil 6,. Kaydedilen alanların faz kontrast mikroskopisi ile tekli katmanlar üzerinde endotelyal lökosit adezyon Desenin analizi. Çevrimiçi analizi aynı zamanda lökosit yapışmasının yönünü ve hızını incelemek için kullanılabilir. Yapışma kaskadının belirli adımlar görsel ve faz kontrastlı görüntüleme kullanılarak belirlenebilir. Aktive sıkıca yapışık olmayan ama faz parlak hücreler 'yuvarlak' yapışma, activate olan hücreler olarak adlandırılan olabilird ve faz parlak 'değişmiş şekli' olarak adlandırılan olabilir ve faz karanlık hücreler transendotelyal göç geçirmiş ve 'göç' olarak adlandırılan olabilir hücrelerdir. Görüntü yapışma her desen örneklerini göstermektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Discussion

Başarılı bir akış deneyi gerçekleştirmek için en önemli nokta, endotel hücreleri, sağlıklı ve konfluent tek tabaka önce akış yapışma deneyi için hazır olduğunu garanti etmektedir. Primer endotelyal hücreleri kültürüne zor ve kültür yöntemleri değişikliklere karşı duyarlı olabilir. Bu 1) akış gözlerinden yeterli ve üniform bir tek tabaka endotel hücreleri ile kaplı olması önemlidir; HSEC için sıçan kuyruğu tip I kolajen kullanımı, ancak bu diğer endotel nüfus için farklı olabilir, 2) kültür ortamı için, hücre tipi için uygun HSEC biz protokol bölümünde bizim tam orta tarif var. Diğer önemli bir adım kesme geriliminin fizyolojik seviyelerini yansıtacak şekilde uygun oranda şırınga pompası ayar içerir.

Akış deneyi sırasında endotel tek tabaka zarar verebilir ya da endotel yüzeyinden bağışıklık hücreleri şerit olabilir, akış devresi içinde hava kabarcıklarını önlemek için gereklidir. Bu, en önlenebilirtüm silikon boru ve adaptörleri, tüm hava kabarcıkları çıkarılır ve ortam kullanımdan önce önceden ısıtılmış olduğu olduğu, bağlantıdan önce yıkama tamponu ile perfüze edilir ki suring. Bir sıvı / sıvı arayüz bağlantısı sırasında orada çok önemli olduğunu mikroslayd üzerinde limanlarına adaptörleri bağlarken herhangi bir hava varsa, o zaman bu şırınga çekilme sırasında endotel tek tabaka bozacak sistemi içinde bir hava boşluğu oluşturacak adım. Şırınga haznesinin lökosit solüsyon, hücreler bu şekilde, deney boyunca sabit bir hücre yoğunluğu sağlamak çökmeyen emin olmak için düzenli ajitasyon gerekmektedir.

Kayıt adımları sırasında endotel tabakasının görüntü yeterince hassas odaklı ve çevrimdışı analiz izin vermek için açık olduğundan emin olmak için önemlidir ve bu akış deneyi (sonrası lökosit bolus) ikinci aşaması esnasında yeterli bir süre, yıkama tamponu boyunca bırakılır Kayıttan önce faz sağlamak için tekrar başlatılırTüm nonadherent lökositler kaldırılır. Benzer şekilde dar kılcal akış modelleri engelleyebilir hücrelerin kaybını önlemek için ve aynı zamanda, faz kontrast mikroskobu ile daha büyük bir yapışkan lökositlerden ayırmak için zor olabilir, uygun yoğunlukta bir tek tabaka endotel hücrelerin kullanımı gereklidir. İnsan karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri için uygun tohumlama yoğunluğuna tarif ama bu farklı popülasyonlarda endotel ve türler arasında değişebilir.

Önemli bir ilerleme intravital mikroskobu ile hayvan modellerinde lökosit işe okuyan yapılmıştır. Akış yapışma deneyi yöntemin en önemli avantajı, lökosit işe primer insan endotel hücreleri ile ikili bir sistem içinde ele alınabilir olmasıdır. Dahası, bu etkileşimler makaslama stresin fizyolojik ilgili düzeyleri altında incelenebilir. Differenc olabilir gibi insan hücresel sistemler ile hayvanlarda Intravital çalışmaların bulguları doğrulamak için önemlidirtürleri arasında endotel özellikleri es. Akış testinin sınırlamalar biri lökosit işe endotel tek tabakalı bir tek hücreli ortamda okudu ediliyor olmasıdır. Lökositler endotelyumda yapıştırılır ve transmigrated kez ek olarak izole edildi ve sonraki işlemler maruz için yeterli sayıda mevcut olmayabilir.

Bu kısıtlamalara rağmen, akış yapışma deneyi hakim olmuştur kez lökosit yapışma kaskad daha analizini gerçekleştirmek için geliştirilmiş ve bir çok hücreli ortamı özetlemek için adapte edilebilir. Tek alanları ve izleme yazılımı kullanımı Uzun süreli kayıt lökositlerin sürünerek davranışını analiz etmek için kullanılabilir. Bundan başka, akış tahlilin tamamlanmasından sonra Lam daha ayrıntılı olarak yapışma ve transmigrasyonun çalışma için tarama lazer konfokal mikroskopi ile immünofloresan etiketleme kullanarak sorguya olabilir. Ayrıca, daha önceden geliştirmek varakan lökositler hepatositlerin varlığı ile şartlandırılmış karaciğer endotel etkileşebilen bir in vitro modeli ed. Bu deney aynı zamanda lökositlerin subpopülasyonunun incelemek için geliştirilmiş olabilir: grubumuz gibi düzenleyici T hücreleri, B hücreleri ve karaciğer infiltre lökositler gibi alt grupları ile çalışmalar yapılmıştır.

Bu çalışmalar akış yapışma deneyi, insan sistemlerinde genel ve organ spesifik lökosit işe incelemek için güçlü bir araç olduğunu kanıtlar vardır.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan

Acknowledgments

SS Wellcome Trust Programı Grant tarafından Wellcome Trust Intermediate Klinik Bursu, CW tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Six channel microslide VI 0.4 flow chamber  Ibidi 80601 Other channel size and precoated slides are available depending on assay requirements.
Flow adaptors  microslide VI 0.4 Ibidi 80646
Flow assay chamber Solent Scientific 33-3322 These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. 
Inverted Microscope IX2 Olympus, UK Model IX50
Harvard Syringe Pump Harvard Apparatus, UK 702101
Electronic solenoid valve Lee Products Limited, UK Part Number LFYA1226032H
Silicon Tubing large Fisher Scientific FB50855 2 mm inner diameter, 4 mm outer diameter
Silicone Tubing-small Fisher Scientific FB50853 1 mm inner diameter, 3 mm outer diameter
Harvard Glass Syringe Harvard Apparatus, UK 55-0962
Cell separation medium/Lympholyte VH Bio CL-5020
Rat Tail Collagen Sigma Aldrich C3867-1VL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. Clin. Invest. 2782-2790 (1997).
  3. Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).
  4. Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65, 859-873 (1991).
  5. Finger, E. B., et al. Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear. Nature. 379, 266-269 (1996).
  6. Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).
  7. Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines. Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).
  8. Lalor, P. F., et al. Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells. J. Immunol. 169, 983-992 (2002).
  9. Aspinall, A. I., et al. CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium. Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).
  10. Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow. Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).
  11. Oo, Y. H., et al. Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver. J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).
  12. Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein. J. Neural Transm. (2013).
  13. Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics