Påvisning av Fluorescent Nanoparticle Interaksjoner med Primær immun celle subpopulasjoner av flowcytometri

1Center for Micro-BioRobotics @SSSA, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Department of Biology, University of Pisa, 3Center for Biomolecular Nanotechnologies @UniLe, Istituto Italiano di Tecnologia
Immunology and Infection
 

Summary

Analyse av nanopartikler interaksjon med definerte subpopulasjoner av immunceller av flowcytometri.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gamucci, O., Bertero, A., Malvindi, M. A., Sabella, S., Pompa, P. P., Mazzolai, B., et al. Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (85), e51345, doi:10.3791/51345 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nanopartikler er utstyrt med svært lovende egenskaper for terapeutiske og diagnostiske formål. Dette arbeid beskriver en rask og pålitelig metode for analyse ved strømningscytometri for å studere nanopartikkel interaksjon med immunceller. Primære immunceller kan lett renset fra humane eller mus vev etter antistoff-mediert magnetisk isolasjon. I det første eksempel, kan de forskjellige cellepopulasjoner som kjører i et strømningscytometer skilles ved frem-spredte lyset (FSC), som er proporsjonal med cellestørrelse og sidespredt lys (SSC), relatert til celle indre kompleksitet. Videre fluorescensmerkede antistoffer mot spesifikke celleoverflatereseptorer tillate identifisering av flere subpopulasjoner i den samme prøven. Ofte, alle disse funksjonene varierer når cellene blir styrket av ytre stimuli som endrer deres fysiologiske og morfologiske tilstand. Her, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartikler er brukt som modell for å identifisere the internalisering av nanostrukturerte materialer i humane blodimmunceller. Cellen fluorescens og side-spredt lys økning etter inkubasjon med nanopartikler tillatt oss å definere tid og konsentrasjon avhengighet av nanopartikkel-celle interaksjon. Videre kan en slik protokoll bli utvidet til å undersøke Rhodamin-SiO 2 nanopartikkel samhandling med primær microglia, sentralnervesystemet bosatt immunceller, isolert fra muterte musene som spesifikt uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i monocytter / makrofager avstamning. Endelig strømningscytometri data relatert til nanopartikkel internalise inn i cellene har blitt bekreftet ved konfokal mikroskopi.

Introduction

Konstruerte nanomaterialer er i dag inspirerende interesse av livet forskere for potensielle søknader til biomedisin en. En lang rekke uorganiske og organiske materialer kan brukes til å produsere nanostrukturer med forskjellige former, fysiske og kjemiske egenskaper. Blant disse strukturene, konstruerte nanopartikler av sfærisk form viste stort potensial for diagnostisk og translasjonell medisin to. Deres kjerne og overflate-utforming er drevet av en mulig anvendelse, og det innebærer en dyp undersøkelse av mål-celle responser etter nanopartikkel kontakt og interaksjon. Nanopartikler som er tenkt å være bevisst gis til mennesker vil komme i direkte kontakt med flere typer immunceller. Deres ansvar å opprettholde kroppens integritet gjør dem et avgjørende tema for etterforskningen i nanomedisin tre.

Den cellulære delen av det medfødte immunsystemet er i hovedsak representert ved PHAGOcytes. Blant dem, monocytter / makrofag avstamning avledet celler, inkludert det sentrale nervesystemet bosatt mikroglia, spille en sentral rolle i immunforsvaret 4,5. De er i stand til å utløse en beskyttende immunrespons innen få timer etter møter med fremmedlegemer. Videre monocyttisk celler koordinere og instruere adaptive immunrespons gjennom utgivelsen av cytokiner. Alle disse hendelsene inntreffer selv i nærvær av konstruerte materialer, som i stor grad oppfattes som "nonself" av immunsystemet seks.

Blant metodene som historisk sett benyttet i immunologi for celleanalyse, strømningscytometri representerer en av de mest kraftfulle verktøy. Videre tillater tilgjengeligheten av teknologier for identifikasjon eller rensing av en spesifikk immun subpopulasjon (ofte å utnytte utelukkelse eller tilstedeværelsen av en enkelt membranprotein) en nøyaktig undersøkelse av effekten av et bestemt nanopartikler på det aktuelle primære cell type 7. Imidlertid, celler kan presentere fysiologiske og morfologiske forandringer etter eksponering for nanopartikler. I tillegg, kan nanopartiklene interferere med bestemte optiske parametere, for eksempel absorpsjon og emisjon av lys ved bølgelengder som er definert, å påvirke de oppnådde resultater 8. Derfor bør rammen av bruk og eventuelle tilpasninger av klassiske immunologiske assays til studiet av nye materialer tas i betraktning.

Dette arbeidet dreier seg om påvisning av nanopartikkel interaksjoner med primære immunceller ved strømningscytometri. For å løse dette problemet, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartikler ble ansatt som en modell nanomaterial å beskrive metoden. Silikapartikler kan fremstilles på en meget nøyaktig måte i nano-metriske akse. Størrelse, form og overflateegenskaper, for eksempel kostnad eller hydrofobisiteten, kan finjusteres for å øke sin biokompatibilitet ni. Mange trekk ved SiO 2 nanopartikler tillater dem å bli brukt som enmodell for levering av legemidler partikler 10. Videre kan fluorescerende farger eller kvanteprikker bli fanget, eller knyttet til disse partiklene som tilbyr nyttige nano-verktøy for bildebehandling formål 11.

Protocol

ETIKK ERKLÆRING

Mennesker og dyr prøvene ble behandlet etter retningslinjene i det italienske helsedepartementet, loven 116/92 og den europeiske fellesskaps rådsdirektiv 86/609/EØF.

En. Monocyte cellekulturer

  1. Kultur humane THP-1-celler i T-75-kolber inneholdende RPMI-1640-medium supplert med 10% humant serum, 50 U / ml penicillin og 50 mg / ml streptomycin, 0,05 mM β-merkaptoetanol ved 37 ° C i 5% CO2.
  2. Split kulturer når konfluent (hver 3-5 dager).

2. Isolering av perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra Buffy Coats

  1. Før isolering protokollen, forberede en oppløsning av fosfatbufret saltvann (PBS) pH 7,2, 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 0,5% bovint serum-albumin (BSA), tilsette 5 ml BSA stamoppløsning til 95 ml Skylling buffer (1: 20 fortynning). Degas buffer og holde den kald (2-8° C).
    VIKTIG: Hvis du ikke avgasse buffer kan resultere i mindre enn optimale resultater fordi bobler kan blokkere isolasjon kolonne (se trinn 3.2).
    Merk: Antikoagulerende citrat dekstrose formel-A (ACD-A) eller citrat-fosfat-dekstrose (CPD), kan alternativt anvendes. Omvendt kan det andre albumin-proteiner eller sera fra andre arter erstatte BSA. Ikke bruk buffere som inneholder Ca 2 + eller Mg 2 +.
  2. Skaffe buffy coats fra friske givere (i alderen 20-60 år gammel).
  3. Forbered 50 ml koniske rør for tettshetsgradient sentrifugering. Bestem antall rør som kreves for å behandle blod (hvert rør kan behandle 35 ml fortynnet blod) og tilsett 15 ml Ficoll-Paque i hver tom tube.
  4. Fortynn 8 ml blod med 24 ml av PBS / BSA / EDTA-løsning (1:04 fortynning).
  5. Lag forsiktig fortynnet oppløsning på toppen av Ficoll-Paque (tetthet = 1,077 g / ml) i hver av de 50 ml koniske rør. Ikke blandblod og Ficoll-Paque.
    VIKTIG: For å unngå blanding av blod og Ficoll-Paque, holder røret i 45 ° vinkel og lag blodet blandingen sakte.
  6. Sentrifuger ved 400 xg i 30 min ved 4 ° C. Mononukleære celler (MNC) vil ligge på plasma-Ficoll-Paque-grensesnitt, mens granulocytter og erytrocytter sediment på grunn av høyere densitet ved det osmotiske trykk av Ficoll-Paque.
  7. Overfør den interfase-celler (perifere mononukleære blodceller, PBMC) i et nytt 50 ml rør fylt med PBS / BSA / EDTA og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
  8. Vask pelleten to ganger med PBS / BSA / EDTA for å fjerne blodplater. Spin ved 200 xg i 10 min ved 4 ° C.
  9. Kultur cellene i komplett RPMI-1640 med 10% humant serum og antibiotika eller gå videre til monocytter rensing.

Tre. Rensing av Primary Monocytter fra PBMCs

  1. Isoler monocytter fra PBMCs av magnetiske kuler separasjon ved hjelp Humen Pan monocyte isolasjon kit:
    1. Pass celler gjennom en 30 mikrometer Nylon mesh (utskilling filtre, 30 mikrometer) for å fjerne eventuelle celleklumper.
    2. Bestem celle nummer ved hjelp av en hemocytometer.
    3. Sentrifuger cellesuspensjon ved 300 xg i 10 min ved romtemperatur (RT). Aspirer supernatanten helt.
    4. Resuspender cellepelleten i 30 mL PBS / EDTA / BSA buffer per 10 7 totale celler.
    5. Legg 10 mL FcR Blokkering Reagens per 10 7 totalt celler.
    6. Tilsett 10 pl av biotin-antistoff Cocktail per 10 7 totale celler.
    7. Bland godt og inkuber i 5 min ved 2-8 ° C.
    8. Tilsett 30 pl av buffer per 10 7 totale celler.
    9. Tilsett 20 ul av anti-biotin mikroperler pr 10 7 totale celler.
    10. Bland godt og inkuberes i 10 minutter ved 2-8 ° C.
    11. Suspender opp til 10 8 celler i 500 mL PBS / EDTA / BSA buffer.
  2. Magnetisk separasjon
    1. Følgelig til det totale celle nummer, velger en passende MACS kolonne og MACS Separator (se MACS kolonne datablad).
    2. Plasser kolonne i det magnetiske feltet i MACS Separator.
    3. Forbered kolonne ved å skylle med den passende mengde av PBS / EDTA / BSA buffer (MS kolonner: 500 mikroliter; LS kolonner: 3 ml).
      Merk: Kolonner er "flow stop" og ikke gå tørr.
    4. Påfør cellesuspensjon på støtten. Samle gjennomstrømningsinneholdende umerkede celler, som representerer den fraksjon anriket monocytt.
    5. Vask kolonnen 3x med PBS / EDTA / BSA buffer (500 mL for MS og 3 ml for LS per vask).
    6. Samle umerkede celler som passerer gjennom, representerer de beriket monocytt celler, og legge til gjennomstrømning av § 3.2.4.
      Merk: Vask kolonnen ved tilsetning av PBS / EDTA / BSA buffer alikvoter kun når reservoaret kolonnen er tom.
    7. (Frivillig) Fjern kolonnen fraseparator og plassere den på en passende samling rør. Pipetter bufferen på kolonnen (MS kolonner: 1 ml; LS kolonner: 5 ml). Skyll ut magnetisk merkede nonmonocyte celler ved fast å skyve stempelet inn i kolonnen.
    8. Kultur renset monocytter i fullstendig RPMI-1640 med 10% humant serum og antibiotika.

4. Rensing av Primary Monocytter fra Whole Blood

  1. Rens monocytter fra fullblod ved bruk av fullblod monocyte isolasjon kit etter produsentens anvisninger.

5. Nanoparticle Internalisering i blod leukocytter og Purified Monocytter

  1. Plate 5 x 10 5 celler / ml (1 ml / brønn) av de isolerte PBMC eller de rensede CD14 positive monocytter i en 12-brønns plate.
  2. Vortex FITC-SiO 2 nanopartikkel stamløsning og resuspender i komplett medium til en arbeidskonsentrasjon på 100 nM.
  3. Legg 10 mL av arbeids nanopArtikkelen suspensjon (100 nM) for behandlede prøver å nå en nanopartikkel endelig konsentrasjon på 1 nM. Til det samme volum av komplett medium for ubehandlede kontroller i hver brønn.
  4. Etter 1 time internalise samle prøver i et 1,5 ml polypropylenrør, og sentrifuger dem i 3 min ved 6000 xg ved romtemperatur.
  5. Vask pelleten med 1 ml av buffer 3 min ved 6000 xg ved romtemperatur.
  6. Resuspender pelleten i 200 pl rennende buffer. Cellene er nå klar for lesing ved strømningscytometri.

6. Isolering av primær Mixed Glial kulturer (Se Bertero et al. 7)

7. Replating en Mixed Glial Confluent Cell Culture

  1. Vask en T-75 kolbe én gang med 10 ml PBS (w / o Ca2 + / Mg + 2), og deretter tilsettes 10 ml av Versene og inkuberes ved 37 ° C i 5-7 min.
  2. Pipetter supernatanten opp og ned flere ganger for å løsne cellene fra T-75 overflaten og oppløsecelle aggregater.
  3. Overfør cellesuspensjonen i et 15 ml polypropylenrør. Samle inn en liten mengde av cellesuspensjonen for å telle cellene med et hemocytometer.
  4. Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 300 x g ved romtemperatur.
  5. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i en sluttkonsentrasjon på 5 x 10 5 celler / ml i komplett dyrkingsmedium glial.
  6. Plate 0,5 ml / brønn i en 24-brønns plate og la cellene takke med 2-4 timer før nanopartikkel behandling.

8. Nanoparticle Internalisering i Microglia

  1. Til 500 pl av komplett glial kulturmedium (for ubehandlede kontroller), eller 500 pl av en 2 x Rhodamine-SiO 2 nanopartikkelsuspensjonen i fullstendig glial kulturmedium (for behandlede prøver) til hver brønn.
  2. Pipetter cellene for å tillate løsgjøring av nonrapid heftende celler ved utvalgte tidspunkter og samle dem i 2 ml polypropylenrør.
  3. Legg 500 mLav Versene til hver brønn og inkuber platen ved 37 ° C i 5 min, og deretter koble den resterende cellefraksjon og samles hver prøve med de tilsvarende nonadhering cellene i det foregående trinnet.
  4. Sentrifuger prøvene i 3 min ved 300 x g ved romtemperatur.
  5. Resuspender pelleten i 100 pl rennende buffer autoMACS.

9. Farging med CD11b-VioBlue

  1. Tilsett 10 pl av VioBlue-CD11b human / mus-antistoff til 100 ul av cellesuspensjonen (01:11 forhold) i rennende buffer og inkuberes i 10 min ved 4 ° C.
  2. Tilsett 1 ml av buffer og bland cellesuspensjonen.
  3. Sentrifuger hver prøve i 3 min ved 300 x g.
  4. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 100-150 pl av rennende buffer.
  5. Les prøvene til cytometer (lagre prøvene ved 4 ° C mellom de to siste trinnene).
    VIKTIG: før analysere prøvene, fortsett til kompensasjon av overlappende signaler in utslipp spektra observert mellom forskjellige fluorokromer (fluorokromkonjugerte nanopartikler eller antistoffer).

10. Spectral smitte over Kompensasjon

  1. Åpne "Instrumentinnstillinger"-boksen (til stede i alle instrument programmer).
    Merk: Hvis du bruker et annet instrument fra en rapportert i Materialer Table, henvises det til instrumentspesifikke manual for oppkjøps detaljer.
  2. Acquire ubehandlet prøve (uten nanopartikler) ved lav fluidic hastighet (hvis tillatt av instrumentet). I løpet av oppkjøpet, manuelt justere forover og side spredning (FSC og SSC, henholdsvis) ved å regulere spenningen kanaler.
    Merk: Endre SSC og FSC akseskalaer for å best visualisere hele cellen befolkningen i plottet. Et instrument sette mal for hver celle type interesse kan opprettes, lagres og brukes til fremtidige oppkjøp.
  3. Åpne den spesifikke"Region"-fanen i programvaren. Tegne et passende stort område ("gate") langs den ønskede populasjonen.
    Merk: internalisering av nanopartikler induserer en SSC forskyvning av cellene. Dersom porten er for tett begrenset rundt cellepopulasjonen av interesse, vil de innsamlede data sannsynligvis miste en del av cellene som skal påvises.
  4. Bruk to ufargede prøver, en for bruk som blindprøve og en for erstatning mot PI farging (valgfritt), en single-farget prøven med riktig fluorokrom for hver fluorescens kanal for å bli kompensert.
    Merk: Bruk en annen 1,5 ml prøverør for hvert fluorokrom-konjugert antistoff som skal brukes i eksperimentet merking.
  5. Åpne "Kompensasjon kategorien" i "Instrumentinnstillinger"-boksen. Øke eller redusere erstatningen faktor ved kjøp til fluorescens intensiteten i spillover-kanalen er omtrent den samme for fluorokrom positive og negativ befolknings.
  6. Acquire nanopartikkel-behandlet prøvene etter at erstatningen er blitt justert.

Representative Results

Strømningscytometri er et nyttig verktøy for å identifisere og karakterisere forskjellige celler, og det er teknikken for valg å identifisere spesifikke immunceller, slik som monocytter, granulocytter, T-celler, B-celler, naturlige dreperceller (NK), dendrittiske celler (DCS), og andre subpopulasjoner av leukocytter.

I forsøk på å bedre karakter hvite blodceller oppførsel som reaksjon på nanopartikler, utførte vi internalise assays med primære leukocytter isolert fra blod av friske donorer (figurene 1 og 2) og med human monocytt-cellelinje (THP-1-celler, Fig. 3) .

Som rapportert i figur 1A, ble de tre store blod leukocytter subpopulasjoner klart identifisert ved forover og side spredning etter PBMCs isolasjon. Dessuten, etter FITC-SiO 2 behandling, lymfocytter (grå), monocytter (blå) og granulocytter (rød) har en annen nanoparticle internalise hastighet som vist med grønn fluorescens intensitet (figur 1B). Den beskrevne protokollen tillater rensing av primær CD14 positive monocytter fra PBMCs. Figur 2A rapporterer flowcytometri prikkplott av CD14 + monocytter i nærvær av FITC-SiO 2. Figur 2B viser FITC-SiO 2 intern kvantifisert i de samme cellene og uttrykt i logaritmisk skala histogram.

Lignende internalise eksperimenter ble utført på THP-1 monocytter som ble behandlet med økende konsentrasjoner av FITC-SiO 2 nanopartikler. Ubehandlede celler ble brukt som negativ kontroll. Figur 3A viser en doseavhengig økning i side-spredning med uendret forover spredning i THP-1 cellelinjen. I figur 3B, sammen med de histogrammer av SSC og FSC ved hver FITC-SiO 2 nanopartikkel-konsentrasjon testes, betyr fluorescens-intensiteten (MFI) kvantifisering er presentert. Disse dataene tyder på at behandling med FITC-SiO 2 nanopartikler induserer en doseavhengig internalisering i monocytter markerte ved forbedring av intracellulær detaljnivå (side spredning) og fluorescens (grønn kanal).

For å få ytterligere innsikt i den type samhandling mellom immunceller og nanopartikler, ble primær blandede glial kulturer isolert og mikroglia, det sentrale nervesystemet bosatt immunceller, ble renset. Bruken av en transgen musemodell som uttrykker grønt fluorescerende microglia tillater visualisering av forskjellige nevro-inflammatoriske mekanismer. Den transgene mus B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J brukes i dette arbeidet uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av CX3CR1 promoter 12. Etter 7 dager in vitro (DIV), viser fluorescensmikroskopi en blandet primær glial kultur med et stort antall astrocytter (GFP negative vedheftende cellee) og noen grønne celler (GFP positive, figur 5A). I denne musemodellen kan tre glial subpopulasjoner skilles ved strømningscytometri med et enkelt CD11b-antistoffarging: den første CD11b - GFP - (astrocytter og andre gliacellene), en andre distinkt gruppe av mikrogliale CD11b + GFP +-celler, og en tredje CD11b + GFP - undergruppe (Figur 4A). Disse to sistnevnte subpopulasjoner er begge i stand til å internalnanopartikler med en svak økning i virkningsgrad ved GFP + populasjonen (som representerer patruljer umodne microglia ved transkripsjon av CX3CR1 promoter), som vist ved strømningscytometri-analyse (figur 4B). Det oppsto internalise kan videre bekreftes ved konfokal mikroskopi ved bruk av den samme endelige konsentrasjon av Rhodamine-SiO 2 nanopartikler, som vist på figur 5B.


Figur 1. FITC-SiO 2 nanopartikkel intern i isolerte blod leukocytter. A) Representant termin spredning (FSC) versus side spredning (SSC) flowcytometri prikkplott av Ficoll-Paque isolerte blod leukocytter. B) Grønn fluorescens overlegg histogram tomt på de tre store blodleukocytt cellepopulasjoner i nærvær av en nM FITC-SiO 2 nanopartikler (45 mV) for en hr. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2
2 nanopartikkel intern i CD14 + rensede monocytter. A) Representant fremover spredning (FSC) versus side spredning (SSC) flowcytometri prikkplott av renset CD14 positive monocytter. B) Grønn fluorescens histogram tomt på den rensede monocytter undergruppe i nærvær av 1nm FITC-SiO 2 nanopartikler (45 mV) for en hr. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Effekter av FITC-SiO 2 nanopartikkel intern på THP-1 celler. A) Representant termin spredning (FSC) versus side scattering (SSC) flowcytometri prikkplott av THP-1 monocyte cellelinje, etter en time eksponering av FITC-SiO 2 nanopartikler økende konsentrasjon. B) konsentrasjonsavhengig variasjon av side spredning (SSC), frem spredning (FSC) og grønn fluorescens i nærvær av FITC-SiO 2 nanopartikler (45 mV) for en hr. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Rhodamin-SiO 2 nanopartikkel intern inn i primær mikroglia isolert fra B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J mus. A) grønt fluorescerende protein (GFP) versus CD11b-VioBlue flowcytometri prikkplott av primary blandet gliaceller isolert fra B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J mus. CD11b + GFP + og CD11b + GFP - populasjoner er vist i øvre høyre og nedre høyre kvadrant, henholdsvis B) Rød fluorescens overlegg histogram tomt på microglia subpopulasjoner i nærvær av en nM Rhodamin-SiO 2 nanopartikler (45 mV) for 30. min (rød histogram) versus kontroll (grå histogram). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Visualisering av GFP +-microglia. (A) Fluorescensmikroskopi på 7 DIV og (B) Konfokalmikroskopiav Rhodamine-SiO 2 nanopartikkel intern (røde piler) i GFP +-microglia. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den eksperimentelle protokollen presenterer svært viktige poeng for å bli tatt i betraktning. Det er veldig viktig å jobbe ved 4 ° C (på isen) og muligens i mørket under alle flekker trinnene, fordi høyere temperatur og lys kan negativt påvirke farging yield. Nanopartikler kan bli sonikert for å bli bedre resuspendert like før bruk.

En riktig strømningscytometri-analyse krever en korrekt kalibrering i de forskjellige kanaler. Kalibrering av instrumentet bør utføres før hver eksperimentell økt. Foruten tekniske problemer med instrumentering, kan det også være problemer med antistoff merking. Det er obligatorisk å benytte antistoff i en passende konsentrasjon. Hvis konsentrasjonen er for høy eller for lav, kan dissatisfying signalintensitetene være konsekvensen.

Ulempene med denne teknikken bekymring behovet for å jobbe med monodisperse prøver, manglende evne lokalisereopprinnelsesstedet på signalet (dvs. forskjellige cellene). Det er også noen begrensninger i valg av fluorokromer som skal brukes i kombinasjon: bølgelengden til eksitasjon og emisjonsbånd må være tilstrekkelig adskilt for å tillate deres aktuelle måling. Dersom de benyttes antistoff spektra overlapper hverandre, er en korrekt kompensasjon nødvendig.

Strømningscytometri er en kraftig metode for celle-analyse i nærvær eller fravær av nanopartikler. Denne teknikk tillater en multiparametric studie av en celle, et høyt antall hendelser undersøkt, hurtigheten i analysen (mer enn 1000 celler / sek), reproduserbarhet og statistiske målinger. Prøver kan bli behandlet uten at celle-levedyktighet.

Ved hjelp av fluorescensmerkede nanopartikler er det mulig å kvalifisere og kvantifisere deres internalisering i celle subpopulasjoner, som er identifisert ved spesifikke markører eksponert på cellemembranen. Celleparametre kan endre seg i nærvær av s Pecific nanopartikler. Avhengig av målet for undersøkelser, kan disse variasjoner bli brukt for å identifisere et bestemt fenomen, slik som side-spredning av celler som øker proporsjonalt med den økende nanopartikkel internalise hastighet.

Nanopartikkel-induserte modifikasjoner av celleoverflate kan også representere en begrensning av teknikken. Av denne grunn må cellemembranreseptorer omsetningen blir alltid tas i betraktning, og eventuelt er kjent på forhånd for å karakterisere nøyaktig cellepopulasjonen av interesse. Ekstreme nedskrivninger av membran osmose i nanopartikkel belastet prøvene kan føre til celledød.

Nanomaterial doseavhengige toksisitet bør empirisk testet for hver cellepopulasjon. Klart definerte døde celler må utelukkes fra fluorescens kvantifisering. For eksempel er Annexin V / PI farging av en av flere metoder som vanligvis brukes til å detektere både nekrotiske og apoptotiske celler.

"> GFP-uttrykke primære celler er også et kraftig verktøy for å velge en bestemt celle undergruppe og samle data uten prelabeling. Kombinasjonen med komplementære fluorescerende nanopartikler gir en meget rask og presis kvantifisering av celle-nanopartikkel interaksjon. Drug eller genet levering er antatt å bli forbedret i fremtiden ved anvendelse av nanopartiklene i stand til å frigi en bestemt medikamentbelastning til utvalgte vev.

Ansettelse av nanopartikler som bestemte leverings bærere og / eller immun modulatorer for farmasi krever kunnskap om det biologiske miljøet (dvs. gjennom flowcytometri) for å studere celle-nanopartikkel interaksjoner.

Disclosures

Forfatterne hevder at Miltenyi Biotech GmbH har sponset innlevering av dette manuskriptet. HiQ-Nano Company ( http://www.hiq-nano.com/index.html ) er en nanoteknologi spin off selskap oppstått fra IIT.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia.
Forfatterne ønsker å takke Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Tyskland) for sponsing av dette manuskriptet, Dr. Paolo Petrucciani (Department of Immuno-hematologi og transfusjonstjenesten, sykehus Lotti Pontedera, Pisa, Italia) for å gi menneske buffy coats og Prof Massimo Pasqualetti (Institutt for biologi - Enhet for Cellular and Developmental Biology, University of Pisa, Pisa, Italia) for boliger musekoloni.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS Gibco 14170-088 Warm in 37 °C water bath before use
RPMI-1640 (ATCC Modified) Gibco A10491-01 Warm in 37 °C water bath before use
DMEM, High Glucose, phenol red Gibco 41966-029
Penicillin-Streptomycin, Liquid Gibco 15140-122
Gentamycin Gibco 15710-049
Horse Serum (lot n° 1131917) Gibco 16050-122
β-mercaptoethanol Gibco 21985-023
Trypsin 2.5% Gibco 15090-046
Human Pooled Serum Invitrogen 34005100
Versene Invitrogen 15040-033
DNAse I Sigma Aldrich D5025-150KU
CD11b-VioBlue human & mouse Miltenyi Biotec 130-097-336
MACS BSA Stock Solution  Miltenyi Biotec 130-091-376
autoMACS Rinsing Solution  Miltenyi Biotec 130-091-222
Running buffer Miltenyi Biotec 130-092-747
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Human Pan monocyte isolation kit  Miltenyi Biotec 130-096-537
Whole Blood Column Kit Miltenyi Biotec 130-093-545
Whole Blood CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-090-879
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
Red Blood Cell Lysis Solution  Miltenyi Biotec 130-094-183
Preseparation Filters 30 µm Miltenyi Biotec 130-041-407
MACSQuant Analyzer flow cytometer Miltenyi Biotec 130-092-197
MACSQuant Calibration Beads Miltenyi Biotec 130-093-607
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare GEH17544202
FITC-SiO2 nanoparticles (50 nm, +45 mV) HiQ-Nano Company
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50 nm, +45 mV) HiQ-Nano Company
12-well plate Falcon Becton Dickinson 353043

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, X. Q., et al. Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).
  2. Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles. Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).
  3. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Immunological properties of engineered nanomaterials. Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).
  5. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
  6. Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462, 449-460 (2009).
  7. Bertero, A., et al. Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia. Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).
  8. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays. Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).
  9. Malvindi, M. A., et al. SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing. Nanoscale. 4, 486-495 (2012).
  10. Bardi, G. SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery. Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).
  11. Bardi, G., et al. The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance. Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).
  12. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics