基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製

Biology

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Summary

体外培養系では 、脊椎動物の筋形成の理解に不可欠であることが分かっている。しかし、多くの、特に基底の分類群において、非哺乳動物の骨格筋の発達と成長について学んだことを残る。この組織を、筋原性前駆細胞(MPCは)の成体幹細胞を単離すること、及び初代培養の設定におけるそれらの自己再生、増殖、および分化を維持するための効率的かつ堅牢なプロトコルは、全体にわたって保存された発散の調節機構の同定を可能脊椎動物の系統。

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Froehlich, J. M., Seiliez, I., Gabillard, J. C., Biga, P. R. Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages. J. Vis. Exp. (86), e51354, doi:10.3791/51354 (2014).

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Abstract

により生体内での筋原性プログラムを研究に関わる固有の難しさと時間に、骨格筋の常駐成体幹細胞由来の初代培養系では、筋原性前駆細胞(MPCは)、哺乳動物の骨格筋の発達の理解に不可欠な証明されています成長。特に脊椎動物の基底分類群のうちしかしながら、データは自己再生、増殖、および分化のMPCを制御する分子機構を説明限られている。特に興味深いのは、付属肢の損失( すなわち有尾両生類)以下のかなりのpostlarvalの骨格筋線維の過形成( すなわち硬骨魚)とフル再生を受ける基礎脊椎動物の能力の基礎となる潜在的なメカニズムがあります。さらに、培養された筋芽細胞の使用は、再生と筋原性プログラムの要約と、それらの間の違いの理解を助けることができます。へこのため、我々は詳細に堅牢で効率的なプロトコルを記述(および変形文献)より始まる、筋原性プログラムの進化を理解するためのプラットフォームとして、細胞培養で、MPCはおよびその子孫、筋芽細胞と未熟筋管を分離し、維持するための基礎脊椎動物。ゼブラフィッシュ( ゼブラフィッシュ )のモデル生物の状況を活かし、我々は、コイ科クレードDanioninaeの小さな魚に、このプロトコルの適用について報告する。タンデムに、このプロトコルは、メキシコアホロートル(Ambystomamexicanum)、さらに実験用げっ歯類からのMPCを単離することにより、より広い比較アプローチを実現するために利用することができる。このプロトコルは、現在広くニジマス、サケ、鯛1-4を含むいくつかの魚種で筋形成を研究で使用されています。

Introduction

哺乳動物の筋形成のかなりの理解がC2C12 5、両方の初代マウス( ハツカネズミ )筋芽細胞培養物と十分に記載されたマウス由来の細胞系において、このプロセスの要約を介して得られている。 1950 6年以降、これらの培養物をmurinemyogenicプログラムの理解に多くの進歩につながったと、ひいては、他の脊椎動物における筋形成している。さらに、単一細胞線維外植技術は、衛星細胞と周囲の筋線維7-9間の相互作用の理解を増加している。細胞培養はされて筋形成の調査のために特に魅力的なため、短時間に前駆体から分化した細胞10、RNAiのためのトランスフェクションが比較的容易にin vivoでの移植18〜20、さらにはCOMPに続く11月14日 、トランスジェニック15,16および過剰発現の研究14,17,18、in vitroで拡大分類群21,22の両端筋原性前駆細胞およびそれらの調節剤のアリソン。培養系の人工的な環境に起因する差異が5,23を説明してきたが、これらのin vitro系が多核体の形成を支配する複雑なプログラムの我々の切開に不可欠であることが証明された、最終分化myofibersfromはmyosatelliteとして知られている増殖性前駆細胞を単核哺乳類の中で細胞(MSC)。

哺乳綱の外では、しかし、筋形成を制御するメカニズムの保全、および/ ​​または発散はあまり大きく起因様々な分類群から筋原性前駆細胞(MPCは)と筋芽細胞を培養することが困難であるため、理解されている。確かに、一次筋芽細胞培養は、唯一の3鳥24〜26、1爬虫類27、いくつかの両生類28〜30、およびいくつかの魚1,3,4,31-33に記載されている。 VEのからの連続筋原細胞株げっ歯類34-36以外rtebratesは、日本ウズラ(Cortunixジャポニカ )に由来している唯一の非哺乳類筋原細胞株と、QM7 37さらに稀である。不死で多くの試みにもかかわらず、硬骨魚筋原細胞株は、とらえどころのないまま、これらの細胞の効率的なトランスフェクションのためのプロトコルでのみ、今年15出版された。このように、脊椎動物の様々な一次のMPCと筋芽細胞を培養するための明確かつ十分に最適化されたプロトコルは、非常に多く、さらに筋原性プログラムの進化の我々の知識を拡大するだけでなく、ブレークスルーを作るために比較生理学の力を利用するために必要とされるヒト骨格筋疾患および障害の治療。

文学は、MPC /筋芽細胞の分離38-49の多くのレポートが含まれていますが、それは著者が簡単な、しばしば不完全で、フォーマットのようなアイソレーションのためのプロトコルを記述するのが一般的である。さらに、最も有益なプロトコルレポRTEDマウス50-53のために開発されており、これらのいくつかは、これらのプロトコルが使用不能または筋肉生物によって利用される非実用奥非げっ歯類種作り、抗体選択54,55または蛍光トランスジーン56,57に依存している。魚類、両生類、および爬虫類の筋形成についてはほとんど知られて、詳細かつ徹底したプロトコルは、視聴覚ガイダンスと遠縁種で実証効率で説明し、フィールドに最も参考になる。

まず1989年58パウエルらによって記載され、以下のプロトコルを最初に(つまり、ニジマス、 ニジマスサケ 、および大西洋サケ、 サルモ·サラル )サケ科魚類および一部の大きなコイ科( すなわち金魚、Carassiusauratusauratus)からのMPCおよび筋芽細胞を分離するために開発されました。 2000年には、FauconneauとPaboeufはニジマス59、およびminoroptimizationsミリアンペアのための一次筋芽細胞文化を最適化Danioninaeクレード (ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュ 、そして巨大なゼブラ、Devario aequipinnatus)はゼブラフィッシュの仕事のために利用できる多くの遺伝的なツールへの32、したがって、その近親者のいくつかの小さなミノーでの利用可能なそのプロトコルデ。硬骨魚は、(少なくともほとんどの種で)その発散成長戦略への研究のための魅力的な生物である。大規模なサケは、ほとんどの魚のように、さらに古い時代60〜62で、満期時に漸近線によってとらわれない成長の可能性と、不定成長する。このような巨大なゼブラ63と硬骨魚の典型的な髭ゼブラ表示の成長ポテンシャルとしてゼブラフィッシュとは異なり、大danionins、MPC細胞運命選択は肥大に対する骨格筋過形成の役割を果たしているかどうかを理解するための理想的なプラットフォームの直接の並置を作る。

同様に、我々は、比較的高い細胞収率およびviabで、このプロトコルは、マウスおよびアホロートルで使用できることを実証したility指数。このようなメキシコアホロートル(Ambystomamexicanum)などの有尾サンショウウオは、全体の手足や尾64-66を含む組織を再生させる驚くべき能力を持っている。この特性は、骨格筋萎縮や老化のこれらの両生類興味深いモデルになります。このような研究のためのより広い比較コンテキストを提供する、多くの魚種で行われているように、以下に記載されるプロトコルを使用して、類似のアプローチを行うことができる。多くの真の比較生物学者は理解ようにデータ(ここでは、全体の脊椎動物系統)広いスペクトル内で分析される場合、基礎生物学および翻訳生物医学における最も意味のある進歩を行うことができる。

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Protocol

倫理に関する声明:本明細書中に記載の脊椎動物を含むすべての実験はバーミンガムのアラバマ大学の制度的動物実験委員会が事前に承認され、実験動物福祉局によって確立されたガイドラインと一致しているし、米国の国立衛生研究所保健社会福祉省。

文化1。準備

  1. 9のNaHCO 3(2 1L当たり1.51グラム)を、DMEM中の20のHEPES(2 1L当たり9.53グラム)(; 2 1L当たり26.96グラム13.48グラム/ L)を次のように基本培地を準備します。
    1. pHを測定し、HClまたはNaOHで7.40に調整します。
    2. 浸透圧を決定し、(必要な場合)のNaClで〜300ミリオスモルに調整します。
    3. フィルタは、最大2〜3ヶ月間、光から保護し、4℃で、(2)1 L真空滅菌システムおよびストアを使用して滅菌する。
      注:完全な試薬について表1表2を参照して、ツール、consumABLES、および機器情報。
  2. 超純滅菌水50ml中のγ線を照射したポリ-L-リシン(平均> 300,000分子量)5mgを溶解することにより、ポリ-L-リジン処理プレートを調製する。リジンのポリマーの完全な溶解を確実に室温で10分間、反転により穏やかに混合する。
  3. プレートタイプ( 表3)によれば、各ウェルにポリ-L-リジン溶液の必要量をピペット。プレートを5分間層流フード内に放置する。
  4. 次に、ポリ-L-リジン溶液を除去し、滅菌水で2回洗浄する。 20分間層流フード内で空気乾燥にプレートを許可します。
  5. ラミニン1mgの(エンゲルブレス - ホルム - スウォーム起点)を入手し、20μgの/ mlの最終濃度になるように基礎培地50mlに溶解する。個/ cm 2で2μgのポリ-L-リジン処理した細胞培養プレートにラミニン溶液を適用する。 (異なるプレートサイズについては表3を参照されたい)
  6. 優しくFUを確保するためのソリューションを旋回カバレッジ良くLL。 24時間インキュベーターに実験室のテープと場所でプレートをシール。インキュベーターは、使用される種にとって適切な温度( 表7参照)に設定する必要があり、追加のガスは、インキュベーターに添加する必要はない。
    注:ラミニンは細胞を播種前に24時間プレートに付着させなければなりません。そうしないと、無細胞接着が悪いことになります。
  7. 表4で説明したように、メディアを準備します。完全培地を最大限に活用の日を準備する。
  8. 組織分離のための準備として、以下の項目オートクレーブを組み立てる:300〜500ミリリットルビーカー(S);ガラスペトリ皿;メスのハンドル;鉗子(微調整と粗);解剖はさみ;と撥水性オートクレーブ紙数枚。
    注:解剖プロセスを支援するユーザー毎に、(2)、メスハンドル、(1)鉗子(タイプは個人的な好みに応じて)、(1)解剖はさみ、および撥水性オートクレーブ紙の(5-10)シートがあります十分。
  9. 上記のオートクレーブ処理項目に加えて、70%エタノール、重量バランス、無菌の50mlコニカルチューブ(番号は培養物のサイズに依存する)、及び氷を組み立てる。

2。組織切開

  1. 開始前に、魚の十分な在庫があることを確認してください。
    注:使用される魚の年齢は非常に重要である。 2つの異なる種の魚が同じような重みのかもしれないが、1種の若い魚が別の種の古い魚よりも多くのMPCを有することになる。原則、サケ科と協力し、特に若い魚として、最高です。 (15グラムまで)、年齢のサケ科魚類4〜6ヶ月歳以下が最適である一方danioninsについては、1年と同じくらい古い魚は、最適に利用することができます。
  2. 解剖される組織の各5グラム、滅菌した50mlコニカルチューブに分離培地の一定量25ミリリットルのため。
  3. 、レコードの質量、個数管(群)を秤量する。氷の上にチューブを置きます。
  4. 2月3日の魚を安楽死させる> 300 mg / Lの重炭酸ナトリウム緩衝化トリカインメタンの浸漬することにより、一度に。 > 5分間停止した後、30秒間(滅菌ビーカーに含まれている)を70%エタノールに魚を沈めるためにふたの移動を可能にする。
  5. 70%エタノールから魚を外し、撥水オートクレーブ紙の上に置きます。直接鰓蓋の後ろに、表面的な浅い切開を行うために、メスを使用しています。上記の切開で皮膚をつかんでスケールや皮膚を除去し、魚の尾に向かって引っ張る。
  6. 皮膚を除去した後、分離媒体に軸上の、両側から魚の急速解糖「白」の筋(横ラインの近くに位置し、スロー酸化「赤」の筋肉を回避する)と場所を切り出す。機関が必要に応じて、魚の残りを捨てる。
    注:それは赤筋に起因する培養のMPCに完全に可能ですが、硬骨魚のMPCを使用して、ほぼすべての出版物は、軸上のMから単離した細胞を利用しているyotome。
  7. 筋肉の十分な量が得られるまで繰り返して2.4から2.6を繰り返します。解剖時には、プールされた筋肉組織は細胞生存率を維持するために氷の上に残っていることを確認してください。

3。機械的解離

  1. ガラスペトリ皿に筋肉組織を25ml / 5gを一本のチューブを注ぐ。 2メスを使用すると、付き#10の外科用メスの刃、スラリーまたはピューレの整合性へのミンチ組織と処理します。お互いを過ぎて、メスの刃を引いての「前後」運動が最適です。
    注:組織ホモジナイザーが適切かもしれませんが廃止されていない場合、生細胞の数が劇的に減少します。
  2. 25ミリリットルの血清学的および血清学ピペットピペッターを使用して、スラリー化した組織を除去し、元のコニカルチューブに交換してください。
  3. すべてのチューブ内のすべての組織が機械的に分離されるまで繰り返して3.1から3.2を繰り返します。
  4. 300×gで5分、10℃で遠心組織
  5. Foll遠心分離により、25ミリリットルの血清学的ピペット、真空吸引器、または慎重にデカンテーションによりとともに培養上清の25ミリリットルを廃棄する。
  6. 各チューブ、再懸濁組織に洗浄培地25mlを追加し、上記のようにrecentrifuge。
  7. 上澄みを毎回削除、洗浄培地で2回洗浄します。

4。酵素的解離

  1. ステップ3.4の間に、IV型コラゲナーゼの0.22グラムとベース媒体(または0.11 g/0.22 mlで十分な量)の44ミリリットルを組み合わせることにより、コラゲナーゼ溶液を調製する。
  2. 4℃で10〜15分間ビーカー中で撹拌するフィルタ50 mlシリンジ及び0.45μmのシリンジフィルターを用いて滅菌する。
    NOTE:複数のシリンジフィルターコラゲナーゼ調製物に応じて、必要とされ得る。ワーシントン生化学以外のベンダーから取得したコラゲナーゼは、濾過中に、より困難を伴います。コラゲナーゼは、筋内膜を構成するコラーゲンペプチド結合を解離するために使用される。この消化は筋線維の防護壁を削除します。
  3. 筋肉組織の各グラムについては、0.2%コラゲナーゼ溶液中で組織を再懸濁する。筋肉組織5gのために、コラゲナーゼ溶液10mlとベース媒体を15mlを加える。
  4. コラゲナーゼ溶液/基本培地1mlあたりのPSFの10μL( 例えば 25ミリリットルに250μL)を追加します。これは酵素消化の効率に影響を与えるように、組織が十分に中断されていることを確認してください。
  5. 緩やかに揺り動かしながら18℃で60分間コラゲナーゼ中の筋肉組織をインキュベートする。これは細胞生存率に影響を与えるかもしれないが、機械的解離および種の程度に応じて、コラゲナーゼ消化は、90分に延長されてもよい。
  6. 12℃で5分間、300×gでコラゲナーゼ消化、遠心コニカルチューブを、以下の洗浄培地25ml中の上清と再懸濁組織を廃棄します。
  7. Recentrifuge 5分間、300×gで12時6。C.洗浄媒体で2回繰り返します。
  8. 洗濯組織は二回、10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて洗浄媒体や粉砕物の25ミリリットルに再懸濁し、筋肉組織は、組織/中ホモジネートを比較的容易にピペットの内外に通過するまでの後。 5月10日triturationsで十分です。
    1. 5ミリリットル血清学的ピペットをした後、注射器に取り付け16ゲージの金属カニューレを繰り返します。
  9. 12℃で5分間300×gで遠心分離コニカルチューブ上清をデカント。
  10. 上記の5分間の遠心分離中に、基本培地5mlのトリプシン0.25gのを組み合わせることによりトリプシン消化溶液を調製する。
  11. 10〜15分とフィルタ20ミリリットルの注射器と0.45μmのシリンジフィルターで滅菌し、4℃で撹拌する。
  12. コニカルチューブを取り出し、すべてのチューブに筋肉組織のすべての1グラムトリプシン溶液100μlと分離培地の4.9ミリリットルを追加。 EXA用mple、トリプシン溶液500μlと筋肉組織の5グラムに分離培地の24.5ミリリットルを追加。
    注:トリプシンは基底膜から筋原性前駆細胞を分離するセリンプロテアーゼである。
  13. 再懸濁し、トリプシン/解離における組織の媒体だけでなく。 18℃で20分間インキュベートする
  14. 12℃で1分間300×gで最初のトリプシンインキュベーション、遠心コニカルチューブ次
  15. 分離培地の4ボリュームへの上清の1の体積の濃度で分離培地で上清を組み合わせることにより、トリプシンを中和する。第トリプシン消化中、4℃で保存する。
  16. 組織の残りのペレットに、繰り返して、最初のトリプシン消化からの上清/分離媒体とステップ4.15後の上清を組み合わせ、4.12から4.15を繰り返します。
  17. あるいは:コラゲナーゼおよびトリプシン消化物を、細胞収率を最大にするために組み合わせることができる。 <OL>
  18. これを行うには、ホモジネートを簡単にカニューレを通過するまでのコラゲナーゼは20ミリリットルの注射器に取り付けられた金属(長さ6と16ゲージの最高の作品)カニューレを使用してダイジェスト粉砕する。
  19. ホモジネートに、(ステップ4.10で製造)のトリプシン溶液500μlを加え、20分間18℃でインキュベートする。
  20. 12℃で1分間300×gでインキュベーション、遠心分離コニカルチューブを、次の
  21. 分離培地の4ボリュームへの上清の1の体積の濃度で分離培地で上清を組み合わせることにより、トリプシンを中和する。
  22. 第トリプシン消化中、4℃で保存する。
  23. 標準プロトコルと同様に、ステップ4.18に進みます。
  • 300×gで50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に最終的な上澄み液/分離培地混合物を分配 12℃で10分間
  • 細胞を乱さないように注意しながら、上清を取り除くペレット。ピペット各チューブへの完全培地2ml、各細胞ペレットを溶解する。
  • 1の50mlコニカルチューブに完全培地に懸濁した細胞を結合する。
  • 以前に再懸濁された細胞のプールと組み合わせ、完全培地1mlで各チューブを洗浄します。
  • 金属カニューレを粉末化し、5〜10倍の注射器。
  • 完全培地でリンスし、100μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。
  • 40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。
  • 50ミリリットルに十分な完全培地を加え、15℃で10分間300×gで遠心分離
  • 5。カウント、希釈、および細胞の播種

    1. ステップ4.25の最後の遠心分離後、慎重にデカンするか、血清学的ピペットで上清を除去。完全培地5ml中に細胞ペレットを再懸濁する。
    2. 細胞が完全に再懸濁して、20μLを削除; 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ中の細胞懸濁液と場所の。
    3. トリパンブルー色素の5μLを加え、5分間待ちます。血球計数器を用いて、生細胞の数を決定する。
    4. 決定されると、必要な濃度に細胞を希釈する。硬骨魚MPCは最高の1cm 2あたり150,000〜200,000個の細胞で播種する。 6ウェルプレーティング戦略については、1.5×10 6細胞を希釈する-ミリリットルあたり2.0×10 6には 、十分な増殖と分化をサポートしています。
    5. ポリ-L-リジン処理し、ラミニンコートプレートと種細胞を取得します。 (プレート固有の希釈液とめっきボリュームについては、表5を参照してください。)注: 表6は、様々な硬骨魚種から単離された筋組織のグラム当たり単離された細胞の平均数を示している。ニジマス(O.ニジマス )の出品ゼブラフィッシュ(D·フィッシュ実行し、それによって適切な播種用から隔離するために多くの魚が必要とするより、筋組織のグラム当たり少ないのMPC。
    6. 適切な温度で冷却インキュベーター内で実験室のテープと場所でプレートをシール。ここに記載されているすべての種からのMPCは(マウスのために保存)二酸化炭素(CO 2)の補充を行わずに、通常の大気条件下でインキュベートすることができる。 ( 表7を参照してください。)
    7. 代わりに:いくつかの研究室は、MPCは40分間培養基質に付着させるための呼び出しのプロトコルを採用しています。
      1. その後、任意の緩く付着し、非接着細胞を除去するための洗浄メディアでプレートをすすぐ。警告:この手順では、培養基質への他の細胞( 例えば 、線維芽細胞)の「非特異的」接着を避けるために非常に重要です。
      2. インキュベーター内で完全なメディアと場所のセルを追加し、下記のとおりの世話。

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    Representative Results

    二十四時間播種後、筋原前駆細胞(MPCは)ラミニン基層に見える接続する必要があります( 図1aおよび1Dを参照してください)。播種後、細胞(MPCは)この細胞型を示す紡錘状形状( 図1)を採用し、MYOD1 +( 図2)である。 ゼブラの種では、MPCはサケサルモ種からのMPCが何よりも小さいバイポーラプロセスとのよりコンパクトであるように思われる。しかし、文化の4日以上は、試験した全ての魚類の種からのMPCは、同様の形態を採用し、筋芽細胞のようにはっきりと見える( 図1bおよび1E)。完全培地を除去しなければならない、とMPCは、洗浄培地で2回洗浄する必要があります。筋線維芽細胞は、筋原性の文化を汚染し、(筋芽細胞のスピンドル形状に対して)その星様の形態によるのMPC /筋芽細胞から容易に区別することができます。プレートの洗浄を大幅にIこのような線維芽細胞の除去をmproves。

    表7参照)、ここで説明した種では、日々のメディアの変更は、最良の結果を生む。のMPC子孫(筋芽細胞および初期の筋管)の前に新鮮な完全培地の添加に一度か二度洗浄する必要があります。筋芽細胞は決定的な段階(培養のおよそ4日目)に達した後に、あるいは、メディアの変更は、一日おきに低減することができる。筋管(下記参照)2〜3日以内に形成した( 図1Cおよび1F)と( 図2)+ミオゲニンも、特に分化培地で培養する必要があります。数週間から数ヶ月の期間は、いくつかの哺乳動物種で報告されているが、魚類のMPCと筋芽細胞は時間のような期間を許容していないようである。細胞は7日目および文化の9月11日の間その後の分化と、( 図3)培養の最初の6日間、増殖する。その後、細胞は、老化またはpoptose。

    のMPCおよびその子孫の筋原性の性質は、このプロトコルを使用して単離された遺伝子発現に基づいて、3,32,33決定されいる。細胞は日文化の6-9時の未熟筋管を形成するように検出され、急速に増加して、(初代マウス筋芽細胞またはC2C12を利用するシステムと比較した場合)は、哺乳動物培養系とは異なり、MPCはと筋芽細胞の子孫の増殖は、培養の初期日間比較的低いゼブラの32。ニジマスからの報告は(哺乳類の筋芽細胞培養における一般的な、しかし魚類のシステムで必要とされていない)分化培地を利用し、筋管形成33で、予想通りその増殖指数が低下を示している。細胞老化やアポトーシスが発生する前に我々の手では、得られる筋管は、最大9から11日間( ゼブラ種 )と11月13日日( サケ属種 )のために培養中に残ることができる。

    試薬会社(優先V.代替) カタログ番号(優先V.代替) 文化あたりの量
    γ線を照射したポリ-L-リジンシグマアルドリッチ(MPバイオメディカル) P5899(ICN19454405) 5 mgの
    DMEM(高グルコース) シグマアルドリッチ(CELLGRO) MT-50-003-PB(D7777) 2 L
    ラミニン BDバイオサイエンス社(Sigma-Aldrich)を CB-40232(L2020) 1ミリグラム
    重炭酸ナトリウム( 炭酸水素ナトリウム) Fisher Scientific社(Sigma-Aldrich)を BP328-500(S5761) 1.51グラム
    HEPES(C 8 H 18 N 2 O 4 S) Fisher Scientific社(Sigma-Aldrich)を BP310-1(H6147) 9.53グラム
    抗生物質/抗真菌サーモサイエンティフィック(Sigma-Aldrich社) SV3007901(A5955) 17〜20ミリリットル
    硫酸ゲンタマイシンロンザ社(Sigma-Aldrich)を BW17-519Z(G1397) 2〜3ミリリットル
    ドナー馬血清サーモサイエンティフィック(Sigma-Aldrich)を SH3007403(H1270) 75ミリリットル
    ウシ胎児血清サーモサイエンティフィック(Sigma-Aldrich)を SH3007103(F2442) 25ミリリットル
    コラゲナーゼ(タイプIV) ワージントン(Sigma-Aldrich)を LS004189(C9891) 0.44グラム
    トリプシン(膵臓から) MPバイオメディカルズ(Sigma-Aldrich)を ICN15357125(T5266) 1グラム

    表1。優先のメーカーとカタログ番号の詳細な試薬リスト。

    消耗品ツール機器
    細胞培養プレート鉗子(並目) 血清学的ピペッター
    無菌50ミリリットルコニカルチューブ鉗子(ファイン) pH計
    実験室でのテープメスハンドル冷蔵インキュベーター(Echotherm)
    0.2μmの真空滅菌システム手術用メス(#10、#11) 層流フード
    撥水性オートクレーブ紙外科はさみ真空マニホールド
    血清学的ピペットガラスペトリ皿 Microosmolalityメーター
    ルアーロックと12月16日のGカニューレ

    細胞培養に必要な表2。消耗品、工具、および機器。

    版サイズウェルあたりのCM 2 ポリ-L-リジン* ラミニン**
    6ウェル 9.5 1.6ミリリットル 1
    24ウェル 1.9 0.32 0.2
    48ウェル 0.95 0.16 0.1
    96ウェル 0.32 0.06 0.03
    * 0.1 mg / mlの濃度 ** 0.020 mg / mlの濃度

    表3は、ポリ -L-リジンおよびラミニンで細胞培養プレートを被覆するためのボリュームを最適化。

    試薬隔離ウォッシュ解離完全な
    基本培地 419.25ミリリットル 395.40ミリリットル297.00ミリリットル 178.00ミリリットル
    PSF * 5.00ミリリットル 4.00ミリリットル 3.00ミリリットル 2.00ミリリットル
    硫酸ゲンタマイシン** 0.75ミリリットル 0.60ミリリットル - -
    ドナーウマ血清 75.00ミリリットル - - -
    ウシ胎児血清*** - - - 20.00ミリリットル
    * PSF:ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾンカクテル(100X); ** 50 mg / mlの濃度; ***特徴付け

    表4。筋原前駆細胞(MPCは)の単離および培養のための別のメディアの準備。

    <TD> 9.5
    版サイズウェルあたりのCM 2 希釈メッキボリューム
    6ウェル 1.5から2.0×10 6細胞/ ml 1ミリリットル
    24ウェル 1.9 1.5から2.0×10 6細胞/ ml 250μL
    48ウェル 0.95 1.5から2.0×10 6細胞/ ml 150μL
    96ウェル 0.32 1.5から2.0×10 6細胞/ ml 50〜100μL

    表5。細胞培養プレートのウェルの大きさによって希釈液とめっきボリュームを推奨する。

    平均#細胞/ g組織
    ゼブラフィッシュ 640万
    ゼブラダンギラ 1783000
    Devario aequipinnatus 1797000
    ニジマス 66800

    表6の様々な硬骨魚種から筋肉組織の1グラムから分離筋原性前駆細胞の平均数 ゼブラフィッシュ (ゼブラフィッシュ)、Daniodangila(moustacheddanio)、Devario aequipinnatus(ジャイアントダニオ)、およびニジマス (ニジマス)。

    温度
    ゼブラ/ Devario属 26から28℃、
    サケ/サルモ属 10 * - 18℃〜
    Ambystomaメキシコマンネングサ 18℃
    *より低い温度は、より低い増殖速度をサポートしています。

    魚類と両生類の筋原Pについては、表7。推奨インキュベーション温度recursor細胞(MPCは)。

    図1
    図1。2種、ニジマス( ニジマス 、上)とゼブラフィッシュ( ゼブラフィッシュ 、下)からのMPCの代表的な明視野像(左端)、筋芽細胞(中央)、および早期の筋管(右端)。

    図2
    図2。のMPCの代表的な免疫細胞化学的染色(c)、および筋管(B、D)を単離し、巨大ゼブラ(Devario aequipinnatus、上)とニジマス( ニジマス 、下)から培養された。文化では、筋芽細胞はMYOD1 +正(c)は、(:;:NB100-80899、ノーバスバイオマスC-20、サンタクルズゼブラ)市販のMYOD1 +抗体を用いて可視化された。筋芽細胞が分化するにつれてさらに、彼らは(:;:SC-567;サンタクルーズ·バイオテクノロジーの両方からマスM-225ゼブラ)(B、D)は、市販のミオゲニン抗体を用いて可視化されるようにミオゲニン発現する。

    図3
    図3培養における経時的な細胞増殖速度を測定するためにBrdUを用いた代表的な細胞増殖データ。巨人ゼブラ67から単離し、培養のMPCから得られたデータ。

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    Discussion

    筋原プログラムは、いずれの種において試験し、最も簡単にin vitro系を介して研究することができる。確かに、分離の際に、哺乳動物の魚やmyosatellite細胞(MSC)での筋原性前駆細胞(MPCは)容易に増殖、細胞周期の撤退、および端末筋芽細胞の分化と発生期の筋管にそれらの筋芽細胞の融合を含むこの高度に制御されたプロセスに入る。 (ゼブラフィッシュ67とニジマス69の可能性を除いて)魚類種の遺伝子導入遺伝子レポーター株の一般的な不足は、MPC / MSCの活性化、増殖および分化のin vivoでの作業制約ので、ここで紹介するin vitroの系である魚種での研究のための魅力的なプラットフォーム。

    MPC / MSCは関係なく、種の成功文化は無菌性のA)の厳格な注意に大きく依存している。骨格筋tのb)は、完全な機械的解離問題;およびc)酵素消化の最適化。筋肉組織の分離の初期段階の間に、細心の注意は、組織の必要量は汚染なしに切除されていることを保証するために注意する必要があります。これは、魚類(またはそのことについては、利用される任意の動物)が適切に70%エタノール中で十分な時間のために消毒されることが最も重要である。私たちの手では、30秒が最適です。短い期間は、汚染および組織の完全性および細胞生存のより長い、損失をもたらすことができる。エタノール固定液として使用することができますので、注意が解剖前に魚を脱水しないように注意しなければならない。切開は、層流細胞培養フードの外部で実行することができ;しかし、我々は、このプロセスは潜在的な細菌や真菌の汚染を最小限にするために、フード内で行われることをお勧めします。

    上記の機械的解離は、最初は原油および/または退屈に思えるかもしれませんが、それが単離操作に不可欠です。二つの大きな手術用メスの刃、引っ張られ過ぎ(ビデオプロトコルに示されるように)摺動動作の各他方は、最良の結果を生成する。一度終了し、ホモジネートの一貫性がスラリーまたはピューレのものであること、そして簡単にワイドボア血清学的ピペット( つまり 25ミリリットル)で採取する必要があります。単に、より良い機械的解離、MPC / MSC収量とより良い結果の文化が高い。悪い解離は酵素消化を妨げ、細胞収量を減少させるであろう。それは考慮することは魅力的かもしれないが、電気組織ホモジナイザーの使用が飛躍的に少なくとも魚類のMPCで、その明白な利便性にもかかわらず、細胞の生存率を低下させる。

    すべてのプロトコルと同様に、上記で詳述した手順の最適化がしばしば必要である。これは、いくつかのdanionin種と我々の仕事で本当であることが判明した。我々の研究室からの結果は、より小さなdanionins( 例えば 、ゼブラフィッシュ)が大きい種を行う( 例えば GIよりも骨格筋のグラム当たりよりのMPCをもたらすことを示しているAntや髭ゼブラ)。コラゲナーゼ(0.3%)のより高い濃度はより小さな種からの組織で使用される場合は、これだけ実現される。私たちの手では、0.2%の濃度( 例えば 、ニジマス、熾烈なマス[Oncorhynchusclarki]、マスノスケ[Oncorhynchustschawytscha])サケ科の種に適した、より大きなdanionins、アホロートル(Ambystomamexicanum)四肢と尾、さらにはマウスの骨格筋。同様に、ケアは適切なコラゲナーゼを選択するように注意する必要があります。我々の経験では、IV型コラゲナーゼは、骨や筋肉などの繊維組織に推奨コラゲナーゼよりもはるかに優れ、細胞の生存率( すなわち 、コラゲナーゼII型)70を保持ます。消化が短時間でより完全であり得るが、細胞膜受容体の完全性は、おそらく、これらの調製物において増加トリプシン活性によ​​って損なわれる。トリプシンに関しては、私たちの研究室では、常に粗雑なトリプシン準備PURを利用しているむしろ利用可能な「より純粋な」の準備よりも、ブタの膵臓からified。様々な種との我々の文化活動では、様々なトリプシン濃度のほとんど有益な効果に気づいた。

    粉砕して、このプロトコルに重要です。その両方は、骨格筋の繊維マトリックスを解離し、すべての中に手動で筋線維の構造的完全性を破壊するトリプシン消化のために表面積を増大させる。 triturationsを行う場合は、連続的に小さくなるボアピペット·カニューレを使用してカニューレとシリンジすぐにを使用するよりもはるかに簡単です。カニューレとシリンジを用いてtriturationsに直接進むと差し込まれ、カニューレおよび/または細胞に適用される過剰な圧力をもたらすことができる。十分なチュレーションすることなく、トリプシン消化を適用すると、劇的に細胞収量が低下します。

    一旦単離されると、培養プロセスは非常に簡単です。これまでで最も出版物は、プロトコルのウィットを利用している我々自身を含む増殖と分化33,71-75の両方のH 1のメディア;しかし、いくつかのフランス人の研究者によって書かれた最近の記事は、増殖と分化33に別々のベースのメディアおよび血清コンテンツに、2つのメディアプロトコルを記載している。この「新しい」プロトコルは、より密接に早期筋芽細胞の増殖増強するために33に表示され、増殖および/ ​​または細胞の分化を制御することがより適切であるかもしれないマウスMSCおよびmyoblastsandの培養に用いられるものを模倣する。しかし、遺伝子発現の広範な特性決定することなく、そのような「増殖」メディアは、従来の一つのメディア手法よりも多くの「筋芽細胞様」状態を節約するかどうかを結論付けることは困難である。転写物またはタンパク質レベルであれ、遺伝子発現を記載する以前の刊行物は、伝統的なメディアプロトコル3を用いて報告した。代わりに、単一のメディア(DMEM)は、本明細書に記載のウシ胎児血清(FBS)の異なる濃度で補充することができる:10%増殖および分化のための2%。

    哺乳動物細胞培養系を用いた研究者がこれらの細胞の培養のために、二酸化炭素雰囲気を用いに順応することができるが、異なるアプローチのための地上および水生ガス交換呼の間の本質的な差異は、MPCを含む、魚類または水閉じ込め有尾細胞を培養する。及び炭酸水素ナトリウム(NaHCO 3) - :ここで詳述培地ピペラジン由来の、双性イオン性有機化合物[(2 -ヒドロキシエチル)ピペラジン-1 -エタンスルホン酸4 HEPES]でバッファされている。従って、ガス注入によるインキュベータは、これらの細胞の培養に必要または要求されない。培養魚類に必要な温度および有尾のMPCは18〜26℃の間の範囲であり、より重要なことに、そのようなインキュベーターは、かなりの熱も冷却する能力を有するべきさらに、サケ科のMPCは、Cすることができますさらに冷却インキュベーターの必要性を強調し、必要に応じて、より低い温度でultured。さらに、我々は、培養プレートの封止が細胞の生存を維持するために必要であること(以前通信されるように、他の研究を持っている)を発見した。単に標準的な実験用テープで培養蓋とプレートとの間のインターフェースをラップすると、この目標を実現するのに十分である。

    プライマリのMPC / MSCの/筋芽細胞の継代は、哺乳動物細胞培養では一般的ですが、それは、少なくとも後半Mbの段階の前に(培養6日程度)、魚類細胞で可能ではないようです。このため、増殖をサポートするために、実験の目標を達成するの​​に十分な適切な数の細胞は、培養開始時に播種する必要があります。予想より少ない細胞収量が得られた場合、さらに、それが細胞に伝播し、後で子孫をreplateすることは不可能である。我々はextracel上の増加への依存度にこの特性に起因している魚類MPC /筋芽細胞のlularマトリックス(ECM)。あるいは、これは、ラミニン基質のアーチファクトであり、魚類MPC / Mbの増殖および分化のために必要なECM成分の、更なる経験的な決定が保証されることが可能である。私たちは、共同研究者のいくつかが正常に培養基層から後期筋芽細胞(培養〜6日目)を削除し、これらの細胞(JMフレーリッヒとPRビガ、私信)を再プレートしていること、しかし、注意してください。

    このプロトコルまたはそれに類似した1、RT-PCR 3,71-74,76-78、ウエスタンブロット32,79-81が関与する実験、免疫細胞32,33、増殖アッセイ32,33,59、遺伝子導入15、形態計測を用いて、分析78、毒性スクリーニング82、およびクロマチン免疫沈降(ChIPの、JMフレーリッヒとPRビガ、未発表の結果)が行われている。しかし、VIT、追加のさらなる説明ROプロトコル、継代およびクローン増殖に関係する、すなわち、それらは、非常に必要とされている。確かに、ロジャース研究所15は、ニジマスの筋芽細胞のトランスフェクションを誘導するためのプロトコルを最適化することにより、魚類のMPC /筋芽細胞の培養液中で重要な進歩をしました。この方法論に基づいて、RNAiまたは骨格筋​​特異的ターゲットの過剰発現、硬骨魚類の生涯成長軌道に関与していると仮定され、特にを伴うさらなる調査だけでなく、可能であるが、水産養殖および生物医学分野における重要な進歩につながる可能性科学の。

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    Disclosures

    開示することは何もありません。

    Acknowledgments

    著者は、博士に感謝を申し上げます。小さな魚や両生類にこの培養プロトコルの開発と応用での専門知識のためのジョセップPlanasは、フアンカスティーヨ。おかげで、原因疲れを知らずにマシューは、Delciクリステンセン、ザカリー·ファウラー、ブルック·フランツェン、ネイサンフレーリッヒ、キラマーシャルの充電など、多くの魚(種内および数の両方)からの筋組織の切開および解離を支援してきた無数の個人にもあるベン·メイヤー、イーサンRemily、およびSinibaldoロメロ。この作品は、PRBにセンタープロテアーゼ研究所NIHのグラント#2P20 RR015566、NIHのグラントNIAMS#R03AR055350とノシュアドバンスFORWARDためのNSFグラント#HRD-0811239、生物スタートアップ資金のバーミンガム学科のアラバマ大学によってサポートされていました。サポートもUABの栄養肥満研究センター賞#P30DK056336、NIH NIDDKによって提供された。 その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもないNIHの公式見解を表しています。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table 1. Detailed Reagent Information
    Reagent Company (Preferred v. Alternate) Catalog Number (Preferred v. Alternate) Quantity per Culture
    γ-irradiated poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8H18N2O4S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiotic/Antimycotic Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 mL
    Gentamicin Sulfate Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 mL
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mL
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mL
    Collagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Trypsin (from Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g
    Table 2. Consumables, Tools and Equipment
    Consumable Tools Equipment
    Cell Culture Plates Forceps (Coarse) Serological Pipettor
    Sterile 50 mL Conical Tubes Forceps (Fine) pH Meter
    Laboratory Tape Scalpel Handles Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 μm Vacuum Sterilization Systems Scalpel Blades (#10, #11) Laminar Flow Hood
    Water-repellant Autoclave Paper Surgical Scissors Vacuum Manifold
    Serological Pipettes Glass Petri Dishes Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas with Luer Locks
    Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
    Plate Size cm^2 per Well Poly-L-lysine* Laminin**
    6 well 9.5 1.6 mL 1
    24 well 1.9 0.32 0.2
    48 well 0.95 0.16 0.1
    96 well 0.32 0.06 0.03
    *0.1 mg/mL concentration ** 0.020 mg/mL concentration
    Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
    Reagent Isolation Wash Dissociation
    Base Medium 419.25 mL 395.40 mL 297.00 mL
    Gentamicin Sulfate** 0.75 mL 0.60 mL -
    Donor Equine Serum 75.00 mL - -
    Fetal Bovine Serum*** - - -
    * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
    Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
    Plate Size cm^2 per Well Dilution Plating Volume
    6 well 9.5 1.5-2.0x10^6 cells/mL 1 mL
    24 well 1.9 1.5-2.0x10^6 cells/mL 250 μL
    48 well 0.95 1.5-2.0x10^6 cells/mL 150 μL
    96 well 0.32 1.5-2.0x10^6 cells/mL 50-100 μL
    Table 6. Average number of cells per g tissue
    Species Average # cells/g tissue
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800
    Table 7. Recommended Incubation Temperatures
    Species Temperature
    Danio/ Devario spp. 26 - 28 °C
    Oncorhynchus/Salmo spp. 10* - 18 °C
    Ambystoma mexicanum 18°C
    * Lower temperatures support lower proliferation rates.

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