Um protocolo para hepatite C Analisando replicação de vírus

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Immunology and Infection

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Ren, S., Contreras, D., Arumugaswami, V. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (88), e51362, doi:10.3791/51362 (2014).

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Abstract

Vírus da Hepatite C (HCV) afeta 3% da população mundial e causa graves doenças do fígado, incluindo hepatite crônica, cirrose e carcinoma hepatocelular. O HCV é um vírus de ARN encapsulado pertencente à família Flaviviridae. O tratamento atual não é totalmente eficaz e causa efeitos colaterais adversos. Não há vacina HCV disponível. Assim, é necessário um esforço continuado para o desenvolvimento de uma vacina e terapia melhor. Um sistema de cultura de células de VHC é fundamental para o estudo de vários estágios de crescimento de HCV, incluindo a entrada do vírus, a replicação do genoma, as embalagens, e de saída. No processo agora apresentado, foi utilizado um vírus de tipo selvagem intragenotype 2a quimérico, FNX-HCV, e um vírus FNX-Rluc recombinante portador de um gene repórter de luciferase de Renilla para estudar a replicação do vírus. Uma linha de células de hepatoma humano (Huh-7 com base) foi utilizado para a transfecção in vitro do transcrito ARN genómico de HCV. Os sobrenadantes de cultura isentos de células, lisados ​​de proteína e tRNA otal foram colhidas em vários pontos de tempo pós-transfecção para avaliar o crescimento HCV. Estado de replicação do genoma do HCV foi avaliada por RT-PCR quantitativo e visualizar a presença de ARN de HCV de cadeia dupla. A expressão da proteína do VHC foi verificada por imunofluorescência blot e ensaios de Western utilizando anticorpos específicos para as proteínas do HCV NS3 e NS5A. RNA de HCV de células transfectadas divulgados partículas infecciosas em cultura sobrenadante e o título virai foi medido. Os ensaios de luciferase, foram utilizados para avaliar o nível de replicação e infecciosidade de HCV repórter. Em conclusão, nós apresentamos vários ensaios virológicos para caracterizar diferentes estágios do ciclo de replicação do HCV.

Introduction

Vírus da hepatite C (HCV) causa cirrose e câncer de fígado. Ela afeta 170 milhões de pessoas em todo o mundo, com 350.000 pessoas morrem anualmente 1-3. O HCV é um vírus de cadeia positiva de ARN com um tamanho de genoma de 9,6 kb. O genoma do HCV é traduzido como uma única poliproteína de ~ 3000 resíduos de aminoácidos que é clivada proteoliticamente por diversas proteases celulares e virais em 10 polipéptidos. O HCV é o vírus protótipo do género Hepacivirus e pertence à família Flaviviridae 4. Após a exposição, o HCV estabelece a infecção crónica em 80% dos indivíduos. A infecção é geralmente assintomática e oportuna diagnóstico pode permitir a intervenção terapêutica para evitar a deterioração do fígado. O tratamento atual é de qualidade inferior e nenhuma vacina está disponível 5,6.

A etiologia da hepatite C foi descrita pela primeira vez em 1989 7. Estudar a replicação do HCV é importante para a vacina contra a hepatite C e pesquisa de tratamento, mas que tinha sidolongo dificultada pela falta de um sistema de cultura de vírus eficiente. Um clone molecular de HCV foi demonstrado ser infeccioso em chimpanzés mediante inoculação intra-8. Subsequentemente, os replicões de HCV sub-genómicos foram descritas, o que permitiu a dissecar a fase de replicação do genoma viral em um sistema de cultura de células de 9,10. Descoberta de um VHC genótipo 2a isolar JFH-1 (Japanese fulminante da hepatite-1), capaz de infectar cultura de células abriu novos caminhos para a pesquisa a replicação do HCV 11-13. Genótipo 2a tensão JFH-1 baseada vírus quiméricos inter-e intra-genotípicas e do genótipo 1 do HCV sistemas de cultura infecciosas base também estão disponíveis 14-18.

Temos utilizado com sucesso JFH-1 tensão e HCV intragenotype 2a vírus quimérico para obter o mapa de alta resolução de perfil funcional de domínios de proteínas e cis-atuantes elementos de RNA 19,20. De acordo com isto, aqui descrevemos um sistema de cultura eficaz utilizado rotineiramente que permiteestudando várias fases do ciclo de replicação do HCV e interação patógeno-hospedeiro. Apresentamos ensaios virológicos para avaliar replicação do genoma viral e infectividade de novo de intragenotype 2a HCV e HCV repórter baseado Renilla luciferase.

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Protocol

Um esboço geral do protocolo é ilustrada na Figura 1.

1. Células

  1. Preparar o meio de crescimento completo, que contém 10-15% de soro fetal bovino (FBS), 10 mM de aminoácidos não essenciais, 10 mM de Hepes, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml), e 2 mM de L-glutamina.
  2. Manter Huh-7.5.1 células 13 em meios de cultura completos contendo os suplementos acima para análise in vitro do ciclo de replicação viral da hepatite C.
  3. Culturas estirpes virais em células Huh-7.5.1 com o meio de crescimento suplementado especificado a 37 ° C com 5% de CO 2.

2. Vírus e plasmídeos As construções

  1. Gerar a forma complementar de ADN (ADNc) do ARN de HCV e cloná-lo num vector de plasmídeo para a facilidade da manipulação genética. Nota: A descoberta da hepatite fulminante japonês 1, JFH-1 (genótipo 2a HCV), isolar tem sido fundamental para a pesquisa de HCV e éusado principalmente para estudar o ciclo de replicação do HCV 11-13. Vírus quiméricos inter e intragenotypic baseados em JFH-1 HCV são comumente usados ​​em pesquisas 14-18. Construção de intragenotype 2a sintético vírus quimérico, FNX-HCV, e uma cepa repórter quimérico monocistrónicas foi descrito anteriormente 19 e construção detalhes estão fora do âmbito do presente protocolo.
  2. Use o pFNX-HCV vírus intragenotype 2a vez que contém um 5 'NTR, regiões e p7 estruturais e parte das regiões não-estruturais NS2 (nucleotídeos 1-2878) da J6CF cepa parental (NCBI adesão não. AF177036), como bem como os componentes não estruturais do vírus da estirpe JFH-1 (n ° de acesso NCBI. AB047639). Nota: FNX-HCV foi sintetizado com base na seqüência de Jc1 intragenotype 2a HCV quimérico relatado anteriormente 15.
  3. Gerar um construto quimérico monocistrónicas repórter viral, o pFNX-Rluc, com base na estirpe pFNX-HCV (anteriormente no passo 2.2) através da inserção de um Rdo gene da luciferase enilla entre a NTR 5 'e o gene núcleo (entre 388 e 389 nt). Posteriormente, ligar o gene da luciferase e gene núcleo dessa construção usando uma 2A vírus da febre aftosa (F2A) sequência peptídica, que funcionaria como um sinal de clivagem.
  4. Engenheiro da construção viral RNA polimerase-null (Pol-) usando o pFNX-HCV ou o fundo viral pFNX-Rluc. Substitua os resíduos catalíticos NS5B polimerase, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), de qualquer um desses backbones virais com resíduos de ácido amino AAG.

3. In Vitro HCV RNA Transcrição

  1. Use uma intragenotype 2a vírus quimérico FNX-VHC e FNX-HCV Pol nula (Pol-) HCV para avaliação da replicação viral (Figura 2A).
  2. Linearizar os plasmídeos virais com a enzima de restrição Xbal e, em seguida, tratar com nuclease de feijão mung para produzir extremidades cegas. Purificar os plasmídeos digeridos por cromatografia de troca aniônica. Verifique a integridade of o plasmídeo linearizado submetendo ADN de electroforese em gel de agarose (Figura 2B).
  3. Transcrever os plasmídeos linearizados virais usando a polimerase T7 RNA.
  4. Purifica-se o ARN tratado com ADNase recém-sintetizado utilizando um kit de purificação de RNA.
  5. Verificar a produção de RNA por electroforese em gel de agarose (Figura 2C).
  6. Quantificar o RNA por espectrofotometria.
  7. Armazenar o ARN gerado em -80 ° C em aliquotas de 10 ug de trabalho. Nota: Para minimizar a variação da qualidade de ARN em cada desenho experimental transcrevendo todos RNA para cada amostra e de controlo virai, ao mesmo tempo.

4. HCV RNA transfecção e Coleta de Amostras

  1. Colher as células Huh-7.5.1 utilizando tripsina.
  2. Para lavar as células, centrífuga e ressuspender a suspensão duas vezes com a mídia frio baixo soro. Ressuspender as células em meios de baixa no soro a 1 x 10 7 células por ml.
  3. Misturar um total de 10 & #956; g de ARN viral transcrito com 400 ul de células ressuspensas (4 x 10 6 células) numa cuvete de electroporação de 0,4 cm. Transfectar as células através de electroporação a 270 V, 100 Ω, e 950 uF.
  4. Ressuspender as células electroporadas em 10 ml de meio de crescimento completo com 15% de FBS. Nota: O aumento da capacidade de sobrevivência das células electroporadas é visto quando as células Huh-7.5.1 foram cultivadas em 15% de soro fetal bovino.
  5. Placa as células em ambos os frascos T-25 (1,2 x 10 ~ 6 células por frasco) e as placas de 48 poços (1 x 10 4 culas por po) para cada um dos seguintes pontos de tempo: 4, 48 e 96 horas.
  6. Substitua a mídia a 4-8 horas após a transfecção com a mídia de crescimento suplementado fresco com 10% de FBS para remover restos de células mortas dos frascos de cultura e placas.
  7. Os sobrenadantes de cultura de células da colheita nos 48 pontos de tempo, 96 h e remover os detritos celulares a partir de amostras recolhidas por centrifugação das células a 1500 rpm durante 10 min a 4 º C.
  8. Armazenar os sobrenadantes isentos de células a -80 º C. Lisar as células de proteína e análise por Western blot de ARN e a transcrição reversa-PCR quantitativa em pontos de tempo indicados.

5. Transcrição reversa-PCR quantitativo (RT-qPCR) para a Avaliação Cópias HCV Genoma

  1. Realize uma de duas etapas RT-qPCR para determinar o número de cópias do genoma do HCV RNA.
  2. Transcrever Reversa 1 ug de RNA celular total, utilizando a transcriptase reversa e um iniciador específico para a cadeia de sentido directo do HCV que se liga a 5 'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') ou um primer específico para o gene doméstico peptidylprolyl isomerase de L (R PPIG : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Também a transcrição reversa do RNA de HCV-FNX (gerado na Etapa 3) de cópias do genoma conhecidos (10 janeiro - 10 setembro padrão) usando sentido HCV cordão iniciador.
  3. Realizar qPCR utilizando 50 ng do cDNA transcrito resultante usando primers específicos do HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') e DNA de ligação corante verde contendo qPCR de super mix. Realize qPCR para PPIG gene housekeeping, bem como (primers PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Nota: Para o cálculo nível RNA HCV intracelular preciso através de amostras, use gene housekeeping celular, PPIG , o nível de expressão (ciclo Ct) para normalização. Utilizar o número de cópias do genoma FNX-HCV, como o padrão para a determinação do número de cópias.
  4. Use as seguintes condições durante a execução de qPCR para determinar o número de cópias de RNA do HCV: 95 º C por 15 segundos e 60   º C por 30 segundos (40 ciclos), utilizando sistema em tempo real PCR.
  5. Ver Figuras 3A e 3B para resultados de replicação do genoma.

6. Ocidental análise de hibridação para detecção de expressão da proteína do VHC (figura 3C)

  1. Use lisatos celulares frRNA viral om transfectadas em 96 horas pós transfecção para a proteína análise Western blot.
  2. Resolver o ligado celular utilizando SDS-PAGE e transferência de difluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana.
  3. Bloquear a membrana com uma solução de bloqueio contendo 5% de leite desnatado, 0,2% de Tween 20 em tampão fosfato salino (PBS).
  4. Incubar a membrana com anticorpo primário monoclonal NS3 (1 em 1000 de diluição) e da beta-actina (diluição de 1 em 5.000).
  5. Adicionar cabra anti-IgG de ratinho conjugado com peroxidase de rábano (diluição de 1 em 5000) e detectadas por quimiluminescência.

7. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)

  1. Fixar as células transfectadas e infectadas por HCV utilizando metanol durante 30 min a -20 º C para o ensaio de imunofluorescência.
  2. Lava-se a células com PBS três vezes, e bloquear com IFA tampão de bloqueio.
  3. Use policlonal de coelho anti-NS5A principalmente anticorpo (gentilmente cedido pelo Dr. Dasgupta, UCLA) ou anticorpo monoclonal anti-DSRNA J2 anticorpo a uma diluição de 1:200 (1 ug / ml) e incubar durante 5 horas a durante a noite a 4 º C.
  4. Lavar as células com PBS três vezes, após o anticorpo primário.
  5. Adicionar cabra anti-IgG de coelho-488 de anticorpo secundário ou policlonal de cabra anti-IgG de ratinho-594 de anticorpo policlonal secundário numa diluição de 1:1000 (1 ug / ml) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
  6. Lave as células com PBS três vezes e núcleos mancha usando corante Hoechst e vista usando microscópio de fluorescência (Figura 3D).

8. Titer medição Vírus

  1. Placa naive Huh-7.5.1 células em cerca de 3 x 3 10 células / poço usando uma placa de 96 poços. No dia seguinte, realizar diluições em série de 10 vezes de livre de células do sobrenadante da cultura colhida a partir de RNA de HCV transfectadas células usando a mídia de crescimento e inocular em triplicado para Huh-7.5.1 células.
  2. Fix células em 72 horas pós-infecção, utilizando metanol (durante 30 min a -20
  3. Utilizar a diluição mais elevada para contar para os focos positivo NS5A e calcular o número médio de unidades formadoras de foco (UFF) por mililitro. Ver Figura 4 para o HCV título.

9. Renilla luciferase Ensaio para Viral Genome replicação e infectividade

  1. Para avaliar a replicação do genoma viral, a placa de HCV RNA electroporado-Huh-7.5.1 células em triplicado em placas de 48 poços (1 x 10 4 células / cavidade).
  2. Lisar as células com 75 ul de tampão de lise passivo no 6 h, 48 h e 96 h pós-transfecção.
  3. Rocha as placas suavemente durante 15 minutos à temperatura ambiente e armazenar a -80 ° C.
  4. Para medir a actividade enzimática de luciferase de Renilla, descongelar o lisado de proteína e luciferase de Renilla reagentes de ensaio a temperatura ambiente.
  5. Adicionar 20 ul de lisado de proteína por cavidade de uma 96-wel l placa luminescência branca e coloque a placa em um luminómetro.
  6. Dispensar 100 l de Renilla luciferase reagente de ensaio (substrato celenterazina + buffer) por poço e depois de um atraso de 2 segundos pré-leitura; integrar a luz emitida durante 10 segundos.
  7. Calcula-se a média eo desvio padrão para cada amostra a partir dos valores da luciferase de triplicados biológicos e submeter os dados para análise estatística (Figura 5).
  8. Para avaliar a infectividade, inocular 500 mL de sobrenadante isento de células obtidas a partir de células transfectadas com ARN de HCV para os pontos de tempo indicados (48 hr e 96 hr), em triplicado, para naive Huh-7.5.1 células em placas de 48 poços.
  9. Substituir o inoculo virai com 500 ul de meio fresco por po, depois de 6 horas pós-infecção.
  10. Lise das células às 48 horas pós-infecção e sujeitas a ensaio de luciferase de Renilla como descritos nos passos 8,2-8,7 (Figura 5).
itle "> 10 Análise Estatística.

  1. As barras de erro nos gráficos indicam os desvios padrão (SD). Os valores de p foram calculados pelo teste t não pareado.

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Representative Results

O vírus da hepatite C é um vírus de RNA. Assim, para fins de manipulação genética, o ADNc genómico do HCV foi clonado num vector de plasmídeo bacteriano. Uma sequência de promotor de polimerase de ARN T7 foi introduzida imediatamente antes da extremidade 5 'do genoma do VHC. Um esquema geral de fluxo de trabalho de análise do HCV é apresentada na Figura 1. Para gerar o ARN genómico de HCV com precisão a extremidade 3 ', o genoma do VHC que contém o plasmídeo é cortado com a enzima de restrição Xbal e a saliência de cadeia simples gerado foi atenuada com a digestão com nuclease de feijão mungo . A qualidade do plasmídeo linearizado de HCV foi avaliada através de electroforese em gel de agarose (Figura 2B). O DNA do HCV foi submetido a T7 ARN polimerase mediada por transcrição in vitro e o ARN resultante produziu um único produto de 9,6 quilobases (Figura 2C).

Testamos a cinética de crescimento de uma 2a HCV intragenotype (Figura60, 3). As células Huh-7.5.1 foram electroporadas com ARN transcrito in vitro do tipo selvagem (WT) e vírus nulos polimerase. Avaliou-se a replicação do genoma viral sentido por RT-qPCR. Os resultados indicaram que o vírus WT replicado no genoma de forma eficiente (Figuras 3A e 3B). A de tipo selvagem exibiram 1-3 log maior nível de replicação do genoma em relação à de Pol-vírus. O vírus WT produz a proteína NS3 (Figura 3C), que está envolvido na clivagem de proteínas virais (actividade de protease), e a replicação do genoma (actividade de helicase). Além disso, o vírus WT proteína expressa NS5A como avaliado pelo ensaio de imunofluorescência (Figura 3D). NS5A proteína faz parte do complexo ARN-replicase do HCV. Para visualizar a replicação do genoma virai, examinámos a presença de ARN de cadeia dupla (ds) de HCV utilizando um anticorpo que reconhece especificamente o dsRNA. Durante HCV amplificação do genoma, o RNA sentido vertente é copied ao genoma anti-sentido, assim, o ARN de cadeia dupla intermediários estão presentes no citoplasma da célula infectada. A proteína NS5A e dsRNA co-localiza no citoplasma celular (Figura 3D) de células transfectadas WT sugerindo a replicação viral activa. Tomados em conjunto, o vírus WT estabelecido replicação ativa em transfectadas Huh-7.5.1 células.

O progresso na investigação HCV tinha sido limitada devido à falta de um sistema de cultura de células infecciosas. A descoberta de JFH-1 estirpe de HCV e a subsequente caracterização de estirpes laboratoriais quiméricos nos permitiu investigar o ciclo de replicação do VHC inteira em cultura de células, incluindo a entrada do vírus, a tradução de RNA, a replicação do RNA e a formação de progenia virai infecciosa. Para avaliar o título de infecciosidade de HCV e de novo, foi inoculado, os sobrenadantes de cultura de células colhidas a partir de ARN de células transfectadas de HCV. A infecção pelo HCV foi visualizado por detecção da proteína NS5A de HCV e calculadoo título viral por contagem dos focos infecciosos (Figura 4). Consideramos isolado aglomerado de células (mais de 2 células) foram positivas para NS5A como um único foco. Os resultados indicaram que o vírus WT é infecciosa e produz mais de 10 4 focos formando unidades / ml de partícula infecciosa.

Também estabelecemos um vírus HCV repórter abrigar Renilla luciferase (Rluc) gene repórter (Figura 5A). Um repórter de HCV pode ser utilizado para testar grande número de vírus mutantes, assim como para a maior conteúdo ensaios de rastreio. Aqui apresentamos a avaliação dos fenótipos de crescimento do WT e vírus Pol-repórter. Se o genoma viral replica, a atividade de luciferase aumentaria pós horas extras transfecção. Os níveis aumentados de replicação do genoma pode ser deduzida a partir de um aumento da actividade de luciferase. Assim, a actividade da luciferase indirectamente proporciona a medição do nível da replicação do genoma. Os lisados ​​colhidos de WT ou Pol-viRNA ral células transfectadas em pontos de tempo indicados, foram testados para a actividade de luciferase. Às 6 horas pós-transfecção, tanto WT e Pol-vírus teve atividades luciferase semelhantes, indicando nível semelhante de RNA transfectadas que tinha sido traduzido (Figura 5B) de entrada. No entanto, em 48 horas e 96 horas após a transfecção, o vírus WT apresentaram níveis aumentados de replicação do genoma em relação à de Pol-vírus. Além disso, o vírus WT produzida proteína NS3 do vírus, como verificado por análise de Western blot (Figura 5C). Posteriormente, foi testada a infectividade do vírus WT e Pol-repórter inoculando ingênuos Huh-7.5.1 células com os sobrenadantes livres de células coletadas de 48 horas e 96 horas post culturas transfectadas celulares. O Pol-vírus tinha atividade luciferase de nível básico, enquanto o vírus WT tinha 2-3 log maior nível de replicação do vírus que Pol-repórter (Figura 5D). Os resultados demonstram que temos uma HCV cultu célula infecciosa robusto re sistema.

Figura 1
Figura 1. Esquema geral do fluxo de trabalho de análise de replicação do HCV. Linearized construção plasmídeo contendo HCV RNA polimerase T7 promotor (T7p) submetido a transcrição in vitro. O ARN do genoma de HCV purificado é electroporado em células Huh-7.5.1 e plaqueadas em frascos e de 48 poços da placa. Às 4 horas, 48 ​​horas e 96 horas após a transfecção, o RNA celular e sobrenadantes de culturas são colhidas a partir de frascos. As células de 48 poços da placa são utilizados para colheita de lisado de proteína e são fixadas para o ensaio de imunofluorescência. A análise do número de cópias do genoma por meio de RT-qPCR, título viral blot e medição ocidental são feitas para avaliar a replicação do HCV.

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Figura 2. Produção de HCV RNA genómico por transcrição in vitro do ADN de plasmídeo construído. A) organização genômica do vírus quiméricos J6CF/JFH-1 intragenotype 2A, FNX-HCV e FNX-HCV Pol nulo. A região de tensão J6CF (5 'NTR a parte de NS2) é retratado em cinza escuro e região tensão do JFH-1 (parte da NS2 para 3'NTR) é exibido em cinza claro. Mutação domínio catalítico da polimerase NS5B (GDD para AAG) é indicado com um asterisco. B) Passos envolvidos na geração do plasmídeo linearizado de HCV. Gel de imagem mostra os linearizados, sem corte DNAs de plasmídeo casquilhos produzidos por Xbal e digestão com nuclease de feijão mungo, prontas para a transcrição in vitro. 0,8% de gel de agarose foi usada para a resolução do ADN. C) Gel de imagem representa os ARN genómico de HCV produzida por transcrição in vitro utilizando o sistema da polimerase de ARN de T7. WT: tipo selvagem; Pol-: null polimerase; M:marcador.

Figura 3
Figura 3. Avaliando os fenotipos de crescimento de construções de HCV. A) A avaliação da cinética de replicação do genoma de tipo selvagem (WT) e polimerase nulo) Pol-vírus (. Os números de cópias do genoma de ARN de cadeia de sentido avaliada por RT-qPCR são apresentados no gráfico de barras. As cópias do genoma viral de Pol-vírus diminuiu ao longo do período de tempo, indicando a replicação fenótipo deficiente. B) nível de replicação do genoma Relativa de tipo selvagem do HCV é comparada com a de Pol-vírus. C) A análise por Western blot da expressão da proteína do VHC. Proteína NS3 do VHC é detectado e beta-actina é usado como um controlo celular. D) Ensaio de Imunofluorescência para investigar a replicação viral. Em 96 horas após a electroporação, as células foram fixadas e sujeitas a immunostaining para a proteína NS5A de HCV e RNA de cadeia dupla (ds RNA), um marcador de intermediários de replicação de RNA HCV. Os núcleos foram visualizados com Hoechst mancha (Barra de escala de 50 mm). HPT:. horas após a transfecção Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Examinando a infecciosidade de tipo selvagem do HCV e medir o título do vírus. A) células naive Huh-7.5.1 foram usadas para estudos de infecção. O sobrenadante isento de células colhida aos 48 e 96 horas após a transfecção (HPT) de HCV RNA foram sujeitas a 10 vezes a diluição em série e adicionada às células em uma placa de 96 poços em triplicado. 72 horas pós-infecção, as células foram fixadas e imunocoradas para a proteína de HCV NS5A. As células com NColoração positiva S5A (vermelho) estão infectados com o vírus. Para avaliar Focos Unidade Formadora (UFF), os focos positivo na diluição mais elevada foram contadas. Painéis representativos de imagens são mostradas (Barra de escala de 100 mm). B) Os valores médios e desvios-padrão de título viral em FFU por mililitro são mostrados no gráfico. A polimerase mutante nulo não produzir partículas infecciosas. WT: tipo selvagem; Pol-:. Nulo Polymerase Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Avaliando a replicação do genoma e infecciosidade de HCV repórter. A) Uns desenhos animados de intragenotype 2a quimérico vírus repórter é apresentado. O gene da luciferase de Renilla é inserido inframe entre 5 'NTR e núcleo. B) A cinética de replicação do genoma do tipo selvagem e vírus mutantes repórter Pol no tempo indicado aponta pós-transfecção é mostrado no gráfico. Lisados ​​de proteínas foram colhidos em 6 horas, 48 horas e 96 pontos no tempo hr para medir a atividade enzimática da luciferase Renilla. A média e desvio padrão calculado a partir de valores triplicados de luciferase Renilla (RLV) para cada vírus são apresentados no gráfico. C) painel Western blot mostra a expressão da proteína NS3 do VHC. Um antigénio não específica detectada por NS3 anticorpo primário funciona como um controlo de carga. De tipo selvagem (WT) do vírus repórter produz nível elevado de proteína NS3. D) Análise de infecciosidade do vírus. Ingénuas Huh-7.5.1 células foram inoculadas com o sobrenadante livre de células obtido a partir de cultura transfectadas em 48 horas e 96 pontos de tempo hr. Renilla actividades de luciferase de células infectadas foram medidos a 48 horas pós-infecção.Os valores médios com desvio padrão são apresentados no gráfico. O vírus Pol-repórter células infectadas tinham apenas nível de atividade luciferase fundo, enquanto WT vírus repórter exibiu alto nível de infectividade.

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Discussion

Esta ilustração descreve um método para a análise do ciclo de replicação do vírus da hepatite C. HCV é um patógeno humano eo protocolo de biossegurança prescrito terá que ser rigorosamente seguidas. Sistemas de cultura de células de HCV infecciosas foram descritos anteriormente 11-13,16,17. Existem alguns pontos cruciais que implementamos quando seguindo o protocolo ilustrado. Primeiro, é de grande importância para uma boa qualidade de comprimento RNA genômico viral completo intacto para os estudos a jusante. O plasmídeo de entrada portador do cDNA viral deve ser linearizado e embotados cuidadosamente. A nuclease de mung-bean empregues para diminuir a Xbal saliência é uma nuclease não específica e incubação prolongada irá resultar em danos ou degradação do extremo 3 'do genoma viral. A nuclease tem de ser removida imediatamente após o especificado 30 minutos de incubação por extracção com fenol-clorofórmio ou de purificação de permuta aniónica em coluna. Extração de Gel de nuclease tratada DNA não pode ser recomendado como oenzima é ativo durante o processo de eletroforese em gel.

Para a subsequente em passos RNA de transcrição in vitro, em geral, um vai também tomar precauções de amplo espectro para minimizar ribonuclease (RNase) contaminação. Todos os reagentes e materiais utilizados devem ser livres de RNase. Para gerar o ARN genómico de alta qualidade, com intervalos de ARN de cadeia mínima, o ARN precisa de ser submetida a uma menor tensão física, evitando vórtex dura e pipetagem repetida durante a purificação e as etapas de manipulação a jusante. Após a conclusão da transcrição de ARN, os moldes de ADN de plasmídeo de entrada tem de ser removido a partir da mistura de RNA transcrito pela DNase (RNase livre) de tratamento. A remoção incompleta pode resultar em extravasamento do DNA de plasmídeo em células transfectadas e afectar a quantificação absoluta do número de cópias do genoma de RNA viral replicado. Assim usar enzima DNase a uma concentração de 1 unidade por micrograma de ADN e também tendo adicional de 15 min de incubação a 37 ADNase º C podeajudar. O RNA transcrito pode ser purificado quer por extracção com fenol-clorofórmio ou coluna de permuta aniónica. Cuidados devem ser tomados para evitar a transição de fenol ou outros reagentes para a amostra de RNA purificado, que pode ser citotóxicos e interferir com os ensaios moleculares.

Para fins de electroporação, o ARN purificado tem que ser dissolvido em RNAse-livre de água estéril. Se o sedimento de ARN é de difícil dissolução, o aquecimento da amostra a 65 º C durante 5 min irá ajudar. Uma vez que a transcrição é terminada, isto é importante para armazenar o ARN imediatamente em 10 ug de aliquotas de trabalho feitos de RNase isenta de água a -80 ° C. A finalidade das alíquotas é evitar ciclos repetidos de congelação / descongelação a degradação de RNA mediada. Para os resultados experimentais consistentes, recomenda-se a transcrever todas as amostras e controlos, ao mesmo tempo. RNA de alta qualidade é recomendado para um rendimento título viral mais elevada. Para a transfecção de ARN genómico de HCV, o polímero e o lípido baseado agentes de transfecção pode também be usado 21,22.

Factores virais e hospedeiras influenciar fortemente a cinética do crescimento das estirpes de HCV. A linha de células de hepatoma humano (Huh-7) Derivados de Huh-7.5, Huh-7.5.1 e as linhas de células Huh7-Lunet são comumente utilizadas para avaliar o crescimento virai 11-13,15. A produção viral pico de tensão JFH-1 em células Huh7-Lunet está em 3-4 dias após a transfecção, enquanto que em células Huh-7.5.1 é aos 21 dias após a transfecção 13,15. O vírus quimérico intragenotype 2a FNX-HCV ter genes não-estruturais do JFH-1 estirpe tem título de pico em 4 dias após a transfecção em células Huh-7.5.1 19,20. Para a produção viral de RNA em vitro transcrita, é o preferido linha passagem precoce de células de hepatoma humano. Produção Viral é significativamente reduzido durante o uso Huh-7.5.1 células ao longo do número de passagem 20. Para assegurar uma maior capacidade de sobrevivência das células após a eletroporação, descongelados Huh-7.5.1 células dispõem de um período de recuperação de duas semanas antes da realização de um experimento e maintained em 12% -15% de FBS. Juntamente com este critério, ressuspensão das células em meio de crescimento contendo 15% de FBS, imediatamente após a electroporação aumenta a sobrevivência de células que permite uma melhor produção viral. Após o primeiro ponto de tempo de 8 horas, as células são, então, transferido para um meio contendo 10% de FBS. Para minimizar o transporte sobre os restos celulares, o sobrenadante de cultura virai é sujeito a centrifugação e filtração através de filtro de 4 micron. Os sobrenadantes virais não concentrados ou concentrados, são divididos em alíquotas e armazenado em -80 º C para posterior in vitro e in vivo. Estas precauções e sugestões podem ajudar os pesquisadores para realizar com sucesso a análise do ciclo de replicação do HCV.

Outra variação do repórter de HCV que abriga um gene marcador, tal como a proteína fluorescente e uma forma segregada de Gaussia luciferase (Glic) são descritos para a pesquisa de HCV 18,23,24. Para os pesquisadores com foco na investigação de HCVreplicação do genoma, HCV sub-genómico replicão (a que falta o núcleo genes NS2) é uma ferramenta valiosa 9,10. Replicões HCV não são infecciosos, portanto, requerem menos regulamentações de biossegurança e mais fácil de trabalhar em comparação com o HCV cultura de células infecciosas e isolados clínicos. VHC deficiente em actividade de polimerase NS5B é um controlo importante para o estudo da replicação do HCV ciclo de 11,12. HCV falta glicoproteínas do envelope (delta E1E2), ou atividade p7-NS2 pode ser controles úteis para estudos envolvendo entrada HCV, virion morfogênese e saída 12,19,25-27.

Quanto limitações, atualmente o sistema de cultura celular infecciosa está disponível apenas para genótipos 1 e 2. Cepas virais autênticos pertencem aos genótipos de 3 a 6 que são capazes de crescer de forma eficiente em cultura de células ainda não foram identificados. Vírus recombinantes intergenotípica são alternativas úteis para o estudo do ciclo de replicação de vários genótipos. Replicação competente harbori vírus quiméricong núcleo à região NS2 de genótipos 1-7 e restante da seqüência de JFH-1 genótipo 2a genoma foram descritos 15,18. Outra limitação é que o rendimento de vírus de JFH-1 e os seus derivados quiméricos estirpes está na gama de marco 10-junho 10 por ml, que é relativamente baixo em comparação com a de outros vírus de RNA tais como poliomielite e da gripe. Tensão HCV com crescimento robusto precisa ser desenvolvida. Futuro investigação inclui o uso do HCV repórter para high-throughput screening biblioteca para identificar antivirais potentes e focar no desenvolvimento de vacinas para prevenir a infecção pelo HCV.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Fisher Scientific 10-017-CV
Non essential amino acid Fisher Scientific MT25025CI
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red Life Technologies 11058-021
Huh-7.5.1 The Scripps Research Institute The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)  Cedars-Sinai Medical Center The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaI New England Biolabs Inc. R0145S
Mung Bean Nuclease New England Biolabs Inc. M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System Promega P1320
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm) Bioexpress E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System Bio-Rad 165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
PVDF membrane package Bio-Rad 162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk Bio-Rad 170-6404XTU
Tween-20 Bio-Rad 170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] Abcam ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] Abcam ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)  Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents  GE Healthcare Life Sciences RPN2236
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
ViiA 7 real-time PCR system Life Technologies NA
Renilla Luciferase Assay System kit Promega E2810
RNase-Free DNase Promega M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer) Promega

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References

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