영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

Neuroscience
 

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Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO. J. Vis. Exp. (89), e51382, doi:10.3791/51382 (2014).

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Abstract

Introduction

생물학적 조직의 조직 학적 검사는 자연 환경에서 분자 / 세포의 성질을 이해하는데 중요한 접근법이다. 이상적으로, 전체 기관의 고해상도 영상은 가장 유익하고 바람직하다. 빛이 한 산란으로 인해 제한된 침투 깊이를 가지고 있기 때문에, 장기 고정 고해상도 현미경 이미징을 수행하기 위해 단면되어야한다. 따라서, 조직 학적 연구의 대부분은 기관의 작은 부분만을 나타내는 몇 조직 절편에서 수행된다. 일부 연구에서, 예를 들면, 뇌 또는 척수에있는 신경 세포의 연결을 추적하는 것을 목표로하는이 대상 기관의 모든 조직 섹션을 수집하고 3 차원 재건 군데. 그러나, 조직 절편과 개별 섹션의 이후의 영상은 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 이들은되는 기계적인 왜곡에 시간과 조직의 불완전한 3D 재건을 선도하고, 어려운 포함결과 이미지의 정렬에 이거.

최근, 청소 및 이미지 그대로 투명한 기관은 이러한 단점 2,3에 중요한 솔루션으로 개발되었다. 비운 후, 전체 기관이 렌더링되는 투명 촬상 광을 여행 할 수 있도록 종단 그러한 다중 광자 또는 광 시트 현미경으로 레이저 주사 현미경을 사용하는 unsectioned 기관의 고해상도 이미지를 생성하기 위해 (도 1) ( 그림 2). 다양한 연구 그룹은 서로 다른 목적을 위해 그 자신의 조직 이미지에 할 수있는 새로운 조직 청산 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 유기 용매 2-5, 8 청산 프로토콜을 기반으로 물 6,7 전기 영동 (가) 있습니다. 그 중, 용매의 3 차원 영상은 장기를 지우거나 3DISCO는 중추 신경계 (CNS) 기관, 면역 기관과 고형 종양을 포함하여 다양한 생물학 견본에 쉽게 적용 할 수있는 프로토콜입니다. 요금 지불에이온, 이러한 광 시트 형광 현미경 (LSFM), 다 광자 공 초점 레이저 주사 현미경과 같은 다른 현미경 기술과 결합 될 수있다. 3DISCO는 이러한 4 테트라 하이드로 퓨란 (THF) 및 디 벤질 에테르 (DBE)로 쉽게 사용할 수 싼 약으로 청소를 기반으로합니다. 전체 프로토콜은 3 ~ 4 시간 짧게 걸릴 수 있습니다. 따라서, 3DISCO 9를 완료하기 위해 개월 주 정도 걸릴 수 있습니다 기존의 조직 학적 방법에 비해 강력하고 빠른 기술이다.

Protocol

모든 동물 실험은 ~ 3~5개월 된 마우스에 IA​​CUC (기관 동물 관리 및 사용위원회) 규정에 따라 수행되었다. 저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

1. 동물 살포와 조직 준비

타이밍 : 마우스 + 후 고정 당 30 ~ 60 분 (몇 시간에 하룻밤).

  1. 동물의 무게와 케타민 (80 ~ 200 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (7-20 ㎎ / ㎏) 또는 2.5 % AVERTIN (0.5 ml/25 g 체중 IP)를 사용하여 마취.
  2. 전체 적용하려면 마취에 대한 몇 분 정도 기다립니다.
  3. 동물이 완전히 마취되어 있는지 확인하기 위해 동물의 발가락과 꼬리를 꼬집어.
  4. 혈액이 완전히 조직으로부터 제거 될 때까지 0.1 M 인산 완충액 (PB) 또는 50-10 분 동안 0.1 M 인산 완충액 생리 식염수 (PBS)로 RT에서 제 동물 Perfuse.
  5. 정착액 솔루션에 관류 스위치 : 0.1 M PB (0.1 M PBS)에 4 % PFA 및 살포를 계속/ 분 3 ㎖의 속도로 30 ~ 40 분 동안 4 % PFA와.
  6. 천공 및 해부되는 조직을 압박하지 않도록, 손상, 예를 들어하지 않고주의 깊게 관심의 기관 / S를 해부하다.
  7. PBS로 가득 배양 접시에있는 장기 (결합 조직, 수막 또는 경질 문제를) 주위의 여분의 조직을 제거합니다.
  8. 몇 시간 또는 4 박 º C.에 대한 4 % PFA의 장기를 사후 수정 PFA는 신호를 해소하거나 특히 GFP 채널에 대한 autofluorecense 초과 근무 10 (빨간색과 멀리 빨간 채널에서 작은 문제입니다) 증가 할 수 있기 때문에 긴 후 고정하지 마십시오.
  9. 다만 청산 절차를 시작하기 전에 실온에서 PBS와 장기 2 - 3 배를 씻으십시오.

2. 조직 지우기

타이밍 : 큰 기관을위한 작은 기관 1-4 일 2 ~ 3 시간.

주의 사항 : 유전자 발현에 의한 조직의 형광 라벨, 바이러스 성 형질 전환, 염료 추적 또는 항몸 라벨은 삭제하기 전에 완료해야합니다. 모든 조직 청산 단계는 RT에서 수행됩니다. 청소 솔루션 THF, DBE, BABB (1 부 벤질 알코올, 2 부 벤질 벤조 에이트) 및 디클로로 메탄 (실시 제대로 환기 흄 후드에서 실험) 및 피부에 직접 접촉 (사용 니트릴 장갑) 피해야한다 독성 흡입이다.

  1. 50 % (부피 / 부피), 70 %, 다음과 같이 별도의 유리 병에 증류수에 80 % THF 희석을 준비 : 50 % THF를 들어, 예를 들어, 볼륨이있는 유리 병에 25 ㎖의 THF와 증류수 25 ㎖를 혼합 50 ㎖보다 큰.
  2. 부드럽게 1 ~ 2 분 동안 병을 흔들어 솔루션을 섞는다.
  3. 분명 유리 병에 레이블을 지정합니다.
  4. 확실하게 병을 닫고 어두운 캐비닛에 작업 솔루션을 유지. 최상의 결과를 들어, 동일한 작업 솔루션을 더 이상 1~2주 이상을 사용하지 않는다. 따라서, 수 사용 신선한 주식 시약이 될하는 데 사용할 수있는 가장 작은 볼륨으로 청소 솔루션을 주문.
  5. 첫 번째 지우기 솔루션, 50 % THF와 유리 병 (예를 들어, 2 ~ 3 ㎖)를 입력하고 청소를 시작하기 위해 유리 병에 PBS에서 장기를 전송합니다.
  6. 안전하게 뚜껑과 유리 병을 닫고 교반 회전 (예를 들어, 휠 교반기)를 사용합니다.
  7. 어둠 속에서 유리 병을 커버하고 유지하기 위해 알루미늄 호일을 사용합니다. 일정한 속도 (~ 30 RPM)에 지정된 시간 (표 1)를위한 유리 병의 샘플을 교반 회전을 시작합니다.
  8. 청산 액을 제거하고 표 1의 시간이 완료되면, 다음에 프로토콜을 추가.
  9. 후드에 보관 유리 폐기물 용기에 청소 쓰레기를 수집합니다.
    끝까지 프로토콜의 각 청소 솔루션의 단계를 반복합니다. 새로운 청소 용액 (DBE에 THF에서 변경, 예를 들어)를 추가 할 때 새 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
  10. BABB 또는 DBE와 최종 청산 단계에서 배양 시간을 연장 또는 SH 할 수 있습니다샘플이 (가 뇌와 같은 매우 큰 조직의 경우 투명 / 황색) 완전히 가시 광선에 투명한 될 때까지 ortened.
  11. 촬상 단계와 항상 최종 비운 용액 맑게 장기 보관.

3. 영상을 허가 기관 준비

타이밍 : 5 ~ 15 분.

참고 : 이미지 삭제 장기 즉시 완전한 청소가 달성 될 때. 이를 위해, 빛 장 현미경 (예를 들어, ultramicroscopy) 또는 공 초점 / 다중 광자 현미경 영상의 샘플을 준비하는 다음 단계를 수행합니다.

참고 :이 확인란을 선택하지 않은 기관은 시간이 지남에 따라 자신의 형광 강도를 잃게됩니다 (특히 형광 단백질 예를 들어, GFP, 항체 라벨은 더 저항하고 더 오래 배양과 함께 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.) 촬상을 위해, 다양한 형광 현미경 기법 클레아있는 장기의 적절한 처리만큼 사용될 수있다링 용액 달성된다.

  1. 빛 장 현미경
    1. 배치하거나 적절하게 샘플을 탑재합니다.
    2. 수동으로 샘플 홀더 (4)의 나사를 돌려 지워 장기 고정합니다.
    3. 최종 청산 단계에서 사용 된 어느 BABB 또는 DBE,로 가득 thelight 장 현미경 (바람직하게는 유리로 만들어진) 이미징 챔버로 샘플을 찍어.
  2. 다 광자 / 공 초점 현미경
    1. 일반적으로 기름이나 물 침지 목표를 사용하는 다중 광자 또는 공 초점 현미경과 이미지로 할 수있는 최종 이미징 솔루션과 영상 슬라이드 (또는 영상 실)에 샘플을 설치합니다.
    2. 조직 주위에 테두리를 만들기 위해 치과 시멘트를 사용합니다.
    3. 치과 용 시멘트가 완전히 딱딱한 도착하기 직전에 BABB 또는 DBE와 풀을 입력합니다.
      주 : 치과 용 시멘트 빠르게 고체화; 실제 샘플을 시도하기 전에 잘 알고 얻기 위해 몇 번을 연습합니다.
    4. 즉시 배치풀의 중간에와 커버 유리로 커버 클리어 샘플.
    5. 그것이 완전히 치과 시멘트에 의해 밀봉하고, 공 초점 / 다 광자 현미경에 의해 최대 촬상 깊이에 도달 수 맑게 장기의 표면에 닿을 때까지 커버 유리를 누른다.
      참고 :이은 청산 솔루션은 영상 중에 유출되지 않음을 보장합니다. 이 BABB / DBE에 내성 또는 보호 커버를하지 않는 한 렌즈를 해칠 수있는, 청소 솔루션에 직접 이미징 렌즈를 찍기 마십시오.

4. 이미징 해제 기관

타이밍 : 15-45 분.

  1. 현미경이 제공 할 수있는 최고의 해상도 (사용 렌즈가 허용하는 경우)는 전체 취소 조직을 포괄하는 Z-스캔을 수집합니다.
  2. 높은 해상도 이미지를 수집하기 위해 관심의 영역을 확대합니다.

소프트웨어 아미라와 데이터 5. 시험

  1. 이미지 세리를로드ResolveRT 모듈과 소프트웨어 아미라에의.
  2. "이미지 읽기 매개 변수"창하고 확인을 눌러 올바른 복셀의 크기를 입력합니다.
  3. "멀티 플레이 너보기"하위 응용 프로그램을 선택합니다. 그런 다음 2D 및 3D 값을 조절, 회색 값에 대한 최적의 임계 값을 선택합니다 "두께"슬라이더를 사용합니다.
  4. 다른 방향에서 2D 슬라이스 브라우징 및 3D 뷰 자르기 코너 모듈을 사용하여 샘​​플을 시각화.
    참고 : 프로토콜의 자세한 문제 해결 가이드는 Ertürk 등의 알 4에서 찾을 수 있습니다.

Representative Results

뉴런은 매우 매우 긴 형태로 세포를 편광된다. 이들의 기능은 서로 사이 다른 조직으로 형성하는 연결에 따라 달라집니다. 따라서, 신경 세포의 구조 조직을 매핑하는 그들은 건강과 질병에서 작동하는 방법을 이해하기 위해 매우 중요합니다. 그러나, 전체 신경계 최근에 이름 connectomics 11에 걸쳐 같은 거대한 신경 세포의 연결을 추적하는 것은 - 여전히 신경 과학에서 가장 어려운 과제 중 하나 남아있다. 이를 위해, EU (12)과 미국 (13) 모두는 인간의 뇌를 매핑하는 대형 프로젝트를 시작 하였다.

3DISCO는 다양한 기관에서 이용 될 수 있지만, 척수와 뇌의 긴 신경 세포의 연결을 추적 할 때 특히 유용했습니다. 예를 들어, 대형 맑게 척수 세그먼트 ultramicroscopy 스캔을 사용하여, 축삭 연결 설치류 척수 (센치 위에 따라야 할그림 2). 유사한 방식으로, 전체 맑게 마우스의 뇌 (도 3a) 및 해마 (도 3b)은 뇌 신경 세포의 연결을 따라 묘화 될 수있다.

공 초점 또는 다 광자 현미경이 맑게 기관에 사용하는 경우, 촬상 해상도는 크게, 특히 Z 차원에서 개선 될 수있다. 예를 들어, GFP-M 라인 마우스 (그림 4a)에서 지워 척수의 다 광자 영상은 척수의 전체 깊이 (~ 1.5 mm)을 통해 완벽한 이미지를 얻을 수있다. 허가 척수에 공 촛점 축소 복사도 비슷한 방법으로 (그림 4BC)에서 개선 된 해상도를 제공합니다. 클리어 두뇌의 다 광자 현미경 영상은 돌기 쪽 (그림 5) 등의 신경 구조의 좋은 정보를 시각화하기 위해 매우 높은 해상도의 이미지를 제공합니다. 3DISCO의 샘플 비르, 유전자 발현 등 다양한 방법으로 표시 할 수있다알 형질, 염료 추적 및 항체 라벨. 예를 들어, 혈액 - 뇌 장벽을 연구하는데 사용될 수 렉틴 공액 형광 트레이서 4를 이용하여 뇌 (도 6ab) 및 척수 (도 6Cd), (BBB의 전체 맥관 라벨을 가능 ) 건강과 질병에.

미세 아교 세포와 성상 세포 둘 다 매우 알츠하이머 질환 및 외상 부상 (14, 15) 등의 신경 변성의 병리에 연루되어있다. 3DISCO를 사용하여, 자신의 밀도와 척수에 분포 (그림 7) 또는 뇌는 공부하실 수 있습니다.

비 신경 조직 또한 몇 군데 있습니다. 예를 들어, 전체 설치류 폐 클라라 세포는 항체 immunolabeled 수 및 단일 레벨 셀 (도 8)에 구획없이 묘화. 마찬가지로, 취소 가능하고, 화상 세포는 unsectioned 췌장 조직 (그림 9)의 알파 세포.

그림 1
그림 1. 3DISCO 조직 청산은 깊은 조직 이미징을위한 투명 unsectioned 조직을 렌더링합니다. 가시 광선으로 볼 때 () 해제되지 않은 및 삭제 (B) 척수 조직. 청소시, 깊은 조직 레이저 스캐닝 현미경 가능하게된다. (C) 해제되지 않은 및 취소 척수 조직은 2 광자 현미경으로 몇 군데 있었다. A, B = 0.5 mm와 C = 100 μm의에서 스케일 바.

그림 2
그림 2. 축삭 확장을 수행하는 척수의 3DISCO 영상은. 네-1 GFP 유전자 변형 마우스 라인 (GFP-M)에서 해부 척수는 ~ (작은 조각으로 나누어 져 있습니다4mm). 작은 조직 (표 1)에 대한 청산 절차를 따르는 한 후 투명 척수는 ultramicroscopy 사용하여 시각화 하였다. 수평에 ~ 4mm 척수 세그먼트의 3D 재구성 (A), 관상 (b) 및 시상 (C). (D) 대표는 축삭 (적색) 추적은 그레이 스케일 투명보기에 표시됩니다. (D)에 표시된 지역의 (E) 고배율보기. A, B, C, D = 0.5 mm와 = 20 μm의 전자의 스케일 바.

그림 3
삭제 뇌와 해마의 그림 3. 3DISCO 영상은. 삭제 두뇌와 GFP-M 마우스의 해마의 예는 ultramicroscope으로 몇 군데 있었다. 신경 netwo를 시연 뇌 전체 (A)와 해마 (B)의 3D 시각화이미지가 투명 조직에 RKS. = 2 mm 단위와 B의 스케일 바 = 20 μm의.

그림 4
그림 4. 조직의 삭제가 다 광자 공 초점 현미경으로 얻은 해상도를 향상시킵니다. 다중 광자 (a) 또는 공 초점 현미경으로 몇 군데 GFP-M 마우스에서 투명 척수 세그먼트 (B, C). 실질적으로 삭제하는 축삭과 수상 돌기의 미세 구조를 공개 해상도와 이미지의 깊이를 향상합니다. = 100 μm의와 B의 스케일 바, C = 20 μm의.

그림 5
그림 5. 돌기 쪽의 3DISCO 영상. 다 광자에 의해 촬영 GFP-M 마우스에서 투명 뇌 조직. 버전에 제시 스캔 피질 영역의 3D 시각화(a) 및 수평 tical 관점 (b). (c) ~에 나타낸 레벨에서 50 μm의 돌기 (a, b). (C) 돌기 쪽 (화살촉)를 포함하는 신경 구조의 정밀한 세부 사항을 설명에 표시된 지역의 (D) 높은 배율. B의 = 50 ㎛의 스케일 바, C = 25 μm의, D에 = 5 μm의.

그림 6
(16) 설명에 따라 그림 6. 혈관의 3DISCO. 전체 장기에 혈관을 레이블로, 렉틴 FITC 염색은 (지우기 전에) 관류 동안 사용되었다. 우리가 추적의 꼬리 정맥 주입 추적자의 심장 관류를 통해 더 나은 신호를주는 것을 발견 언급에 주목할 필요가있다. 고정 된 뇌와 척수를 수집 후에는 삭제하고 난했다ultramicroscopy에 의해 접촉되었거나 손상. 히트 맵에서 전체 마우스 뇌 혈관의 3D 시각화 (A)와 그레이 스케일 (). 마우스 척수 히트 맵의 세그먼트 (C)와 그레이 스케일 (D)의 혈관의 (b)는 3D 시각화. 히트 맵은 렉틴 염색의 강도에 따라 생성 된; 블루 : 저 강도 (배경)와 레드 : 고강도 (혈관). = 2mm, B = 1 ㎜, D에 C = 250 μm의에서 스케일 바.

그림 7
취소 CNS 조직의 아교 세포의 그림 7. 3DISCO. 미세 아교 세포 TGH (CX3CR1-EGFP) 또는 성상 세포 TGN (hGFAP-ECFP)로 이루어지는 군으로부터 선택된다에 GFP를 발현하는 형질 전환 마우스의 척수는 지워지고 다 광자 현미경으로 몇 군데 있었다. 미세 아교 세포의 3D 렌더링은 표면의 볼륨 시각화 (A)와 투명보기 (로 표시됩니다 (c) 투영 광학 (~ 50 ㎛)가 척수에 미세 아교 세포의 세부 사항을 보여주기 위해 제공된다. 성상 세포의 3D 렌더링은 표면의 볼륨 시각화 (A)와 투명보기 (B)로 표시됩니다. (f) 광 프로젝션 (~ 50 ㎛)가 척수 성상 교세포의 세부 사항을 보여주기 위해 제공된다. = 50 ㎛ F A, B, D, E = 100 μm의와 C의 스케일 바.

그림 8
을 위해 클라라 세포의 항체 염색과 전체 마운트 폐 엽의 그림 8. 3DISCO은. 폐 엽 (叶)의 전체 마운트 항체 염색의 경우, 10 주령의 BALB / C 여성 마우스는 PBS와 우심실을 통해 관류 하였다 폐에서 혈액을 제거합니다. 폐는 연속적으로 세 번 이상 일의 양을 4 % PFA로 팽창 및 정착에 실온에서 O / N 수정되었습니다전자 조직. 다음날, 폐 간단히 PBS로 세척하고, 우엽은 48 시간 동안 permeabilization 또는 조직이 침몰 할 때까지 PBS에 1 % 트리톤 X-100의 5 ㎖에 넣어했다. 염색에 모두는 5 % FBS와 2 % BSA를 함유하는 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100에서 수행 헹굼은 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100에 있었다 하였다. 안티 CC10로 염색하면 약 6 시간 동안 광범위한 세척 한 다음 4 ° C에서 72 시간 동안했다. 차 항체의 형광 라벨 밤새 4 ° C에서 6 시간에 밤새 광범위한 세척 다음에 안티 - 염소 - 알렉사 플 루어 594 차 항체를 달성했다. 다음 날, 스테인드 엽 (叶)은 30 분 동안 50 %, 70 %, 80 %의 THF 되었죠 DBE에서 30 분 뒤에 DCM에서 20 분 뒤에 100 % THF 세 30 분 세척, 다음 각. A와 B = 1 mm 단위와 C = 100 μm의에서 스케일 바.

그림 9
그림 15. 췌장은 3DISCO. 프로토콜에서 상술 한 바와 같이 마우스의 관류 후 췌장 해부하고 짧은 프로토콜 맑게. 형광 글루카곤의 ATG에 삽입 CreERT2과 내생 마우스 글루카곤의 궤적에 걸쳐 200 킬로바이트 BAC의 유전자를 운반하는 쥐의 타목시펜 치료에 의해 유발 ROSA26 LSL tdTomato 재조합에서 파생됩니다. 화살촉은 섬에있는 형광 표지 된 알파 세포의 일부를 표시합니다. A, B 및 C = 1 mm 단위 및 D = 500 μm의에서 스케일 바.

표 1
표 1. 다양한 조직에 대한 조직 청산 프로토콜. 다른 조직에 대한 조직 청산 프로토콜의 예. 각 단계에 대한 클리어 시간이 단축 또는 소거 성능을 향상시키기 위해 필요에 따라 확장 될 수 있음을주의한다. 작은 조직의 가중치는 20 ~ 100 mg의 뇌는 ~ 300 ~ 500 밀리그램입니다 ~입니다.ttps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "대상 ="_blank ">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

조직의 청소 방법은 허가 기관에서 다른 조직 층의 굴절률을 일치시켜 영상의 빛의 산란을 감소하는 것을 목표로하고 있습니다. 결과적으로, 촬상 광은 깊은 조직으로 침투하고 표지화 된 세포 / 분자를 자극 할 수있다. 17 삭제 조직이 오래된 개념은 Dodt 및 동료 2로 그대로 마우스의 뇌에 기술의 첫 번째 정교한 신청 후 성장 주목을 받고있다. 그 이후로, 3DISCO, 무서 / 전자, ClearT2, CLARITY 및 SeeDB 3,4,7,18-20 포함한 새로운 청소 방법의 빠르게 성장하는 목록이 있습니다. 본질적으로, 그들은 모두 형광 라벨을 보존함으로써 깊은 조직 이미징을위한 투명한 기관을 렌더링하는 것을 목표로하고 있습니다. 그 중, 3DISCO는 가장 간단하고 재생 가능한 방법의 하나로서 의미합니다. 그것은 상대적으로 빠른 다른 청산 위에서 언급 한 방법 (1-5일 대 성인의 뇌 2 ~ 3 주에 각각) 21과 비교된다. 이미 성공을했습니다완전히 같은 뇌, 척수, 림프절, 비장, 폐, 고형 종양, 췌장, 및 유방 동맥 3,4,9 등의 다른 장기에 적용. 또한, 독립적 인 연구 그룹에서 여러 게시가 이미 영상은 22, 23를 결과를 얻으려면이 방법을 사용했다. 그럼에도 불구하고, 다른 조직의 청산 절차는 다른 조건에 유용 할 수 있습니다. 무서 / 전자 및 SeeDB 배아 조직 6,7에서 가장 잘 적용 할 수있는 반면 예를 들어, 그들은 이미징 동안 쉽게 처리 할 수 있습니다 물 기반의 청소 방법입니다. 반면, CLARITY는 복잡하고 비용이 많이 드는 청소 방법입니다. 그러나 특히 뇌 에이트와 같은 큰 조직에서, 항체 라벨링의 컨텍스트에서 유리할 수있다.

3DISCO에서 최상의 영상 결과를 얻을 수있는 가장 중요한 단계는 조직 지우기 전에 수행되는 조직의 라벨입니다. 그것은 가능한 가장 강한 형광 신호로 시작하는 것이 필수적입니다. 이 B 수전자 합성 염료, 바이러스 형질 전환 또는 항체 라벨에 의해 추적, 형광 단백질의 유전자 발현 등 다양한 방법으로 달성했다. 그것은 어떤 소거 절차는 조직의 형광 신호를 줄일 수 있음을 명심해야한다. 형광 신호가 처음에 충분히 강한 경우에 따라서, -는 지워 조직의 청산 이미징 전에 쉽게 감지 할 수없는, 즉 가난한 결과를 제공 할 것입니다.

개선을 기다리는 방법을 비운의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 중요한 제한은 맑게 시약 맑게 기관의 구조를 변경하기 때문에, 그들은 살아있는 조직에 사용될 수 없다는 것이다. 따라서, 이러한 광활성 mEos2 (24)와 같은 실험은 고정 및 지우기 전에 수행해야합니다. 청소시, 밝고 광 안정성 단백질의 형광 신호의 슈퍼 해상도 이미징이 가능해진다. 또한, 때문에 청소 프로토콜은 감소형광 단백질의 강도, 허가 기관은 장기간 저장할 수 없습니다. 그것은 어떤 기관은 소거 힘들어하는 것이 중요합니다. 해부 장기 혈액 세포 (예, 비장, 간)의 높은 금액을 유지하는 경우 특히, 그들은 취소하고 이미지에 상대적으로 어렵습니다. 그런 성인 설치류의 뇌와 같은 큰 조직을위한 완벽한 청소를 달성하기 위해 상대적으로 어렵습니다. 이러한 조직은, 다른 한편으로는, 형광 신호를 감소시킬 수있는 긴 배양 시간을 필요가있다. 또, 현미경 방법의 개발은 화상 큰 투명 장기 한번에 고해상도에서 해결되어야하는 대기 필요하다 할 수있다. 이 기술의 또 다른 중요한 한계는 조직의 표시입니다. 유전이나 바이러스 표현을 통해 강한 형광 신호가 적합하지만,하지 모든 세포 또는 분자는 유전자 또는 바이러스 성 표시 할 수 있습니다. 반면에, 두꺼운 조직의 항체 라벨은 간단한 절차 또는하지 PO 없습니다대부분의 경우 ssible. 그것은 3 (몇 주에 몇 일) 특별한 permeabilization 프로토콜과 긴 배양 시간이 필요합니다. 그것은 조직이 때문에 탈수 및 탈지 주로 지운 후에 (척수 조직에 대해 측정) 각 차원에서 ~ 20 % 줄어들 것을 명심하는 것이 중요하다. 이 수축 ratiometrically 발생하고 정량화 단계에서 수정해야합니다. 제시된 결과에서 관찰 된 바와 같이, 형광 표지 구조는 지워 조직에서 단백질의 무결성의 표시입니다, 그대로 유지됩니다. Focusclear - 어느 CLARITY 또는 80 % 글리세롤에서 사용되기 때문에, 최종 맑게 조직의 소수성 특성 때문에 상기 항체로 염색 할 수없는 또는 물 함유 용액에 포함. 마지막으로, 영상 데이터의 절대적인 크기를 분석하는 도전이다. 전체 쥐 뇌 세포의 해상도로 스캔하는 경우 예를 들어, 원하는 STR을 추적하고 정량화하는 것은 매우 어려울 것이다uctures (예를 들면, 신경 세포 나 교세포 네트워크) 및 자동화 된 방법으로 다른, 샘플을 비교합니다. 연구진은 새로운 청소 방법을 찾아 것을 목표로하면서 요약하면, (다양한 조직을 청소의 어려움이 큰 지역의 높은 해상도의 영상, 복잡한 데이터 분석) 위의 여러 가지 문제가 동시에 개선해야한다.

결론적으로, 3DISCO를 포함하여 최근에 개발 된 조직 청소 기술, 우아 그대로 기관의 고해상도 3D 영상이 지금 가능하다는 것을 보여줍니다. 이러한 방법을 사용하여, 과학자들은 그대로 기관에서 세포와 분자의 해부학 적 정보를 얻을 수 있습니다. 투명한 기관에 이러한 선구적인 3D 영상 연구는 복잡한 해부학 히스과 질병에 조직 / 장기의 분자 조직을 해독하는 연구자의 증가를 격려.

Disclosures

공개 아무것도 없다.

Acknowledgments

우리는 렉틴의 염료의 꼬리 정맥 주입으로 개선 된 혈관 영상의 경험을 공유하기위한 스크립트 나레이션, N. 비엔 - 리에 참여하기 위해, 원고의 중요한 읽기 B. 빙괼 (제넨 테크)을 C.는 Hojer 감사합니다, M Solloway (제넨텍 ) 췌장 영상에 사용 된 마우스의 경우. GFP-M 라인은 R. Littman의 (NYU)에 의해 J. Sanes (세인트 루이스의 워싱턴 대학) 및 CX3CR1-GFP 마우스에 의해 만들어졌습니다. 작품은 제넨 테크 사에 의해 지원됩니다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thy-1 GFP (GFP-M) mouse Can be obtained from Jackson.
CX3CR1 GFP mouse Can be obtained from Littman lab at NYU.
TgN(hGFAP-ECFP) mouse Can be obtained from Jackson.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Na2HPO4 Mallinckrodt 7917-16
NaH2PO4 Mallinckrodt 7892-04
2-2-2 Tribromoethanol Sigma T48402
2-Methyl-2-butanol Sigma 152463 Used to prepare Avertin solution.
Saline Braun
Tetrahydrofuran Sigma 186562-12X100ML
Dichloromethane Sigma 270997-12X100ML
Dibenzyl ether Sigma Sigma, 108014-1KG
Benzyl alcohol Sigma 305197-100ML
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML
Lectin FITC Sigma L0401-1MG
anti-CC10 Santa Cruz SC-9772 0.388888889
Heparin APP pharmaceuticals 504001 Used in perfusion.
Glass vials VWR 548-0554
Forceps FST 11251-10
Mini Rotator VWR 100498-878
Aluminum Foil Fisherbrand 01-213-104
100 ml Media Storage Bottles Kimax Media Bottles EW-34523-00
Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head Gilson, Inc F110701 and F117606
Microscopy slide VWR 48311-703
FastWell Grace Bio-Labs FW20
Cover slip Corning 2940-245
Glass petri dish Corning Pyrex 3160-101
Dental cement Lang Dental 1223PNK
Quantofix Peroxide Test Strips Sigma 37206
Amira with RT resolve microscopy module Visage Imaging image analysis software
Imaris Bitplane imaging image analysis software
ImageJ NIH freeware

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References

  1. Tuchin, V. Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. SPIE Press. (2007).
  2. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18, 166-171 (2012).
  4. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  5. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, (2012).
  6. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  7. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  9. Erturk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  10. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  11. Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome. Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).
  12. Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy. Cornea. 25, 497-498 (2006).
  13. Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).
  14. Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).
  15. Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice. Neurology. 2, 679-689 (2006).
  16. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  17. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten. S. Hirzel. (1903).
  18. Smith, C., et al. The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury. Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).
  19. Zotova, E., et al. Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization. Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).
  20. Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study. Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).
  21. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).
  22. Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
  23. Soderblom, C., et al. Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury. J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).
  24. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6, 131-133 (2009).

Comments

1 Comment



  1. Conventionally we are limited in the knowledge of biology and science due to lack of resources and researches. But now as we are moving in new era, researchers are getting great benefit to study developmental problems and disease. Now various medical devices are out there whose example is available at http://www.ilexmedical.com/products.php?act=cat helping researchers to look inside an organism and figure out what exactly went wrong and when. Researchers can thoroughly look tissues, organs and even an entire body without any trouble. Certainly such techniques are practical for many fields in biology!!!!

    Reply
    Posted by: Isabella L.
    March 25, 2015 - 8:13 AM

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