Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Hücresel pH Kalibrasyon Çözümleri 1. Hazırlanması

  1. Kalibrasyon için kullanılmak üzere 5 çözümler hazırlamak için beş ayrı 50 ml konik tüplere aşağıdaki bileşikler ekleyin:
    • NaCl (1 M NaCl 1 mi) (1 M NaCl, 10 ml H = 2 0 içinde 0.58 g)
    • KCl (6.75 1 M KCI mi) (1 M KCl, 10 ml H 2 0 içinde 0.75 g =)
    • Glikoz (1 M D-Glikoz 1 mi) (1 M D-Glucose = H 10 ml 1.80 g 2 0)
    • MgS0 4 (0.05 1 M MgSO 4 ml) (1 M, 10 ml MgSO H 2 0 içinde 4 = 1.20 g)
    • 20 mM HEPES (1 M HEPES 1 mi) (10 mi H 2 0 içinde 1 M HEPES = 2.38 g)
    • CaCl2 (1 M CaCI2 ve 0.05 mi) (10 mi H 1 M CaCl2 = 1.47 g 2 0)
      Çift distile H 2 O (GKD 2 O) tüm çözümler hazırlayın.
  2. GKD 2 O 35 ml solüsyonu ile, her tamamlamak ve böylece kadar bir manyetik karıştırıcı ile karıştırındevrim sisi elde edilir.
  3. 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ve 7.5 pH değeri elde etmek üzere 1 N KOH ya da 1 N HCI ile, her çözeltinin pH'ı ayarlayın. Daha sonra, 50 ml lik bir son hacme kadar deiyonize su ile hacim ayarlayın.
  4. Tedbir 5 nigerisin mg ve stok çözeltisi nigericin 10 mm hazırlamak için mutlak EtOH 670 ul ekleyin.
    Dikkat: nigericin son derece toksik ve büyük bir dikkatle (eldiven, gözlük ve maske) ile ele alınması gerekir. Nigericin tamamen eriyene kadar inversiyon yolu ile çözüm karıştırın.
  5. Her bir ayar çözeltiye 10 mM nigerisin (nihai konsantrasyon 10 uM) ve 0.05 ml ilave edilir. Nigericin hücre zar geçirgenliğini artırır ve hücre dışı K + kutuplaşma giderici bir konsantrasyonunun mevcudiyetinde hücre-içi ve hücre dışı pH'ın dengede neden olan bir iyonofor olduğunu.
  6. Kalibrasyon çözümleri 4 ° C'de 1 ay kadar saklanabilir

2.. Hücre Hazırlanması

  1. Biyolojik bir Safet altında35 mm y kapağı, tohum hücreleri x 10 mm kültür tabakları,% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotikler ile desteklenmiş büyüme ortamı içinde 2 ml. 24 saat sonra yaklaşık olarak% 50 izdiham sağlamak için gerekli hücre miktarı kullanın.
    Not: Deneylerde, biz HT-1080 hücre çizgisi ve plaka kültür kabı başına 1 x 10 5 hücre kullanın.
  2. Kalibrasyon için kullanılacak deney ve plaka 5 ek kültür tabakları için gereken kültür kaplarına sayısını belirler.
  3. En az 24 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde yer kültür tabakları.

PH-algılama Sondalar 3. Hazırlanması

  1. GKD 2 0 floresan prob pH 8-hydroxypyrene-1 ,3,6-trisülfonik asit, trisodyum tuzu (HPTS / pyranine) bir 1 M stok çözelti hazırlayın. Bu çözelti, oda sıcaklığında saklanan ve ışıktan korunmalıdır.
  2. Thereâ adlandırılan (and-6)-karboksil seminaphthorhodafluor asetoksimetil ester asetat (C-SNARF-01:00 - 1 mM 5 'lik bir stok çözelti hazırlayınfter SNARF-1) DMSO 1.76 ml Snarf-1, 1 mg çözülmesiyle. Iyice tekrarlanan pipetleme karıştırın. SNARF-1 çözeltisi, -20 ° C'de saklanan ve ışıktan korunmalıdır.

4. Hücre Etiketleme

  1. Onaltı saat canlı hücre görüntüleme önce, tam ortam 2 ml içeren her kültür tabağına 1M HPTS stok solüsyonu 2 ul (nihai konsantrasyon 1 mM) ekleyin.
  2. Inkübatör kültür yemekleri dönün. HPTS prob nedenle etiket prob pinositoza tarafından alınmalıdır organeller, hücre-laktobionat olduğunu. Bu durum HPTS hücre inkübasyonlar serum-takviyeli kültür ortamında gerçekleştirilir gerektirir.
  3. HPTS ile inkübasyondan sonra, steril PBS ile iki kez Hücreleri yıkamak ve en az 2 saat boyunca serumsuz ortamda 2 ml ekleyin. SNARF-1 ile inkübasyon serum prob ortaya çıkmasını önlemek, çünkü serum içermeyen ortam içinde yapılması gerekmektedir.
  4. AF elde etmek üzere bir 1 mM SNARF-1 ihtiyat çözeltisinden 10 ul ekleinal 5 uM arasında konsantrasyon ve hücreler loş ışık altında, 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübasyona izin verin. C-SNARF-1 konsantrasyon ve kuluçkalama süresi, hücre tipine bağlı olarak değişebilir.
  5. İnkübasyonun sonunda, steril PBS içerisinde iki kez yıkama ve hücreler serum içermeyen ortam 2 ml ekleyin.

PH Modülatörler 5. Ilavesi

  1. Yöntem hücrelerde pH değişiklikleri tespit edebilir olup olmadığını değerlendirmek için, hücre içi pH'ın modüle farklı reaktif de kullanılabilir:
    • Bafilomisin A1, V-ATPaz 5 spesifik bir önleyicisi
    • Na + / H + değiştirici izoformu 1 (NHE-1) 6
    • NH4CI, hücre içi pH 7 arttıran bir zayıf baz
    1. Yukarıda bahsedilen reaktiflerin stok çözelti hazırlayın:
      • Bafilomisin A1: 100 uM'lik bir stok çözeltisi elde etmek üzere, DMSO ile 160 ul bafilomycin A1 10 ug eklemek
      • EIPA: obtai metanolün 1.67 ml EIPA 25 mg eklemek50 mM'lik nihai konsantrasyon na
      • NH4CI: 1 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere GKD 2 O 10 ml amonyum klorürün 0.53 g çözülür.

      Not: Tüm stok solüsyonları -20 ° C sıcaklıkta saklanan ve ışıktan korunmalıdır bafilomycin A1 dışında 4 ° C'de tutulmalıdır.
    2. Ayrı bir kültür tabaklarında, aşağıda tarif edildiği gibi reaktifler ekleyin:
      • 100 uM bafilomycin A1 2 ul (son konsantrasyon 100 nM)
      • 50 mM EIPA 1 ul (nihai konsantrasyon 25 uM)
      • 1 M NH4CI (nihai konsantrasyon 20 mM), 40 ul
    3. 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe hücreleri
  2. Görüntü alma geçin.

6.. Canlı hücre Görüntüleme Mikroskop Özellikleri ve Toplama Ayarlar

  1. Kullanarak canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek 40X objektif bir spektral ters tarama konfokal microsco üzerine montepe motorize XY aşamada, çevre kontrollü (sıcaklık, nem, CO 2) evre inkübatör cam alt kültür yemekleri barındıran bir bölme ile donatılmıştır.
  2. Burada kullanılan konfokal alet (Olympus FV1000) ile donatılmıştır:
    • Bir diyot lazer 405 nm
    • A 40 mW argon lazer (458 nm, 488 nm, 515 nm)
    • Bir helyum neon lazer (543 nm)
    • Florit 10X objektif, NA0.4
    • Bir LUCPLFLN 40X objektif, NA0.60
    • Bir PLAPONSC PLANI APO 60X yağ objektif, NA1.4
    • Dikroik ayna DM 405/458/488/543
    • Bir SDM 560 ve SDM 640 dikroik filtreleri
    • A BA655-755 bariyer filtre
    • Bir ışın ayırıcı BS20/80
    • Görüntü elde etme ve analiz için veri analizi yazılımı,
  3. Sahne inkübatör 37 ° C'ye kadar ısıtılır ve mikroskop kurulduktan sonra, önce konfokal sahne görüntüleme odasına HPTS ve Snarf-1 ile inkübe bir kültür çanak yerleştirin.
  4. Ailgi alanı bulma ürkiye'de, yazılım satın alma ayarları Şekil 1 ayarlayın.
    • İki sanal kanal set kurmak.
    • 525 nm ve 570 nm 543 ve emisyon toplama SNARF-1 uyarım - - 600 nm 505 405 nm ve emisyon toplama HPTS uyarma karşılık ilk aşamasını başlatın.
    • 525 nm ve 640 de 543 nm ve emisyon toplama SNARF-1 uyarım - - 650 nm 505 458 nm ve emisyon toplama HPTS uyarma karşılık ikinci aşamasına.
    • Konfokal açıklık varsayılan olarak 175 um ayarlanır ve optimal diyafram elle 300 mikron ayarlanmış olması gerekiyor.
    • 0,4 mikron kalınlığında seri yatay optik bölümleri (800 x 800 piksel) istifleme Resmi atın.

NOT: 40X objektif aynı anda birkaç hücreleri gözlemlemek için yararlıdır ve organel görüntüleme için iyi çalışır. Ancak, uzaysal çözünürlüğü ve sinyal yoğunluğu Bette vardırR, bir 60X objektif kullanılarak yağ elde. Buna ek olarak, iki boyalar arasında bir uyarım veya emisyon cross-talk bulunmaktadır.

PH-algılama Problar 7. Kalibrasyon

  1. Kalibrasyon önce, daha önce HPTS ve Snarf-1 ile inkübe kültür çanak orta kaldırmak steril PBS ile iki kez yıkama ve daha sonra, beş kalibrasyon çözümlerden biri 2 ml ekleyin.
  2. Konfokal aşama odasına kültür tabağına yerleştirin.
  3. Aşağıdaki ayarlara göre zaman atlamalı görüntü elde geçin:
    1. Deney için görüntülerin ve aralık süresi sayısını ayarlayın.
      NOT: tipik olarak 30 dakika ila görüntüleri arasında, 1 dakika süre aralığı kullanınız.
    2. Her görüntünün edinimi arasındaki kapatmak için deklanşörü programlayın.
  4. Bir elektronik tablo yazılımı dakika başına floresan yoğunluğunu kaydedin ve floresan yoğunluğu sabit olduğu zaman belirler. 20 dk - Hücre içi pH 15 sonra genellikle kararlı.
  5. REPEAT kalan her kalibrasyon çözümü için yeni bir kültür çanak kullanarak 7,1-7,4 adımları.

8. Veri Toplama

  1. Kalibrasyon yapıldıktan sonra, alan başına 15-20 hücreleri içeren 4-5 rastgele seçtikleri alanlarda örnek verileri kazanır. İki görüntüleri her alan için elde edilir: HPTS etiketleme (kesecikler) ve SNARF-1 etiketleme (Sitosol) için saniye biri.
  2. Eşiğe (hücre dışı bir bölge) dijital hem de sondaların floresan görüntülerden çıkarılır. Ilgili saklanan görüntülerden Etiketli veziküller ve sitosol bir ikili maske kullanılarak seçilir. Her pH-algılama probu için, floresan yoğunlukları sayısal bir ölçek (0-4,095 gri seviye ölçeği) ölçülür. Organel ya da sitoplazmada tüm pikseller için bir ortalama yoğunluğu hesaplanır ve değerler floresan oranlarının hesaplanması için kullanılmaktadır.

9. Veri Analizi

  1. Çeşitli yazılım paketleri veri analizi için piyasada mevcuttur. YaniFluoview Yazılım.
  2. Aşağıdaki gibi, bir tablo, kayıt değerleri içinde ve floresan oranları hesaplanır: HPTS durumunda, R = (F 458 nm / F 405 nm), ve SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm durumunda .)
  3. Böyle GraphPadPrizmasındaki gibi bilimsel grafik yazılımı kullanarak veri çiziniz. Plot pH (X ekseni) bir fonksiyonu olarak floresans oranı (Y-ekseni) tasvir gerekir. Eğri uydurma, lineer olmayan regresyon kullanılarak elde edilir.
  4. Adım 8.2 'de tarif edildiği gibi örneklerin floresan şiddetlerini toplamak ve floresan oranları hesaplar. PH değerleri içine oranlarını dönüştürmek için kalibrasyon eğrileri kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücre içi ve endozomal / lızozomal hücre bölmelerine hem de pH değerinin ölçümü için aynı anda, rasyometrik floresan pH algılama Snarf-1 problar ve HPTS kullanılmıştır. HPTS endozomal / lizozom oran ölçer pH'ı ölçümünü sağlar, oysa SNARF-1 sitosolik bölmesi ile sınırlandırılmıştır. 16 saat HPTS ile hücre yükleme endozomlar / lizozomlarında 4 seçici yerelleştirme sağlar. PH algılama probları ile yüklü HT-1080 hücreleri kaydedilen floresans tipik bir örneği, Şekil 2A'da gösterilmiştir. HPTS endozomal ve lizozomal, her iki bölümü etiketler dair kanıt Alexa 546 ile konjüge edilmiş transferin (endozomlar) veya bir fluoresan lysotrophic prob (Lysotracker Deep Reddye) ile birlikte boyama ile elde edilmiştir. Veriler açık bir şekilde, her iki bölümü HPTS Şekil 2A lekeli gösterdi.

Yukarıda tarif edilen yöntem kullanılarak, canlı hücrelerde hücre içi pH değerleri kullanılarak belirlendiHer bir pH-duyarlı boya rasyometrik özelliklerine göre her bir prob Şekiller 2B ve 2C için bir kalibrasyon eğrisi,. Beş kalibrasyon çözeltiler pH birimi için floresan şiddetleri dönüştürmek için kullanılmıştır. Üç bağımsız kalibrasyon veriler her pH-algılama probu Şekil 2C bildirilmiştir. Her bir veri noktası HPTS ya da belirli bir pH değerinde Snarf-1 için 644/584 nm emisyon dalga boyları için 458/405 nm eksitasyon dalga boyunda floresan yoğunluğunun bir oranını temsil eder. Her iki prob için kalibrasyon eğrileri, en iyi bir denkleme Şekil 2C ile donatılmış bir doğrusal olmayan bir ilişki olduğunu göstermiştir. Hücre bölmesi ile bağlantılı pH değişiklikleri tespit etmek için olan yöntemin etkinliği NH4 Cl, hücre içi pH değerini arttırır zayıf bir baz, bafilomisin A1, V-ATPaz ve EIPA bir farmakolojik inhibitörü, bir NHE-kullanılarak canlı HT-1080 hücreleri içinde değerlendirildi 1 inhibitörü. NH 4 Cl tetiklenir entravsekiler ve sitokin6,35-7,10 ve 7,00-7,40 Solic pH artışları, sırasıyla 3A ve 3B Rakamlar. Bafilomisin A1 sitosolik pH değerini değiştirmeden endozomal ve lizozomal bölmeleri alkalizasyonunu neden oldu. Bunun aksine, EIPA işlemden geçmemiş hücrelerin de Şekiller 3A ve 3B'de 7.00 kıyasla 6,62 'lik bir pH-değerinin elde edilmesi sitosol asitlenme neden oldu.

Şekil 1
Şekil 1. Konfokal lazer tarama mikroskobu için satın alma ayarları Diyagramları. (A) İlk aşama, bir dikroik (DM405/488/543/633) ayna aracılığıyla aynı anda 543 ile 405 nm ve Snarf-1'de HPTS heyecanlandırmak için nm ayarlanır. Floresan emisyon ilk dikroik ayna (SDM560) kullanılarak 505-525 nm HPTS için kaydedilir. SNARF-1 floresan emisyon daha sonra bir bandpa ile izlenmektedir570-600 nm aralığında ss girişim filtresi. (B) İkinci faz, aynı zamanda HPTS floresan emisyonu (exc, 458 nm) ve SNARF-1 (exc, 543 nm) toplamak için ayarlanır. Her prob ilk aşamada kullanılan dikroik aynalar aracılığıyla toplanan için lazer ışını tarafından oluşturulan Probe uyarım bir ışın ayırıcı (BS20/80) ve floresan emisyon geçer. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2,. PH algılama problarının in situ kalibrasyonda. (A) HPTS ve HT-1080 fibrosarkom hücrelerinin, in SNARF-1 alt-hücresel lokalizasyon Örnek görüntüler. Üst görüntüleri SNARF-1 ise sitoplazmaya etiketler olduğunu göstermektedir HPTS-ilişkili olarak floresan entravsekiler lokalizasyonunu göstermektedir. HT-1080 hücreleri, Alexa 546 ile konjüge edilmiş transferin (5 ug / ml) ya da bir lysotrophic boya (sırasıyla Lysotracker Deep Reddye) (100 nM), 30 dakika boyunca inkübe edildi. Alt çizimin HPTS transferrin ve lysotrophic boya (60X) ile colocalizes olduğunu göstermektedir. Floresan yoğunluğunun (B) pH 6.0 ve pH 7.5 'da kalibrasyon çözümler ile 15 dakika inkübe edilen hücrelerde hem de pH-algılama problarının Örnek görüntüler. (C) İlişki HPTS ve Snarf-1 oranları pH bir fonksiyonu olarak kalibrasyon çözümleri kullanılarak belirlenir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
I nt Şekil 3. Modülasyonbafilomycin A1, EIPA ve NH4CI ile pH racellular. Pharmacological inhibitörleri (bafilomycin A1, EIPA) ve hücre içi pH düzenleyici NH4CI ve metodları için kullanılmıştır. Grafikler endozomal / lizozom bölgesi (A) ya da HPTS ve SNARF-1 ile yüklenir ve NH4CI varlığında veya yokluğunda (kontrol) içinde 30 dakika için kuluçkalanmıştır HT-1080 hücre sitoplazması (B) (kayıtlı pH değerleri gösterir 20 mM), EIPA (25 uM) ya da bafilomycin A1 (100 nM). Veriler, ortalama ± SEM (** p 0.005, *** p 0.0001) olarak temsil edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Farklı hücre bölümlerinde canlı hücre görüntüleme Sayısal pH ölçümü doğru dış zorluklara hücre yanıtlarında pH değişimleri ölçmek için gereklidir. Bununla birlikte, hala önemli engellerden biri kolayca ve özel hücre bölmeleri hedef etmektir. Bu bağlamda, bir kaç çalışmada, elektroporasyon ya da mikroenjeksiyon ile 8-10 hücrelere katılan bir hücre içi pH göstergesi olarak HPTS kullanımını sermiştir. Bu teknikler yani elektro hücrelere geniş zararlara yol açar, ve mikroenjeksiyon özel ekipman ve teknik beceri gerektirir, ciddi sakıncaları muzdarip. Ilgi, Hinton et al., Daha önce HPTS pinositoza bir işlem ile hücreler tarafından alınır ve Snarf-1 ve HPTS kombinasyonu / lızozomal bölmeleri 3 sitosol ve endozomal pH'ını izlemek için kullanılabileceğini olabilir bildirmişlerdir . Biz lizozomal / endozomal compartm pH değişimleri kaydetmek için bu özelliği kullanmışCanlı HT-1080 hücreleri ent. HPTS bu bölmesinde bulunur ve bu nedenle, güvenilir bir pH göstergesi olarak hizmet verebilecek Evidence florofor ile konjüge edilmiş transferin ile birlikte boyama ile elde edilmiştir, lızozomal / endozomal bölmesinin bir işaretleyici veya asidofilik boya ile çok lizozomlara Şekil etiketler bu 2.. Buna ek olarak, belirgin bir hücre bölmeleri hedef farklı hücre içi pH modülatörlerin kullanımı bafilomycin A1 özellikle sitoplazmik pH değiştirmeden entravsekiler pH artış olduğunu göstermiştir. Bunun aksine, esas olarak EIPA sitosolik pH değişir fakat amonyum klorit, her iki bölme arasında pH etkilenen ise endozomal ve lizozomal pH üzerine çok az veya hiç bir etkisi olmamıştır. Bu sonuçlar SNARF-1 ve HPTS aynı anda bu iki farklı hücre bölümlerinde pH değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ilişkin kanıtlar sağlamıştır.

Burada tarif edilen yöntemin önemli bir özelliği, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılmasıdır. Çalışmaların çoğu repohücre içi pH ölçümleri literatürde rted spectrofluorometry tarafından yapılmıştır. Kullanımı kolay ve hızlı veri toplama sağlamak için birlikte, bu yaklaşım, deney esnasında hücrelerin gözlenmesini izin vermez. Bu kalibrasyon adımı sırasında, asidik altında genişletilmiş inkübasyon (pH 5.5) veya alkalin (pH 8.0) şartları olumsuz çeşitli hücre türlerini etkiler ve apoptoz tetikleyebilir ki bizim deneyim olmuştur beri bu dezavantajı önemi olabilir. HT-1080 hücreleri durumunda, apoptosis ve böylece SNARF-1 (veriler gösterilmemiştir), pH değerine bağımlı floresans ile müdahale, kırmızı otofloresansı yol açar. Bu sorunu aşmak için, apoptoz ya da diğer hücre değişiklikler belirtileri gözlendi bir kalibrasyon her biri için ayrı bir kültür tabağı ve atıldı deneyler kullandık. PH ölçümleri için eş odaklı mikroskop kullanımı da kolay veri analizini yapar. Örneğin, konfokal floresan mikroskobu görüntülerin analizi apoptoti, eserler atmak için kullanılabilirc hücreleri ve arka plan gürültüsü, hesaplamaları daha kolay ve daha doğru adrestir.

Burada anlatılan yöntem, diğer yaklaşımlara göre birçok avantaj sunuyor olsa da, bazı sınırlamaları vardır. Bunlardan biri her sonda için gerekli farklı yükleme koşulları ile ilgilidir. HPTS ile ilgili olarak, boya pinositoza tarafından alınmalıdır. Bu sınırlama, hücreler pinositoz ve endositik bölmenin böylece etiketleme teşvik etmek için bir serum-takviye edilmiş ortam içinde uzun bir süre (örneğin 12 saat) boyunca muhafaza edilmelidir gerektirir. Bunun aksine, hücre geçirgenlik SNARF-1 serum içeren spesifik olmayan esterazlarla asetoksimetil ester (AM) hidroliz olasılığını önlemek için bir serumsuz ortam içinde inkübe edilmesi gerekmektedir. Bu kısıtlamalar, yükleme-uyumsuz hücre kültürü şartlarını gerektiren, deneysel protokolleri hariç olacaktır. Buna ek olarak, asidik ortama HPTS duyarlılığının önemli bir sınırlamadır. Şekil 2, f de gösterildiği gibi458 nM heyecanlı HPTS arasında luorescence şiddetleri arka plan değerlerine yakın oranlarda pH 6.0 veya daha düşük sıcaklıklarda az varyasyon göstermektedir. HPTS bu iç özelliği bu 4,0-5,0 gibi düşük pH değerlerine sahip lizozomlara gibi çok asitli hücre bölmeleri çalışmalarının durumunda dikkate alınması gereken. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, HPTS intraendosomal pH ölçmek için kullanılan olabilir sadece rasyometrik boyadır. Örneğin, yaygın olarak kullanılan boya lysosensor daha asidik lizozom bölgesi içinde çoğunlukla bölüm olacaktır. Endozomal bölme içinde bu boyanın bölümün ölçüde endozomal pH homeostasis değiştirilmiş hücrelerdeki entravsekiler pH ölçümü için büyük bir dezavantaj olan, bu veziküller içinde pH değerlerine bağlıdır.

Sonuç olarak, eş zamanlı olarak tek bir hücre içinde sitozolik ve endozomal pH değerlerini ölçmek için, burada bir yaklaşımı tarif eder. Bu hücrelerde pH homeostasisin çalışma için özellikle önemlidir nereyee mutasyonlar veya uyuşturucu endosemelerde efflux ve proton akını etkileyebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics