ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Laventie, B. J., Nesper, J., Ahrné, E., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins. J. Vis. Exp. (97), e51404, doi:10.3791/51404 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התקדמות ניכרת נעשתה בעשור האחרון לזיהוי והאפיון של אנזימים מעורבים בסינתזה (cyclases diguanylate) והשפלה (phosphodiesterases) של השליח השני ג-di-GMP. בניגוד לכך, מעט מידע זמין לגבי המנגנונים המולקולריים ומרכיבים תאיים שדרכו מולקולת איתות זה מסדיר מגוון רחב של תהליכים תאיים. רוב חלבוני מפעיל הידועים שייכים למשפחת פילץ או הידרדרו cyclases diguanylate או phosphodiesterases שויתר על קטליזה ואמצה פונקצית מפעיל. לכן, כדי להגדיר טוב יותר את רשת ג-di-GMP הסלולרי במגוון רחב של חיידקי שיטות ניסיוניות נדרשות לזהות ולאמת effectors רומן שאמין בתחזיות סיליקון ולהיכשל.

יש לנו לאחרונה פיתחתי תרכובת רומן לכידת ספקטרומטריית מסה (CCMS) המבוססת על טכנולוגיית ככלי רב עוצמה לביוכימית לזהות ולאפיין מחייבים חלבוני c-di-GMP. טכניקה זו כבר דווחה בעבר להיות ישים למגוון רחב של אורגניזמים 1. כאן אנו נותנים תיאור מפורט של הפרוטוקול שאנו מנצלים לחקור רכיבי איתות כזה. כדוגמא, אנו משתמשים Pseudomonas aeruginosa, הפתוגן אופורטוניסטי שבי ג-di-GMP משחק תפקיד קריטי בשליטת ארסיות וbiofilm. CCMS זיהה 74% (38/51) של הרכיבים הידועים או צפויים של רשת ג-di-GMP. מחקר זה מסביר את הליך CCMS בפירוט, וקובע אותה ככלי רב עוצמה ורב-תכליתי לזהות רכיבי רומן מעורבים באיתות מולקולה קטנה.

Introduction

ג-di-GMP הוא שליח שני מרכזי המשמש את רוב החיידקים לשלוט בהיבטים שונים של הצמיחה והתנהגותם. לדוגמא, c-di-GMP מסדיר התקדמות תא מחזור, תנועתיות והביטוי של exopolysaccharides וadhesins משטח 2-4. באמצעות התיאום של תהליכים כאלה ג-di-GMP מקדם היווצרות biofilm, תהליך אשר מזוהה עם זיהומים כרוניים של מגוון רחב של חיידקים פתוגניים 5. ג-di-GMP הוא synthetized על ידי אנזימים הנקראים cyclases diguanylate (DGCs) כי נמל תחום GGDEF קטליטי 4. DGCs כמה בעלי אתר מעכב שלמטה מסדיר את פעילות cyclase על ג-di-GMP מחייב. השפלה של c-di-GMP היא זרז על ידי שני סוגים שונים של phosphodiesterases (PDEs) חסה או EAL קטליטי או HD-גיפ תחום 6,7.

רוב חלבוני מפעיל הידועים כי ישירות לאגד ג-di-GMP שייך לאחד משלושה סוגים של חלבונים: קטליטיתחומים ברית פעילים GGDEF או EAL ותחומים פילץ, מתגים מולקולריים קטנים שעוברים שינויי קונפורמציה על ג-di-GMP מחייב 8. חלבוני DGCs, PDEs ופילץ מאופיינים היטב וניתן לחזות תחומיהם בסיליקון ויחסית בשלום. עניין מיוחד מתמקד כעת על זיהוי של סוגים חדשים של effectors ג-di-GMP. effectors חלק ג-di-GMP עם מוטיבים שונים מחייבים תוארה כזה לאחרונה כCRP Bcam1349 / FNR משפחת החלבון בBurkholderia cenocepacia או FleQ רגולטור תעתיק בפ aeruginosa 9,10. בנוסף, riboswitches ג-di-GMP ספציפי זוהו לאחרונה ומוצג לשלוט ביטוי גנים באופן c-di-GMP תלוי 11. המוטיבים ג-di-GMP המחייב של effectors שונה רק בצורה גרועה נשמרת ביצוע תחזיות bioinformatic של חלבונים כגון קשות. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו שיטה ביוכימית, המבוסס על השימוש בSPE ג-di-GMPבשילוב מגרש לכידת cific עם ספקטרומטר מסת 1,12,13.

יש לנו לאחרונה מהונדס מתחם לכידת ג-di-GMP trivalent רומן (CDG-CC, איור 1) 1. פיגום כימי זה מורכב מ: 1) מחצית ג-di-GMP שימש כפיתיון כדי ללכוד ג-di-GMP מחייב חלבונים, 2) קבוצה תגובתי UV-photoactivatable נהגה לחצות קישור CDG-CC לחלבונים מחויבים ו 3) ביוטין לבודד את החלבונים שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מצופה. CDG-CC ניתן להשתמש ישירות ובאופן ספציפי כדי ללכוד effectors ג-di-GMP מתערובת מורכבת של מקרו-מולקולות כlysates תא. מתחם לכידת מבוסס וגישות המבוססות פרוטאומיקה כימיות בעבר כבר דיווחו להיות ישים למגוון רחב של אורגניזמים, למשל Caulobacter crescentus, typhimurium serovar enterica סלמונלה וP. aeruginosa 1,14.

במאמר המתודולוגי הזה,אנו מספקים בתיאור מעמיק של הליך CCMS באמצעות תמציות של פ aeruginosa כדוגמא. מחקר זה קובע CCMS ככלי רב עוצמה ורב לזהות ביוכימית רכיבי רומן המעורב באיתות מולקולה קטנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת lysate

  1. לגדול P. תאי aeruginosa בLB לOD הרצוי.
    הערה: לקבלת הדרכה: להשתמש ≈ 100 מיליליטר תרבות / מדגם לתרבויות שלב נייחים ו -500 ≈ cultur מיליליטר / מדגם לתרבויות שלב יומן (600nm OD = 0.5).
  2. גלולה ידי צנטריפוגה למשך 20 דקות ב 5000 x גרם.
  3. ז Resuspend 0.5-1 של גלולה במאגר תמוגה 1 מיליליטר (6.7 מ"מ MES, 6.7 מ"מ HEPES, 200 מ"מ NaCl, 6.7 מ"מ כץ, 1 DDT מ"מ, pH 7.5) ולהוסיף מעכבי פרוטאז (מיני מלא, ללא EDTA) וכן כDNaseI.
  4. Lyse את התאים על ידי 3 מעברים דרך תא לחץ צרפתי, ב -20,000 psi (ראה חומרי רשימה).
  5. Ultra-צנטריפוגה lysate התא בg x 100,000 עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס.
  6. שמור את supernatant (עבור לשלב 2).
  7. שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר 1x חיץ תמוגה על ידי pipetting מעלה ומטה.
  8. Ultracentrifuge בg x 100,000 עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. Flash-להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי ולאחסן ב -20 ° C עד משמשים ללכידתו של חלבונים בממברנה (ראה שלב 3).

2. ההסרה של נוקלאוטידים חינם ג-di-GMP ואחרים (שבר מסיס בלבד)

  1. לשטוף טור desalting PD10 (חומרים לראות רשימה) עם 10 מיליליטר של חיץ תמוגה הקר.
  2. יוצקים את supernatant (≈ 1 מיליליטר) על PD10 על מנת להסיר נוקלאוטידים.
  3. Elute עם 4 מיליליטר חיץ תמוגה הקרה (500 צעדי μl).
  4. בחר את השברים מרוכזים ביותר, כפי שנקבע על ידי assay ברדפורד, וברכתם.

3. גלולה Resuspension וsolubilization (שבר ממברנה בלבד)

  1. Resuspend גלולה ב500 עד 1,000 μl של חיץ לכידת 1x (ללא חומר ניקוי) (ראה טבלה 1).
    הערה: גלולה קשה resuspend. מומלץ פיפטה עד ראשונה ומטה עם טפטפת לכ resuspend גלולה, אז להשתמש במזרק 27 G לhomogenize הפתרון טוב.
  2. הוסף 1% (w / v) n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
  3. דגירה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות (או O / N) על גלגל מסתובב.
  4. Ultracentrifuge בg x 100,000 עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. קציר supernatant.

מדידת ריכוז חלבון 4.

  1. למדוד את ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד (על ידי assay BCA לשבריר הקרום).
  2. הגדר את ריכוז החלבון הכולל עד 10 מ"ג / מיליליטר.

5. לכידה

  1. מערבבים 300 מיקרוגרם של חלבון עם 1 מ"מ מהתמ"ג, GTP, ATP, CTP, ו -20 μl של חיץ לכידת 5x (100 מ"מ HEPES, 250 מ"מ כץ, 50 מ"מ MgAc, גליצרול 5%, pH 7.5) (טבלת 1). התאם את נפח התגובה ל -100 μl עם H 2 O.
    הערה: הנפח הכולל כולל את הנפח של CDG-CC וג-di-GMP במקרה של שליטת התחרות (ראה שלב 5.3 וטבלה 2).
    הערה: כל הניסויים בוצעו בשנת 200 ורצועות l 12-צינור PCR (Thermo Scientific); # 181.
    הערה: לשבריר הקרום, לוודא תמיד לשמור על ריכוז DDM מעל ריכוז micelle הקריטי (0.01% w / v) עד שלב solubilization החלבון ב 8 M אוריאה (שלב 7.1).
  2. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על גלגל מסתובב.
  3. להוסיף 10 מיקרומטר CDG-CC (ריכוז סופי).
    הערה: כוללת שליטה ללא CDG-CC (המכונה בשם "שליטת חרוז"), ושליטה בתוספת 1 ​​מ"מ ג-di-GMP ("שליטת תחרות") (ראה טבלה 2).
    הערה: ריכוז CDG-CC יכול להיות מותאם 1-10 מיקרומטר.
  4. דגירה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות (O / N לשבריר הקרום) על גלגל מסתובב, בחושך.
  5. לאחר סיבוב קצר, קישור צולב על ידי הפעלה של מחצית התגובה של CDG-CC עם אור UV למשך 4 דקות, באמצעות CaproBox (ראה חומרי רשימה, λ = 310 nm, irradiance ≥10 mW / cm², מרחק מהמקור = 2 סנטימטר). הערה: להסיר את המכסה של הרצועות cross-linking לפני.
  6. הוסף 25 μl 5x חיץ לשטוף (5 M NaCl, 250 מ"מ טריס, pH 7.5) ו -50 μl של חרוזים מגנטיים streptavidin גם מושעים, בעדינות homogenize.
  7. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 על גלגל מסתובב.

6. שלבי כביסה

הערה: (מגנט: ראה חומרי רשימה). התחל עם לכידתו של חרוזים המגנטיים במכסה רצועת PCR, עם המגנט. לאחר מכן להחליף את רצועת PCR על ידי אחד חדש המכיל את פתרון הכביסה הבא. הסר את המגנט וresuspend את החרוזים, דגירה 2 דקות. ספין למטה ולהחליף את המכסה על ידי מכסה טרי.

  1. צעדי כביסה (חלק מסיס בלבד)
    1. לשטוף 6 פעמים ב 200 חיץ הכביסה μl 1x.
    2. לשטוף פעם אחת בכיתת ח HPLC 200 μl 2 O.
    3. לשטוף 6 פעמים ב 200 אצטוניטריל 80% μl.
    4. לשטוף 2 פעמים בH הכיתה HPLC 200 μl 2 O.
  2. צעדי כביסה (membraחלק ne בלבד)
    1. לשטוף 5 פעמים ב 200 חיץ הכביסה 1x μl DDM + 0.1%.
    2. לשטוף 2 פעמים ב 200 חיץ הכביסה 1x μl DDM + 0.05%.
    3. שטפי פעם ב -200 כביסה חיץ 1x μl DDM + 0.025%.
    4. שטפי פעם ב -200 כביסה חיץ 1x μl DDM + .0125%.
    5. לשטוף 3 פעמים ב200 μl 100 מ"מ ABC (אמוניום ביקרבונט, NH 4 CO 3) + 2 M אוריאה.

7. הכנת מדגם MS

  1. Resuspend חרוזים (ישירות במכסה) ב -20 μl 100 מ"מ ABC (100 מ"מ ABC + 8 M אוריאה לשבריר הקרום) ולהעביר לתוך צינורות 1.5 מיליליטר.
  2. חלק קרום רק: לדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, רועד ב 500 סל"ד.
  3. הוסף 0.5 μl 200 מ"מ TCEP (טריס (2-carboxyethyl) phosphine) ולדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, רועד ב 500 סל"ד. להתקרר עד 25 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף 0.5 μl של מוכנים טרי 400 מ"מ iodoacetamide ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, רועדt 500 סל"ד ובחושך.
  5. הוסף 0.5 μl 0.5 -acetyl-ציסטאין M N ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, רועד ב500 סל"ד.
  6. חלק קרום רק: להוסיף μl 1 ליס-C ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, O / N.
  7. הוסף 2 מיקרוגרם טריפסין ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת ב 500 סל"ד (לעטוף בParafilm כדי למנוע התייבשות).
    הערה: ניתן לאחסן הדגימות ב -20 ° C בשלב זה.
    הערה: חלק קרום רק: להוסיף 100 מ"מ ABC כדי להתאים את ריכוז האוריאה ל< 2 M לפני תוספת של טריפסין.
  8. בקצרה ספין למטה הצינורות ולאסוף החרוזים עם המגנט.
  9. מעביר את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש (חזור על שלב זה אם חרוזים הם עזבו).
  10. הוסף 5 μl 5% TFA (חומצת trifluoroacetic) + 1 μl 2 M HCl (15 μl 5% TFA + 5 μl 2 M HCl לשבריר הקרום).
  11. עמודות המצב C18 MicroSpin (קבוצת קן, מסצ'וסטס, ארה"ב) 150 עם μl אצטוניטריל (ספין 20 שניות ב2,400 סל"ד).
  12. שוהlibrate עמודות C18 2 פעמים 150 עם μl 0.1% TFA (ספין 20 שניות, 2,400 סל"ד).
  13. טען את מדגם ספין 2 דקות, 2,000 סל"ד.
  14. רענן הזרימה דרך על הטור ולחזור על שלב ספינינג (2 דקות, 2,000 סל"ד).
  15. לשטוף 3 פעמים 150 עם μl 0.1% TFA, 5 אצטוניטריל% (20 שניות, 2,400 סל"ד).
  16. קח צינור חדש וelute פעמיים עם 150 0.1% TFA μl, אצטוניטריל 50% (2 דקות, 2,000 סל"ד).
  17. ייבש את פפטידים במהירות-VAC.
  18. Resuspend ב -40 μl 98% 2 O, אצטוניטריל 2%, 0.15% חומצה פורמית H.
  19. 20 שניות Sonicate (מחזור דופק 0.5, 100% משרעת; ראה חומרי רשימה) וספין למטה 5 שניות, 12,000 סל"ד (צנטריפוגות benchtop). מערבולת 10 שניות, וספין למטה 5 שניות, 12,000 סל"ד. העבר בבקבוקון HPLC לניתוח LC-MS / MS.
  20. להקפיא ב -20 ° C.
    הערה: ניתן לאחסן הדגימות ב -20 ° C בשלב זה.

8. LC-MS / MS ניתוח

  1. equipp לרוץ ננו-LC (מערכות ננו-LC)ed עם טור RP-HPLC (75 מיקרומטר x 37 סנטימטרים) ארוז עם שרף C18 (Magic C18 AQ 3 מיקרומטר) באמצעות שיפוע ליניארית מ -95% (0.15% חומצה פורמית, אצטוניטריל 2%) ממס ו -5% B ממס ( אצטוניטריל 98%, 0.15% חומצה פורמית) עד 35% B ממס על 60 דקות בקצב זרימה של 0.2 μl / min.
  2. נתח את פפטידים באמצעות LC-MS / MS (ספקטרומטר מסת לחץ כפול LTQ-Orbitrap ולוס, מחובר למקור יון electrospray).
    הערה: מצב רכישת נתונים הוקם כדי להשיג רזולוציה גבוהה אחד MS לסרוק בחלק FT של ספקטרומטר המסה ברזולוציה של 60,000 FWHM אחריו סריקות MS / MS במלכודת היון ליניארי של 20 יונים אינטנסיביים ביותר. כדי להגביר את היעילות של ניסיונות MS / MS, מודוס הקרנת המדינה הטעון התאפשר להוציא שלא הוקצה וביחידים גובה יונים. ניתוק מושרה קנוניה היה מופעל כאשר המבשר עלה 100 ספירת יון. משך ההדרה הדינמי נקבע ל -30 שניות. זמן הצטברות היון נקבע ל -300 אלפיות שניים (MS) ו -50msec (MS / MS).

חיפוש 9. Database

  1. הורד את P. aeruginosa צמח השדה-מסד נתונים באמצעות דף הבית של צמח השדה (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  2. להמיר את ספקטרום MS הגלם לתוך קבצים גנריים קמע (MGF) באמצעות כלי MassMatrix ההמרה (http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py).
  3. חפש קובץ MGF זה באמצעות גרסת 2.3 קמע נגד פ aeruginosa צמח השדה-מסד נתונים המכילים קדימה וערכי חלבון הפוך דמה.
  4. לבצע בעיכול טריפסין סיליקון ואחרי ליזין וארגינין (אלא אם כן אחריו פרולין) לסבול שתי החמיצו שסעים בפפטידים tryptic באופן מלא.
  5. הגדר את הפרמטרים חיפוש באתר על מנת לאפשר methionines המושחר (15.99491 Da) כשינויים וcarboxyamidomethylation (57.021464 Da) של שאריות ציסטאין כשינוי קבוע משתנים. לקמע חיפושינוing סריקות ברזולוציה גבוהה, להגדיר את הסובלנות ההמונית מבשר על 15 עמודים לדקה ולהגדיר את הסובלנות ההמונית הבר 0.6 Da. לבסוף, קבע את החלבון FDR עד 1%.
  6. ייבא את חיפושי הקמע של פ ניסויי aeruginosa CCMS לפיגום (Proteomesoftware, גרסה 3), להגדיר את הפרמטרים להשגה קרוב FDR חלבון ל -1%, ולחלץ כוללת ספירת הרפאים.
  7. לקבלת תוצאות הנציג שהוצגו במאמר זה, השתמשנו במבחן T לזווג להשוות את הניסוי עם שליטת התחרות, ונחשבו ללהיטים עם ערך p להלן 0.1, ויחס ספירת רפאים מעל 2 (להתנסות ספירת רפאים / רפאים שליטת תחרות רק ספירה).
  8. הנתונים ניתן לייצא בכל תוכנת גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.

10. כימות ללא תווית

  1. לייבא את הקבצים הגולמיים לתוכנת Progenesis LC-MS (קוי Dynamics, גרסת 4.0).
  2. לבצע יישור LC-MS וזיהוי תכונה בsetti ברירת המחדלמהה.
  3. לייצא את הנתונים בפורמט MGF מProgenesis LC-MS.
  4. חפש את ספקטרום MS / MS באמצעות הקמע נגד פ צמח השדה מסד נתוני aeruginosa מכילים קדימה וערכי חלבון הפוך דמה.
  5. ייבא את תוצאות החיפוש באתר לProgenesis LC-MS ולמפות את הזדהויות פפטידים לתכונות MS1.
  6. להערכת נתונים (חישוב רמות משמעות, יחסים לקפל-שינוי) את תסריט ProteinSQAnalysis של SafeQuant שימש (סף: ערך q להלן 0.1, יחס ספירת רפאים מעל 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לזהות effectors ג-di-GMP רומן בפ aeruginosa באופן שיטתי בשימוש CCMS לנתח את השברים המסיסים וקרום של פ PAO1 aeruginosa מתח מתרבות שלב יומן (OD 600 = 0.5). כאן אנו לסכם ולדון בתוצאות נציג של מסע הדיג הזה. ארבעה העתקים ביולוגיים עצמאיים היו בשימוש. עבור כל ניסוי שני ריכוזי CDG-CC שונים שמשו (5 מיקרומטר ו -10 מיקרומטר). לחקור לסגולי, ניסויים בוצעו בנוכחותו או היעדריו של 1 ג-di-GMP מ"מ כמתחרה, ולבסוף, עם שליטת חרוז (כלומר ללא CDG-CC) (טבלה 1).

כאשר בעקבות השיטה שתוארה בפירוט לעיל (איור 2) שהפקנו רשימה של חלבונים שנתפסו בפורמט פיגום. מזהמים צפויים הוסרו. זה כלל חלבוני ריבוזומלי, streptavidin, טריפסין, אלבומין בסרום, קרטין וחלבונים אנושיים אחרים. החלבוןשיעור זיהוי שווא גילוי (FDR) נקבע ל -1% על ידי שימוש בתוכנת הפיגום, ונתוני יצוא להצטיין. מספר ההצטרפות מסופק על ידי פיגום ניתן להמיר את מספרי מוקד באמצעות פונקצית VLOOKUP ב- Excel קשורה לרשימה של P. מספרי מוקד aeruginosa. בשלב זה, רשימת החיסול כולל 768 חלבונים לחלק המסיס וחלבונים 433 לשבריר הקרום. עם זאת, רוב החלבונים אינם מועשרים באופן משמעותי בניסוי הלכידה. כך, חלבונים הסבירים שנתפסו אינו ספציפי (חיוביים בשליטת חרוז או רק בנוכחות של המתחרה ג-di-GMP) הוסרו. חישבנו יחס ספירת רפאים בין ניסוי הלכידה ושליטת התחרות וחלבונים נחשבים רק עם יחס גדול יותר משניים. בנוסף אנו מועסקים מבחן t מזווג על ספירת רפאים לספק מידת משמעות בין ניסוי הלכידה ושליטת התחרות, ולהגדיר סף מתירנית של 0.1. לבסוף, אנחנו נחשבים רק להיטים חזקים עם לפחות ארבעה פפטידים שזוהו בארבעת ניסויים לריכוזי מתחם 2 ללכוד נלקחו לגמרי. צריכים להיות מותאמים לקריטריונים אלה, בהתאם לצרכים ושימוש אומת וחזו ג-di-GMP מחייב חלבונים כסטנדרט כדי לקבוע את הסף. לאחר המיון, הרשימה צומצמה ל -76 להיטים לחלק המסיס, וחלבונים 133 לשבריר הקרום. זה כלל 13 מסיסים ו -21 חלבוני קרום מפ aeruginosa שידועים או צפוי לאגד ג-di-GMP (טבלה 2). חלבוני הקרום האחרים 63 מסיסים ו -112 הם חלבונים המשוערת חדשים ג-di-GMP מחייב שאינו מכילים אחד מתחומי c-di-GMP הידועים המחייבים. הלהיטים האלה יש עכשיו להיות מאומתים על ידי בדיקה הספציפית שלהם מחייבים את c-di-GMP.

במסך קודם שדגנו GlyA2 (PA2444), GlyA3 (PA4602) וGsp69 (PA1127) 1. 3 חלבונים אלה היו משובטים, ביטוי יתר, וטהרו מE. coli וניתן היה לאמת את להיקשר ג-di-GMP בניסויי קישור UV הצולב באמצעות 33 P שכותרתו 15 c-di-GMP. של ד K היו נחוש 1.0, 2.0 ו -6.9 בהתאמה מיקרומטר, מצביע על כך שניתן לזהות effectors אכן רומן באמצעות CCMS.

בנוסף לדוגמא נציג זה, השתמשנו CCMS עם תמציות של תאים שנקטפו מתנאי גידול שונים ועם ריכוזים שונים תאיים ג-di-GMP (n = 24). בסך הכל כבשנו 74% (38/51) של ידוע או צפוי P. רכיבי aeruginosa PAO1 ג-di-GMP איתות (24/32 חלבונים מסיסים, 14/19 חלבונים בממברנה). בהתחשב בעובדה שלפחות תשעה מהגנים הללו הוצגו להיות עיבד בתנאים מסוימים (סטרס חמצוני, חישת מניין, biofilms) 16 ושחלקם עשוי לא יחייב ג-di-GMP בכלל, תואר זה של כיסוי עשוי להיות קרוב לרוויה. זה יחד עם התצפית שרוב הרכיבים אלה were נתפס עם סגוליות גבוה (טבלה 2) בתוקף טוען כי טכניקה זו היא יעילה ורבה עוצמה.

איור 1
איור 1: מבנה כימי של מגרש לכידת ג-di-GMP.

איור 2
איור 2:. סיכום העבודה CCMS לאחר תמוגה המכנית נוקלאוטידים חופשי מוסרים באמצעות עמודת הדרת PD10. חלבונים מהשברים המסיסים או קרום מודגרת עם CDG-CC והתערובת חשופה לקרינת UV לחלבונים שנתפסו קישור צולב. צעדים של שטיפה קשה מתבצעים עם תרכובות חייבת streptavidin חרוזים מגנטיים מצופים. על-חרוז עיכול tryptic מספק פפטידים,אשר לאחר מכן הופרדו מהחרוזים וprotonated לזיהוי ספקטרומטר המסה שלהם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

איור 3
איור 3: Volcanoplots של פ חלבוני aeruginosa מועשרים באופן משמעותי על ידי CCMS. בעקבות ניתוח LC-MS / MS וכימות ללא תווית, חלבונים מוינו כפי שמתוארים בטקסט. יחס log2-עוצמה של הפפטיד מזוהה בין ניסויי הלכידה ותחרות היה מחושב זמם לעומת ערכים הנגזרים מניתוח משמעות (t-נתון שונה, שיטת Bayes אמפירית 17). חלבונים בתוך ספי המשמעות לערכי p-<0.05 יחסים ועוצמה> פי 1.5 הם indicatאד בקופסא אפורה. 4 משכפל לחלק המסיס () ואת החלק היחסי הקרום (B) בוצעו בנוכחות 10 מיקרומטר ג-di-GMP-CC, וניסוי התחרות עם 1 מ"מ ג-di-GMP. הנקודות המוקפות בעיגול מתאים לחלבוני c-di-GMP ידועים מחייבים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

לכידה: חיץ כימיה מקור ריכוז
חיידקי תמוגה מאגר 10x MES Sigma 67 מ"מ
pH 7.5 HEPES Sigma 67 מ"מ
NaCl שליrck 2 M
Na Acetate Merck 67 מ"מ
DTT Fluka 10 מ"מ
DNaseI רוש 20 U / ml
קוקטייל פרוטאז מונעי מלא רוש כרטיסיית 1/10 מיליליטר
ללכוד מאגר 5x HEPES Sigma 100 מ"מ
כץ Sigma 250 מ"מ
MgAc (נטול מים) Sigma 50 מ"מ
גליצרול Sigma 50% (V / V)
תמ"ג, GTP, ATP, CTP סיגמא 1 מ"מ כל אחד 5x חיץ לשטוף טריס-HCl Merck 1 M
(לחלק המסיס) EDTA Sigma 0.5 M
pH 7.5 NaCl Sigma 5 M
n-octyl-β-D-glucopyranoside Anagrade (Affymetrix) 42.5 מיקרומטר
5x חיץ לשטוף טריס-HCl Merck 1 M
(לשבריר הקרום) EDTA Sigma 0.5 M
pH 7.5 NaCl Sigma 5 M
כימיקלים אחרים: אמוניום ביקרבונט (ABC) Fluka
אוריאה Applichem
הכנת מדגם MS: חיץ כימיה מקור ריכוז
C18 מאגר TFA לְהַמאִיר 0.1% (V / V)
כיתה HPLC 2 O H 99.9% (V / V)
C18 הצפת B TFA לְהַמאִיר 0.1% (V / V)
אצטוניטריל Biosolve 49.9% (V / V)
כיתה HPLC 2 O H 50% (V / V)
C18 מאגרC TFA לְהַמאִיר 0.1% (V / V)
אצטוניטריל Biosolve 5% (V / V)
כיתה HPLC 2 O H 94.9% (V / V)
LC מאגר חומצה פורמית Sigma 0.15% (V / V)
אצטוניטריל Biosolve 2%
כיתה HPLC 2 O H 97.85%
כימיקלים אחרים: phosphine טריס (2-carboxyethyl) (TCEP) Sigma
iodoacetamide (רשות העתיקות) Sigma
-acetyl-ציסטאין N Sigma
Endoproteinase ליס-C Wako
טריפסין Promega

טבלת 1: מאגרי הרכב סיכום של מאגרי הרכב, כימיקלים וספקים.. ג-di-GMP-לכידת המתחם, ג-di-GMP (לשליטה התחרות), חרוזים מגנטיים מצופים streptavidin, חיץ לכידה, וחיץ כביסה כלולים בcaproKit.

שליטה ביד ניסוי לכידת שליטת תחרות
תמצית חלבון (10 מ"ג / מיליליטר) 30 μl 30 μl 30 μl
ג-di-GMP (10 מ"מ) 0 μl 0 μl 10 μl
נוקלאוטידים (10 מ"מ של כל נוקלאוטיד) 10 μl 10 μl 10 μl
5x חיץ לכידת 20 μl 20 μl 20 μl
H 2 O 42 μl 32 μl 22 μl
דגירה 30 דקות
ג-di-GMP ~ CC (מיקרומטר 100 המניות) 0 μl 5-10 μl 5-10 μl
ריכוזים סופיים: שליטה ביד ניסוי לכידת שליטת תחרות
ג-di-GMP ~ CC (מיקרומטר) 0 מיקרומטר 5-10 מיקרומטר 5-10 מיקרומטר
מתחרה ג-di-GMP (מיקרומטר) 0 מיקרומטר 0 מיקרומטר 1,000 מיקרומטר

טבלה 2:. תערובת תגובת לכידת סיכום של תערובת התגובה לשליטה חרוז (כלומר, ללא מתחם לכידה), ניסוי הלכידה (עם ג-di-GMP-CC), ושליטת התחרות המכילה עודף גדול של C- di-GMP. הריכוז הסופי ג-di-GMP-CC יכול להיות מותאם, ומוגדר, בדרך כלל בין 5 ל 10 מיקרומטר.

שם חלבון לוקוס ID ארכיטקטורת תחום ניסוי ניסוי / תחרות לכידה 1
) חלק מסיס CDG-CC = 5 מיקרומטר CDG-CC = 10 מיקרומטר
- PA4843 REC-REC-GGEEF * 14/0 14/0 13/0 11/0 14/0 12/0 14/0 14/0
WspR PA3702 REC-GGEEF * 9/0 9/0 10/0 9/0 11/0 10/0 11/0 11/0
- PA2567 GAF-SPTRF-EAL 8/0 4/0 9/0 0/0 7/0 3/0 8/0 8/0
- PA3353 פילץ 11/0 12/0 13/0 12/0 12/0 10/0 11/0 12/0
- PA0290 PAS-GGDEF 5/0 </ Td> 3/0 6/0 5/0 8/0 5/0 6/0 6/0
- PA5295 GDDEF-EAL 3/0 3/0 3/0 1/0 6/0 6/0 5/0 4/0
FimX PA4959 PAS-GDSIF-EVL 23/1 21/0 21/0 11/0 24/3 23/2 22/0 20/0
- PA4608 פילץ 3/0 3/0 3/0 0/0 3/0 2/0 3/0 3/0
- PA0012 פילץ 3/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 4/0 2/0
- PA2989 פילץ 1/0 2/0 1/0 1/0 2/0 3/0 3/0
- PA4324 פילץ 2/0 2/0 1/0 1/0 2/0 2/0 1/0 2/0
- PA3177 GGEEF 2/0 1/0 3/0 0/0 1/0 1/0 3/0 1/0
- PA4396 REC-DEQHF 0/0 1/0 4/0 0/0 1/0 0/0 5/0 1/0
- PA0169 GGEEF * 3/0 2/0 6/0 7/0 7/1 6/2 9/1 7/1
- PA2799 פילץ 1/0 0/0 2/0 0/0 0/0 0/0 3/0 1/0
- PA5017 PAS-GAF-PAS-ASNEF-EAL 1/0 2/0 1/0 0/0 1/0 3/2 0/0 0/0
- PA5487 GGEEF * 0/0 0/0 0/0 1/0 1/0 0/0 1/0 1/0
ב) חלק ממברנה CDG-CC = 5 מיקרומטר CDG-CC = 10 מיקרומטר
- PA2072 CHASE4-TM-PAS-GGDEF-EAL 13/1 25/0 27/0 19/0 36/0 36/0 31/0 23/0
- PA0861 TM-PAS-GGDEF-ELL 6/1 14/0 13/0 10/0 17/0 18/0 13/0 8/0
- PA3353 פילץ 6/0 10/0 9/0 7/0 10/0 10/0 6/0 5/0
- PA3343 5TM-GGDEF 3/0 7/0 7/0 4/0 12/0 10/0 7/0 7/0
- PA1181 MASE1-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-ELL 3/0 6/0 9/0 3/0 12/0 12/0 5/0 2/0
- PA0847 TM-CHASE4-HAMP-PAS-GGDEF 0/0 4/0 4/0 1/0 15/0 13/0 8/0 6/0
- PA0575 PBPb-TM-PAS-PAS PAS--PAS-GGDEF-EAL 1/0 7/0 6/0 3/0 10/0 10/0 6/0 2/0
yfiN PA1120 2TM-HAMP-GGDEF 2/0 4/0 3/0 3/0 5/0 4/0 3/0 1/0
- PA0290 PAS-GGDEF 1/0 4/0 3/0 2/0 1/0 5/0 1/0 2/0
- PA4929 7TMR: DISMED2-7TMR: DISMED2-GGDEF 2/0 4/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 1/0
Mora PA4601 TM-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL 3/0 7/0 7/3 5/0 9/0 10/0 5/0 4/0
- PA1851 5TM-GGDEF 1/0 2/0 1/0 2/0 4/0 3/0 1/0 1/0
- PA2870 TM-GGDEF 0/0 0/0 1/0 0/0 4/0 4/0 4/0 2/0
- PA3311 TM-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL 1/1 5/0 7/1 4/0 8/0 8/0 5/1 3/0
bifA PA4367 TM-GGDQF-EAL 1/0 2/0 1/0 2/0 1/0 2/0 2/1 1/0
- PA4608 פילץ 0/0 1/0 1/0 0/0 3/0 3/0 2/0 2/0
- PA4332 5TM-GGEEF 1/0 3/0 2/0 1/0 1/0 1/0 2/0 0/0
- PA0012 פילץ 1/0 1/0 1/0 1/0 1/0 1/0 1/0 0/0
- PA2989 פילץ 4/0 8/0 7/0 7/0 5/2 11/2 7/2 8/3
- PA1433 HAMP-RGGEF-KVL 0/0 0/0 0/0 0/0 1/0 1/0 1/0 1/0
- PA4843 REC-REC-GGEEF 0/0 0/0 1/1 1/0 0/0 1/0 1/0 0/0 * = GGDEF תחום המכיל אני אתר
מספר 1 של ספירת רפאים של פפטידים מזוהים

לוח 3: פ aeruginosa הידוע ג-di-GMP איתות רכיבים שנתפסו באופן ספציפי. חלבונים שזוהו מוינו ראשון כמתואר בטקסט. חלבונים מזוהים עם השם ומוקד שלהם המספר, ואנחנו מצביעים על הארכיטקטורה שלהם חזתה עם הכלי המקוון מסד נתונים צמח השדה נשמרים תחומים (n = 4, CDG-CC = 5 מיקרומטר או 10 מיקרומטר) כדי להראות את הספציפיות הלכידה והשחזור של השיטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טיפול מיוחד יש לנקוט במספר צעדים לפרוטוקול. ריכוז החלבון הוא פרמטר קריטי בריכוז של 10 מ"ג / מיליליטר להיות קשה להגיע כאשר תאים גדלים בתנאי גידול ספציפיים (למשל biofilms או גרסאות מושבה קטנות). לפיכך, resuspension גלולה צריכה להתבצע בהיקף נמוך של מאגר תמוגה. יכולים להיות ירידת ריכוזי חלבון עד 8 מ"ג / מיליליטר. בהשוואה לשיטה שפורסמה על ידי Nesper et al. 1, הוספנו נוקלאוטידים שונים לתגובת הלכידה כדי למזער הלכידה הלא ספציפית של חלבוני נוקלאוטיד מחייב. למרות התוספת של נוקלאוטידים שיפרה את הספציפיות, זה יכול באותו הזמן למנוע את לכידתו של חלבונים נקשרים נוקלאוטידים שונים באותו האתר. לדוגמא FleQ מפעיל, שהוצג לאחרונה לקשור ATP ו- c-di-GMP 18 היו דג במיוחד בהעדר ATP בניסוי הקודם שלנו 1, אבל לא יותר בדאתא שהוצג כאן בנוכחות עודפת של ה- ATP.

CDG-CC צריך להיות מוגן בזהירות מהאור. למרות שאור הסביבה מכיל רק חלק קטן של UV, מומלץ לשמור את מניית מתחם לכידה עטופה בנייר אלומיניום, כמו גם את תמהיל הלכידה לפני הפעלה על ידי קרינת UV. צעדי הכביסה הבאים יכולים להיות מאוד מחמירים כדי להגדיל את הספציפיות, כחלבונים שצולמו קוולנטית חייב CDG-CC. לגבי ניתוח LC-MS / MS, צריכים להתבצע הניסויים בסביבה חופשית קרטין נקייה. יתר על כן, יש להשתמש במאגרים תואמים HPLC, במיוחד לאחר צעדי הכביסה. רשימת המועמדים בדרך כלל מורכבת בין 300 ל 800 חלבונים (לארבעה פעמים), עם וריאציות נמוכות בין משכפל (ראה טבלה 2 כדוגמא).

פרמטרים מסוימים כמו החלבון וריכוז CDG-CC אולי צריכים להיות מותאמים בהתאם לאורגניזמיםnalyzed. מאז קלות ניתן לפספס חלבונים נמוכים בשפע או חלבונים לידי ביטוי רק בתנאים מסוימים, יש לנקוט זהירות בנוגע לתנאי התרבות המועסקים. בעיה זו ניתן להתגבר על ידי השוואת רשימת החיסול עם ATLAS חלבון הגלובלי שנאסף לאותם תנאי התרבות. לבסוף, אופטימיזציה של חומרי הניקוי יכולה להיות מאתגרת, כפי שהוא צריך להיות מותאם ביחס ליכולתה solubilize חלבוני קרום וגם צריך להיות תואם MS.

אחד צריך לזכור כי מולקולת ג-di-GMP של CC היא שינוי כימי, כפי שהוא מקושר באמצעות קבוצת 2'OH של ribose אחד לשאר הפיגום. שינוי זה יכול לשנות את יכולתה להיקשר לכמה effectors ובכך לספק שווא-שליליים. בהקשר זה ראוי לציין כי אנחנו אף פעם לא נתפסו חלבונים כי נמל תחום EAL אבל חוסר תחום GGDEF בפ aeruginosa, למרות שחלבוני EAL נתפסו במינים אחרים, כמו כיפת לידהcrescentus obacter. זה יכול להיות בגלל גישה עניה או זיקה נמוכה של CDG-CC לאתר הקישור, או לפירוק של CDG-CC על ידי חלבוני EAL. בניגוד לכך, מחייב חלבוני נוקלאוטיד רבים נתפסו עם סגוליות נמוך יחסית ו, במידה רבה, הם ככל הנראה חיוביים שגוי. אימות נוספת של ספציפי מחייב ג-di-GMP תוך שימוש בטכניקות כגון DRaCALA 20, UV cross-linking 15, fluorimetry סריקת ההפרש (DSF) 21, thermophoresis microscale (MST) 22, calorimetry הבידוד התרמי (ITC) 23-24 ... הוא כך צורך.

אפשר גם שכל חלק של מחצית ג-di-GMP של מתחם הלכידה הוא מושפל על ידי phosphodiesterases מlysate התא. זוהי אחת הסיבות מדוע ההליך צריכה להתבצע על 4 מעלות צלזיוס, ולכן מגבילה את פעילות phosphodiesterases לפני cross-linking.

Proceduמחדש יכול להיות מותאם למינים רבים של חיידקים, ושמש בהצלחה במשך 3 מיני חיידקים שונים עם שינויים 1 קטנים מאוד. טכנולוגית מגרש לכידת מבוססת יכולה להפחית שווא-תוצאות חיוביות באמצעות שטיפה יסודית (למשל 1 M מלח, ריכוז חומר ניקוי גבוה, 2 M אוריאה במקרה של חלבונים בממברנה, אצטוניטריל 80%), בהשוואה לשיטות אחרות שאינו מסתמכים על קשר הקוולנטי. בהתחשב בכך שאימות של מועמדים יכולה להיות תהליך מייגע וגוזל זמן, זה יתרון גדול לשיטות חלופיות כמו פרוטאומיקה הכימית מבוסס גישות 14.

שיטת וידאו מאויר זה קובע CCMS ככלי רב עוצמה ורב לזהות ולאפיין את רכיבי רומן מעורבים באיתות מולקולה קטנה. בעתיד, ניתן תהיה להשתמש תרכובות לכידה דומות מחסה קבוצות סלקטיביות אחרות ללכוד את החלבונים מעורבים באיתות מולקולה קטנה, כגון effectors ג-di-AMP הרומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
caproBox caprotec bioanalytics 1-5010-001 (220 V) UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMag caprotec bioanalytics included in the CCMS Starter Kit For easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKit caprotec bioanalytics upon request The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01 
12-tube PCR strips Thermo Scientific AB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeter Hielscher ultrasound technology UIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure Cell Thermo Electron Corporation FA-003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
  2. Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
  3. Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
  4. Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
  5. Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
  6. Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
  7. Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
  8. Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
  9. Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
  10. Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
  11. Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
  12. Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. (2010).
  13. Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
  14. Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
  15. Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
  16. Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
  17. Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3, (3), (2004).
  18. Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
  19. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
  20. Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
  21. DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
  22. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
  23. Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
  24. Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics