वर्णमिति जांच के कागज आधारित

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Bisha, B., Adkins, J. A., Jokerst, J. C., Chandler, J. C., Pérez-Méndez, A., Coleman, S. M., Sbodio, A. O., Suslow, T. V., Danyluk, M. D., Henry, C. S., Goodridge, L. D. Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water. J. Vis. Exp. (88), e51414, doi:10.3791/51414 (2014).

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Abstract

इस प्रोटोकॉल कृषि पानी की बड़ी मात्रा से Escherichia कोलाई, साल्मोनेला एसपीपी., और लिस्टेरिया monocytogenes की तेजी वर्णमिति पता लगाने (10 एल) का वर्णन करता है. इधर, पानी बैक्टीरिया ध्यान केंद्रित करने के लिए, एक प्लास्टिक कारतूस में संलग्न एक सरल धुंध फिल्टर से मिलकर जो बाँझ संशोधित मूर swabs (एमएमएस), के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है. निस्पंदन के बाद, लक्ष्य बैक्टीरिया के लिए गैर चयनात्मक या चयनात्मक enrichments एमएमएस में प्रदर्शन कर रहे हैं. लक्ष्य बैक्टीरिया के वर्णमिति का पता लगाने के लिए, enrichments तो बैक्टीरिया संकेत substrates के साथ एम्बेडेड कागज आधारित विश्लेषणात्मक उपकरणों (μPADs) का उपयोग assayed रहे हैं. प्रत्येक सब्सट्रेट μPAD पर नेत्रहीन (गुणात्मक पता लगाने) का पता लगाया जा सकता है कि रंग उत्पादों सृजन लक्ष्य संकेत बैक्टीरियल एंजाइमों के साथ प्रतिक्रिया करता है. वैकल्पिक रूप से, प्रतिक्रिया व्यक्त μPADs के डिजिटल छवियों आम स्कैनिंग या फोटोग्राफिक उपकरणों के साथ उत्पन्न और ImageJ सॉफ्टवेयर, अल का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता हैपरिणामों की अधिक उद्देश्य और मानकीकृत व्याख्या के लिए lowing. जैव रासायनिक जांच प्रक्रिया aforementioned बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की पहचान करने के लिए डिजाइन कर रहे हैं, एंजाइमों पृष्ठभूमि microbiota या वर्णमिति substrates की गिरावट द्वारा उत्पादित कुछ मामलों में एक झूठी सकारात्मक उत्पादन हो सकता है. इसलिए, एक अधिक भेदभावपूर्ण निदान का उपयोग कर पुष्टि की जरूरत है. बहरहाल, इस जीवाणु एकाग्रता और पहचान मंच एक प्रारंभिक जांच पद्धति के रूप में इसके प्रयोग को न्यायोचित ठहरा, (एकाग्रता, संवर्धन, और पता लगाने के लिए लगभग 24 घंटे के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं), सस्ती (0.1 CFU / एमएल पता लगाने सीमा) संवेदनशील, प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और तेजी से है कृषि पानी की सूक्ष्मजीवविज्ञानी गुणवत्ता के लिए.

Introduction

यह खाद्य जनित रोग एजेंटों खाद्य जनित रोग के बोझ को कम करने के लिए क्षेत्र आधारित सेटिंग्स में तेजी से और बेहतर पता चला रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. खाद्य जनित बैक्टीरियल रोगज़नक़ों का पता लगाने के लिए आम रणनीतियों जैव रासायनिक रूपरेखा, चयनात्मक और अंतर संवर्धन, प्रतिरक्षा अलगाव और पहचान है, और आणविक पता लगाने में शामिल हैं. हालांकि, इन तरीकों छिटपुट संदूषण के द्वारा बाधा उत्पन्न कर रहे हैं, परीक्षण किया गया छोटा सा नमूना आकार, खाद्य जनित रोगजनक बैक्टीरिया की अक्सर कम मात्रा, लंबे समय प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है, और / या क्षेत्र सेटिंग्स के लिए लागू नहीं कर रहे हैं. इसके अलावा, कई खाद्य matrices में यौगिकों का पता लगाने और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए निरोधात्मक हैं. माइक्रोबियल जांच की संभावना को बेहतर बनाने के क्रम में, संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (जैसे धोने के पानी और सिंचाई के पानी के रूप में) कृषि पानी के परीक्षण के ताजा उपज का एक बड़ा सतह क्षेत्र के साथ संपर्क में आता है या एक वाहन के रूप में कार्य करता है, जो या तो सुझाव दिया है कि पी के लिएroduce संदूषण खाद्य 1 के प्रत्यक्ष परीक्षण के लिए एक व्यवहार्य विकल्प है. फिर भी, प्रतिनिधि कृषि पानी के नमूने के कमजोर पड़ने के प्रभाव के साथ मिलकर अक्सर कम प्राकृतिक रोगज़नक़ बोझ रोगज़नक़ एकाग्रता के लिए नमूना तैयार करने के तरीकों आवश्यक बनाता है. इस तरह की एक विधि पानी (≥ 10 एल), पर्याप्त रोगज़नक़ एकाग्रता, और नीचे की ओर पता लगाने की रणनीति के साथ संगतता की बड़ी मात्रा के नमूने की आवश्यकता होगी.

संशोधित मूर swabs (एमएमएस) पानी में 2-4 की बड़ी मात्रा में (≥ 10 एल) से बैक्टीरिया ध्यान केंद्रित के लिए इस्तेमाल किया, सस्ती, सरल, और बीहड़ उपकरणों रहे हैं. एमएमएस एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर कैसेट के माध्यम से पंप पानी की बड़ी मात्रा के लिए एक मोटे फिल्टर के रूप में कार्य करता है जो धुंध से भरा एक प्लास्टिक कैसेट के होते हैं. एमएमएस संसाधित ली में सूक्ष्मजीवों सहित कार्बनिक और अकार्बनिक सामग्री कण है कि कब्जा जीवाणु एकाग्रता (≥ 10 गुना एकाग्रता) के एक गैर भेदभावपूर्ण विधि हैरुपये के नमूने. यह एमएमएस द्वारा लक्ष्य सूक्ष्मजीवों की एकाग्रता के उत्कृष्ट प्रभावकारिता सूक्ष्मजीवों गाद मिट्टी अंश या निलंबित ठोस 3 की जैविक सूक्ष्म समुच्चय से जुड़े होने की उम्मीद कर रहे हैं कि इस तथ्य से समझा जा सकता है कि संभावना है. एमएमएस के बीहड़ डिजाइन इस तरह के फिल्टर के clogging, बड़ी मात्रा प्रक्रिया करने में असमर्थता, उच्च मैलापन साथ फिल्टर के नमूने, और उच्च लागत के रूप में पानी से बैक्टीरिया का कब्जा है और एकाग्रता के लिए अन्य निस्पंदन तरीकों के साथ जुड़े अधिकांश कमियों पर काबू पाने के लिए अनुमति देता है. इन कारणों के लिए, एफडीए एमएमएस के पर्यावरण और उत्पादन से संबंधित नमूना संग्रह की प्रक्रिया 5 के लिए सरकारी प्रक्रियाओं में शामिल किया जा सिफारिश की है कि है.

इधर, एक विधि एकाग्रता, संवर्धन, और Escherichia कोलाई का पता लगाने, साल्मोनेला एसपीपी., और कृषि जल से लिस्टेरिया monocytogenes के लिए वर्णित है. एक एमएमएस BACT की एकाग्रता के लिए प्रयोग किया जाता हैeria, और भी चयनात्मक या गैर चयनात्मक जीवाणु संवर्धन के लिए एक पोत के रूप में कार्य करता है. बैक्टीरिया का पता लगाने कागज आधारित विश्लेषणात्मक उपकरणों (μPADs) 6 का उपयोग कर biochemically हासिल की है. μPADs fluidic नेटवर्क या फोटोलिथोग्राफी, inkjet मुद्रण, मुद्रण, और मोम 7-11 मुद्रण सहित तरीकों की एक किस्म का उपयोग मौके परीक्षण के रूप में निर्मित किया जा सकता है. Fluidic डिजाइन के उदाहरण नमूना केन्द्र में जमा है और बाद में नमूना या सब्सट्रेट केंद्र 12 में केशिका कार्रवाई द्वारा चैनल के बाहरी जलाशयों से खींच रहे हैं, जिसमें बाहर का जलाशयों या एक चैनल पैटर्न में बहती है, जहां वृक्ष के समान चैनल पैटर्न हो सकता है. इस प्रोटोकॉल के लिए, हम यहाँ परीक्षण सूक्ष्मजीवों का संकेत एंजाइमों द्वारा कार्रवाई की जा सकती है कि वर्णजनीय substrates के साथ imbedded 7 मिमी व्यास मोम कागज मौके सरणियों के लिए रोजगार के लिए चयनित किया है: Chlorophenol लाल β-D-galactopyranoside (CPRG) और 5 - ब्रोमो-4-क्लोरो 3 indolyl β-D-glucuronide (एक्स gluc)ई. द्वारा उत्पादित β-galactosidase और β-glucuronidase का पता लगाने के लिए कोली; साल्मोनेला एसपीपी द्वारा उत्पादित C8-esterase का पता लगाने के लिए 5 ब्रोमो 6 क्लोरो 3 indolyl Caprylate (मैजेंटा Caprylate).; phosphatidylinositol विशेष phospholipase सी का पता लगाने के लिए और 5 ब्रोमो-4-क्लोरो 3 indolyl-myo-inositol फॉस्फेट (एक्स InP) (पीआई-पीएलसी) एल द्वारा उत्पादित 6 monocytogenes. इस प्रकार, एक विशेष जीवाणु की मौजूदगी जटिल उपकरण या डेटा व्याख्या की आवश्यकता के बिना नेत्रहीन देखा जा सकता है. इन विशिष्ट लक्ष्य बैक्टीरिया के एंजाइम आधारित वर्णमिति μPAD पता लगाने की विशिष्टता और संवेदनशीलता पहले 6 पता लगाया गया है. इसके अलावा, इन लक्ष्य बैक्टीरिया के लिए एकीकृत एकाग्रता का पता लगाने विधि की संवेदनशीलता सूक्ष्मजीवों (अप्रकाशित डेटा और Bisha एट अल. 13) के पूर्व निर्धारित स्तर के साथ पानी की बड़ी मात्रा के spiking द्वारा मूल्यांकन किया गया था.

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Protocol

एमएमएस का उपयोग कृषि पानी की बड़ी मात्रा से बैक्टीरिया के 1. एकाग्रता

  1. एमएमएस तैयार
    1. 40 x 12 सेमी को मापने 4 प्लाई जाली का एक आयताकार खंड कट.
    2. 20 x 6 सेमी की एक आयत प्राप्त करने के लिए दोनों axes साथ जाली मोड़ो.
    3. लंबा लगभग 6 सेमी और व्यास में 3 सेमी की एक बेलनाकार झाड़ू फार्म को कसकर अपने लंबे अक्ष के साथ जाली रोल.
    4. एल्यूमीनियम पन्नी में जाली झाड़ू आटोक्लेव, कैसेट आटोक्लेव नहीं है. 10% घरेलू ब्लीच में 30 मिनट के लिए यह भिगोने से कैसेट शुद्ध करना, और एक सोडियम thiosulfate pentahydrate (ना 2 एस ओ 2 3 · 5H 2 हे) समाधान (50 मिलीग्राम / एल में 15 मिनट के लिए कैसेट भिगोने से अवशिष्ट क्लोरीन को निष्क्रिय ) बाँझ पानी में तैयार किया.
    5. एमएमएस कैसेट में झाड़ू डालें.
      नोट: एमएमएस कैसेट की गैर डिस्पोजेबल संस्करण इस्तेमाल किया जाता है, तो जाली के एक 4 प्लाई पत्र के साथ शुरू मुझे80 x 22 सेमी asuring, 40 x 11 सेमी करने के लिए इसे गुना और व्यास में लगभग 11 सेमी लंबा और 6 सेमी एक सिलेंडर के लिए फार्म का रोल.
    6. एमएमएस इकट्ठे.
    7. ट्यूबिंग पूरी तरह spigots का पालन करता है, यह सुनिश्चित करना एमएमएस के दोनों किनारों पर spigots के लिए vinyl ट्यूबिंग देते हैं, और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप में ट्यूबिंग तय कर लो. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के ट्यूबिंग नदी के ऊपर नमूना लेने के लिए पर्याप्त लंबाई की है कि सुनिश्चित करें.
  2. जीवाणुओं की एकाग्रता
    1. उच्च गति से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप चलाकर कृषि पानी का नमूना कम से कम 10 एल.
    2. नमूने के पूर्ण होने पर, पानी के नमूने से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप प्रवेश को वापस लेने और कोई प्रवाह पानी एमएमएस बाहर निकलने मनाया जाता है जब तक पंप चलते रहेंगे.
    3. एक कई गुना एक ही समय में कई नमूने को चलाने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो प्रत्येक एमएमएस का प्रवाह जमा है, और 10 एल एक भी एमएमएस के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है जब कि विशेष रूप से एमएमएस के लिए वाल्व बंद करने और पंप चलते रहेंगे.
      1. मैं नमूना जबपूरा है,, कृषि जल से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप प्रवेश को वापस लेने के लिए कई गुना के सभी वाल्व खुला है, और कोई प्रवाह पानी MMSs बाहर निकलने मनाया जाता है जब तक पंप चलते रहेंगे.
  3. एकाग्रता सभी MMSs के लिए पूरा हो चुका है, ध्यान से एमएमएस spigots से विनायल ट्यूबिंग हटाने और एमएमएस के दोनों किनारों पर spigots टोपी. कसकर छाया हुआ एमएमएस संवर्धन मीडिया जोड़ने से पहले करने के लिए 12 घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है.

2. एमएमएस संवर्धन और नमूना तैयार

  1. समृद्धि
    1. एमएमएस के ढक्कन खोल देना, और aseptically उपयुक्त बाँझ संवर्धन शोरबा के 20 मिलीलीटर जोड़ें. प्रत्येक चयनात्मक संवर्धन के लिए एक एमएमएस का प्रयोग करें. वैकल्पिक रूप से, एक ही नमूने में सभी तीन लक्ष्य बैक्टीरिया का प्रचार करने के लिए एक गैर चयनात्मक संवर्धन करते हैं.
      नोट: एमएमएस कैसेट की गैर डिस्पोजेबल संस्करण इस्तेमाल किया जाता है, तो aseptically कैसेट से जाली फिल्टर निकालें और विज्ञापन से पहले एक बाँझ बैग में जगहउपयुक्त संवर्धन मीडिया की डिंग 225 मिलीलीटर.
      1. ई. के संवर्धन के लिए कोली, vancomycin हाइड्रोक्लोराइड के 8 मिलीग्राम / एल के साथ पूरक बफर peptone पानी (BPW) का 20 मिलीलीटर जोड़ें.
      2. साल्मोनेला एसपीपी के संवर्धन के लिए., BPW की 20 मिलीलीटर साल्मोनेला पूरक (4 मिलीग्राम / एल) के साथ पूरक जोड़ें.
      3. एल के संवर्धन के लिए monocytogenes, vidas यूपी लिस्टेरिया (एलपीटी) शोरबा के 20 मिलीलीटर जोड़ें.
      4. एक भी एमएमएस का उपयोग करके सभी तीन सूक्ष्मजीवों के लिए एक साथ गैर चयनात्मक संवर्धन के लिए, यूनिवर्सल preenrichment शोरबा (UPB) का उपयोग करें.
    2. वापस कसकर पर एमएमएस के ढक्कन भाड़ में. Spigots कस संवर्धन दौरान फैल और संभव संक्रमण से बचने के लिए छाया हुआ है कि सुनिश्चित करें.
    3. 200 rpm पर एक मिलाते इनक्यूबेटर में अप करने के लिए 18-24 घंटे के लिए एमएमएस सेते हैं. ई. के लिए 42 डिग्री सेल्सियस का प्रयोग करें कोलाई और साल्मोनेला एसपीपी. चयनात्मक enrichments. एल के लिए 30 डिग्री सेल्सियस का प्रयोग करें monocytogenes चयनात्मक संवर्धन, और उपयोग 37 & #176, गैर चयनात्मक संवर्धन के लिए सी.
  2. नमूना तैयार
    1. ऊष्मायन पूरा कर लेने पर, इनक्यूबेटर से एमएमएस को दूर spigots से एक खुलना, और धीरे से एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में लगभग 0.5 मिलीलीटर बांटना. वैकल्पिक रूप से, बाहर एमएमएस और पिपेट 0.5 रातोंरात संवर्धन के मिलीलीटर खोलना.
      नोट: एमएमएस कैसेट की डिस्पोजेबल नहीं संस्करण इस्तेमाल किया जाता है, तो बैग से संवर्धन के 0.5 एमएल पिपेट.
    2. ई. के वर्णमिति विश्लेषण के लिए कोली चयनात्मक संवर्धन, या गैर चयनात्मक enrichments के विश्लेषण के लिए, 5 डब्ल्यू, एक जांच sonicator इस्तेमाल करते हैं 20 सेकंड के लिए 22 kHz पर संवर्धन के 0.5 मिलीलीटर sonicate.

ΜPADs में 3. तैयार करना और वर्णमिति Substrates के embedding

  1. प्रत्येक परीक्षण नमूना और लक्ष्य के लिए पर्याप्त μPADs तैयार करें. ई. का पता लगाने के लिए कोली साल्मोनेला एसपीपी के लिए, CPRG और एक्स gluc μPADs तैयार करते हैं. पता लगाने एम सी μPADs तैयार करते हैं, और एल के लिए monocytogenes पता लगाने एक्स InP μPADs तैयार करते हैं.
    1. HEPES बफर तैयार वर्णमिति substrates के लिए [0.1 एम 0.1% गोजातीय सीरम albumin (BSA) के साथ HEPES] और इस्तेमाल किया जा रहा है कि सब्सट्रेट के अनुसार बफर का पीएच को समायोजित: CPRG या एक्स gluc की तैयारी के लिए 7.5 पीएच, एम सी के लिए पीएच 9, और एक्स InP के लिए 7 पीएच.
    2. पीएच में substrates के शेयर समाधान तैयार 3 मिमी (CPRG), 62.5 मिमी (एक्स gluc), 15 मिमी (एमसी), 100 मिमी (एक्स InP) की सांद्रता में HEPES बफर समायोजित. प्रकाश से शेयर समाधान को सुरक्षित रखें.
    3. तब प्रत्येक सब्सट्रेट शेयर समाधान के 24 μl के साथ μPAD microspot बैठाना, एक बाँझ पेट्री डिश के अंदर μPADs रखें.

4. पहचान और डेटा विश्लेषण

  1. खोज
    1. एक पेट्री डिश में निहित प्रत्येक उचित μPAD microspot को समृद्ध नमूना के 6 μl जोड़ें.
    2. पेट्री डिश पर कवर वापस प्लेस और Parafilm के साथ इसे सील.
    3. नमूना सेतेmicrospots का रंग विकास और सुखाने के लिए अनुमति देने के लिए ऊपर से 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर μPAD साथ.
  2. परिणाम के दृश्य परीक्षा
    1. ΜPADs के रंग में परिवर्तन की साधारण दृश्य निरीक्षण से पता लगाने के कार्य करें.
      नोट: आमतौर पर, निश्चित रंग परिवर्तन का उत्पादन है कि मजबूत प्रतिक्रियाओं आगे स्पष्टीकरण के लिए जरूरत नहीं रहेगी चाहिए और सकारात्मक विचार किया जाना चाहिए जो संवर्धन के 18-24 घंटा, निम्नलिखित उम्मीद कर रहे हैं.
    2. एक ई. की उपस्थिति निर्धारित लाल बैंगनी और नीले, हरे को बेरंग से एक्स gluc परिवर्तन के साथ imbedded microspots के लिए पीले रंग से CPRG परिवर्तन के साथ imbedded microspots देख कर कोलाई सकारात्मक नमूना.
    3. एक एल की उपस्थिति निर्धारित बेरंग से इंडिगो को एक्स InP परिवर्तन के साथ imbedded microspots देख द्वारा सकारात्मक नमूना monocytogenes.
    4. एक साल्मोनेला एसपीपी की उपस्थिति निर्धारित. कर्नल से एम सी परिवर्तन के साथ imbedded देख microspots द्वारा सकारात्मक नमूनाबैंगनी चमकीला गुलाबी रंग को orless.
  3. सॉफ्टवेयर एडेड डेटा विश्लेषण
    नोट: स्पष्ट रूप से कमजोर प्रतिक्रियाओं सकारात्मक या नकारात्मक हो यह निर्धारित करने और परिणामों की एक अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण सक्षम करने के लिए आयोजित.
    1. ΜPADs के लिए पूरी तरह से सूखे की अनुमति दें.
    2. एक फ्लैट बिस्तर स्कैनर का उपयोग कर μPAD स्कैन करें.
    3. छवि पर कार्रवाई करने ImageJ सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
      1. मुख्य मेनू (या प्रेस "CLT + O") पर "फाइल" टैब के अंतर्गत स्थित ImageJ में विश्लेषण किया जा करने के लिए स्कैन छवि "खुला".
      2. ("CLT + + मैं बदलाव" या प्रेस) मुख्य मेनू पर "संपादित करें" टैब के अंतर्गत स्थित "उलटा" का चयन छवि पलटना.
      3. मुख्य मेनू पर "विश्लेषण" टैब का उपयोग करें और विश्लेषण की सूचना माप का चयन करने के लिए "सेट माप ..." का चयन करें.
      4. , यकीन है कि "मीन ग्रे तीव्रता," "सीमा तक सीमित है कि" और "प्रदर्शन" लेबल बक्से रहे हैंजाँच की, और प्रेस "ठीक है." यह सॉफ्टवेयर चयनित प्रत्येक क्षेत्र का विश्लेषण करती है कि कैसे सेट करता है और कैसे यह यह रिपोर्ट.
      5. तुम्हारे भीतर उपाय चाहते हैं कि क्षेत्र की रूपरेखा कि एक चक्र आकर्षित करने के लिए "ओवल" उपकरण का उपयोग करें.
      6. "विश्लेषण" टैब के अंतर्गत "उपाय" (या प्रेस "CLT + एम") का चयन करें. सॉफ्टवेयर परिभाषित क्षेत्र के भीतर औसत ग्रे तीव्रता मापने के लिए और नकल की है और आगे के विश्लेषण के लिए उत्कृष्टता के लिए चिपकाया जा सकता है कि एक पॉप अप स्क्रीन में यह रिपोर्ट करेंगे.
        नोट: अधिक सटीक विश्लेषण के लिए, प्रत्येक नमूने की कम से कम दो तकनीकी replicates किया जाना चाहिए.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, एमएमएस का उपयोग बैक्टीरिया की एकाग्रता (चित्रा 1) के लगभग 15-20 मिनट के भीतर किया जा सकता है. दो अलग घटकों में acrylonitrile butadiene styrene (एबीएस) से निर्माण में एमएमएस; एक बेलनाकार जाली झाड़ू डाला जाता है जो में एक एकीकृत पानी की कल विधानसभा (चित्रा 1 ए) के साथ दोनों एक ढक्कन और एक कारतूस. दोनों घटकों फिर एक साथ एमएमएस (चित्रा 1 बी) के गठन खराब कर रहे हैं. एमएमएस आधारित प्रसंस्करण क्षेत्र सेटिंग में केंद्रित होने के लिए नमूने के लिए अनुमति देता है, एक बैटरी संचालित क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से प्रेरित है. एमएमएस एकाग्रता, चयनात्मक enrichments (18-24 घंटे), और μPADs युग्मन; कृषि पानी आसानी से, (लगभग 24 घंटे) तेजी से हो, और सस्ते में ई. सहित महत्वपूर्ण खाद्य जनित रोगजनकों और सूचक सूक्ष्मजीवों के लिए जांच कर सकते हैं कोलाई, साल्मोनेला एसपीपी., और एल monocytogenes. इस प्रोटोकॉल के साथ, इन लक्ष्य बैक्टीरिया का पता लगाने के किया जा सकता है0.1 CFU / एमएल के रूप में कम के स्तर पर एड. μPAD assays वर्णमिति substrates के साथ (चित्रा 2) प्रतिक्रिया है कि बैक्टीरिया संकेत एंजाइमों का पता लगाने के आधार पर कर रहे हैं. ई. का पता लगाने assays कोली, लेकिन नहीं ई. कोलाई O157: H7, एक नीली हरी उत्पाद (2A चित्रा) का उत्पादन. इसी तरह, ई. के बहुमत का पता लगाता है कि परख कोलाई उपभेदों एक लाल बैंगनी प्रतिक्रिया उत्पाद (चित्रा 2B) पैदा करता है. साल्मोनेला एसपीपी का पता लगाने assays. (चित्रा -2) और एल monocytogenes (चित्रा 2 डी) क्रमश: बैंगनी चमकीला गुलाबी और इंडिगो रंग का उत्पादन. परीक्षण नेत्र (गुणात्मक) से व्याख्या की जा सकती है, और दृश्य निर्णय आम तौर पर सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों के बीच भेदभाव करने के लिए संतोषजनक रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, डिजीटल छवियों अधिक उद्देश्य और मानकीकृत डेटा व्याख्या (3B चित्रा) के लिए अनुमति देने के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर (चित्रा 3) का उपयोग चालाकी से किया जा सकता है.


चित्रा 1. संशोधित मूर झाड़ू (एमएमएस) कैसेट. (ए) disassembled एमएमएस. एमएमएस acrylonitrile butadiene styrene (एबीएस) से एक 3 डी प्रिंटर में उत्पादन किया है और तीन मुख्य घटक होते है: (4 प्लाई मुड़ा हुआ) एक बेलनाकार जाली झाड़ू डाला जाता है और एक साथ छाया हुआ है, जो में शामिल एक पानी की कल विधानसभा के साथ एक कारतूस एक एकीकृत पानी की कल विधानसभा होने ढक्कन. (बी) इकट्ठे एमएमएस.

चित्रा 2
चित्रा 2. जीवाणु-संकेत वर्णमिति प्रतिक्रियाओं. Substrates (एक्स gluc, CPRG, एम सी, और एक्स InP) μPADs की microspots में imbedded बैक्टीरिया संकेत एंजाइमों के साथ प्रतिक्रिया (&# 946; एक वर्णमिति परिवर्तन का उत्पादन करने वाली glucuronidase, β-galactosidase, C8-esterase, और पीआई-पीएलसी). (ए) एक सकारात्मक एक्स gluc प्रतिक्रिया सामान्य ई. का एक संकेत है कोली, लेकिन नहीं ई. कोलाई O157: H7; (बी) एक सकारात्मक CPRG प्रतिक्रिया एक संकेत है कि ई. कोली मौजूद हैं; (सी) एक सकारात्मक एम सी प्रतिक्रिया साल्मोनेला एसपीपी की उपस्थिति का संकेत है.; (डी) और एक सकारात्मक एक्स InP प्रतिक्रिया एल की उपस्थिति का संकेत monocytogenes.

चित्रा 3
.. (-) और धनात्मक (+) परीक्षण चित्रा 3 दृश्य और ImageJ बैक्टीरिया संकेत वर्णमिति μPAD परीक्षण का विश्लेषण करती है एक एक नकारात्मक दोनों के साथ प्रत्येक परख के लिए डिजीटल वर्णमिति छवियों को दिखाता है. नकारात्मक परीक्षण बैक्टीरियल तकनीक और नवीनता के lysates का उपयोग कर प्रदर्शन किया गयातों कि लक्ष्य बैक्टीरिया की lysates या enrichments साथ लक्ष्य एंजाइमों और सकारात्मक परीक्षण सांकेतिक शब्दों में बदलना नहीं है. (1) असंशोधित छवियों को छान डाला. (2) स्कैन छवियों ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर greyscale में कनवर्ट किया, और (3) रंग ग्रे तीव्रता के बाद व्याख्या के लिए छवियों उलटा. (4) (एक उदाहरण microspot पीले तीर और मंडली ने संकेत दिया है) μPAD की प्रत्येक microspot भीतर ImageJ का उपयोग मापा जवाब ग्रे तीव्रता. बी प्रत्येक वर्णमिति μPAD सकारात्मक और नकारात्मक परीक्षण के लिए (ImageJ द्वारा निर्धारित) औसत ग्रे तीव्रता से पता चलता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल ई. का पता लगाने के लिए एक एकीकृत विधि का वर्णन कोलाई, साल्मोनेला एसपीपी., और एल कृषि पानी में monocytogenes. इधर, कृषि पानी की बड़ी मात्रा से बैक्टीरिया का एमएमएस एकाग्रता (10 एल), जीवाणु संवर्धन के साथ मिलकर, और बैक्टीरियल-संकेत वर्णमिति पता लगाने μPADs उपयोग कर रहा है. बैक्टीरिया 10 गुना ध्यान केंद्रित करते हुए एमएमएस प्रक्रिया के पानी के नमूनों में उच्च कण सामग्री के साथ सामना कर सकते हैं, मजबूत और न्यूनतम प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए काफी सरल है, और न्यूनतम लागत के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है. एक जीवाणु संवर्धन कदम शामिल करके, जीवित बैक्टीरिया का पता चला रहे हैं और विधि की संवेदनशीलता बहुत बढ़ाया है. संवर्धन assayed हो लक्ष्य amplifies, और चयनात्मक विकास मीडिया के साथ संयुक्त, झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए योगदान कर सकता है कि नमूने में अवांछित microbiota विकास कम कर देता है. अंतिम पता लगाने के लिए एक सरल प्रदान जो μPADs, साथ प्रदर्शन किया है,महत्वपूर्ण खाद्य जनित रोगजनकों के लिए स्क्रीन का हल व्याख्या करने के लिए प्रभावी और आसान लागत. एमएमएस एकाग्रता, रात भर संवर्धन, और वर्णमिति पता लगाने सहित पूरी प्रक्रिया में, एक दिन के भीतर किया, और 0.1 CFU / एमएल के रूप में कुछ स्तरों पर जीवाणु संक्रमण का पता लगाता जा सकता है.

विधि को सरल और संदूषण की संभावना को कम करने, एमएमएस जीवाणु संवर्धन के लिए एक कंटेनर के रूप में प्रयोग किया जाता है. प्रक्रिया के इस संवर्धन जोड़ना, संवेदनशीलता, विशिष्टता बढ़ जाती विधि में लचीलापन कहते हैं. केवल तीन चयनात्मक enrichments यहाँ का उपयोग किया गया है, बैक्टीरिया के लिए सुधार enrichments विकसित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम वर्णमिति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल संवाददाता एंजाइमों का उत्पादन बढ़ाने के लिए संवर्धन मीडिया में विशिष्ट inducers शामिल करने की संभावना तलाश रहे हैं.

रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया μPADs सरल करने के लिए उपयोग के रूप में छोटा रूप में $ 0 लागत कि एक स्थान सरणियों हैंपूर्व वर्णमिति संवाददाता सब्सट्रेट के अलावा .002/device. यहां तक संवर्धन अभिकर्मकों और वर्णमिति substrates के लिए लेखांकन, प्रत्येक परीक्षण की लागत एल के लिए छोड़कर, कुछ पैसे है कारण एक्स InP की वर्तमान उच्च लागत के लिए $ 1.28/test होने का अनुमान है जो परीक्षण monocytogenes. बहरहाल, इस लागत खाद्य जनित रोगजनकों 6 मौजूदा तरीकों का पता लगाने के लिए अनुकूल तुलना. अपने वर्तमान रूप में, μPADs कारण गरीब सब्सट्रेट स्थिरता के लिए पहले परीक्षण के लिए तुरंत तैयार रहना चाहिए. इस सीमा को पार करने के लिए, हम डेरिवेटिव स्थिर और सब्सट्रेट / μPAD शैल्फ जीवन को बढ़ाने के लिए सूखी भंडारण के मूल्यांकन के अलावा परीक्षण कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, हम microfluidic चैनलों द्वारा एक दूसरे से जुड़े कई नमूना / अभिकर्मक साइटों का उपयोग कर मल्टिप्लेक्स μPADs विकसित कर रहे हैं.

पहले μPAD के परीक्षण के लिए विस्तृत फायदे के बावजूद, परख विशिष्टता के साथ समस्याओं संभव हो रहे हैं: 1) संवाददाता एंजाइमों exclu नहीं हैंsively लक्ष्य बैक्टीरिया द्वारा निर्मित है, इस प्रकार contaminating पृष्ठभूमि microbiota एक झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए योगदान कर सकते हैं. काले रंग का कण संवर्धन मीडिया में बनी रहती है μPAD को हस्तांतरित जब 2), यह दृश्य और ImageJ विश्लेषण अस्पष्ट कर सकते हैं. 3) वर्तमान परख विशेष रूप से ई. पहचान नहीं कर सकता कोलाई O157: H7. नतीजतन, विधि आगे के परीक्षण और आयोजित करने की पुष्टि के लिए एक प्रारंभिक जांच परीक्षण उपलब्ध कराने के प्रोत्साहन के रूप में अधिक अनुकूल है. फिर भी, इन कमियों के कई आसानी से संबोधित कर रहे हैं. संकेत वर्णमिति substrates के एक बड़े पैनल शामिल ई. सहित लक्ष्य जीवाणु की अधिक सटीक दृढ़ संकल्प, के लिए अनुमति होगी कोलाई O157: H7. इसी प्रकार, अतिरिक्त चयनात्मक संवर्धन प्रक्रियाओं नमूने में दूषित microbiota कम कर सकता है. Enrichments में कण के प्रभाव को कम करने के लिए, एक मोटे फिल्टर पूर्व μPAD के लिए नमूनों को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

निष्कर्ष, में थीअध्ययन संवर्धन और μPADs साथ संयुक्त एमएमएस ई. के निम्न स्तर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि यह दर्शाता है कोलाई, साल्मोनेला एसपीपी. और एल कृषि पानी में monocytogenes. कुछ संशोधनों के साथ, प्रक्रिया पोर्टेबल और क्षेत्र सेटिंग में लागू किया जा करने में सक्षम है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agricultural water Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing Wilmar BN-CVT1005  1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge  Lumiere Diagnostics 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth Chesapeake Wiper & Supply, Inc. CC90 Grade #90, 44 x 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach Various Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate Mallinckrodt Baker Inc 8100-04
Manifold Built in-house Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump Micron Meters RPP1300 Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette Various Disposable, 10 ml
Universal preenrichment broth Difco 223510
Buffered peptone water Difco 218105
Salmonella supplement Biomérieux Industry 42650 http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth Biomérieux Industry 410848 http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin Sigma-Aldrich 861987 http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid Various Drummond DP-110 used here
Shaking incubator Various Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette  Various 10 μl, 1 ml
Micropipette tips Various Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes Various RNase- and DNase-free
Probe sonicator Q Sonica LLC XL-2000 series
µPADs Avant  Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] Sigma-Aldrich H3375
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) Sigma-Aldrich 59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) Sigma-Aldrich B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)  Sigma-Aldrich 53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)  Sigma-Aldrich 38896
Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm Various Sterile
Flat bed scanner Various Xerox USB scanner
ImageJ software National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/

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References

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  2. Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
  3. Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
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