वर्णमिति जांच के कागज आधारित<em> कोलाई</em>,<em> साल्मोनेला</em> एसपीपी., और<em> लिस्टेरिया monocytogenes</em> कृषि पानी की बड़ी मात्रा से
Summary
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
इस प्रोटोकॉल कृषि पानी की बड़ी मात्रा से Escherichia कोलाई, साल्मोनेला एसपीपी., और लिस्टेरिया monocytogenes की तेजी वर्णमिति पता लगाने (10 एल) का वर्णन करता है. इधर, पानी बैक्टीरिया ध्यान केंद्रित करने के लिए, एक प्लास्टिक कारतूस में संलग्न एक सरल धुंध फिल्टर से मिलकर जो बाँझ संशोधित मूर swabs (एमएमएस), के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है. निस्पंदन के बाद, लक्ष्य बैक्टीरिया के लिए गैर चयनात्मक या चयनात्मक enrichments एमएमएस में प्रदर्शन कर रहे हैं. लक्ष्य बैक्टीरिया के वर्णमिति का पता लगाने के लिए, enrichments तो बैक्टीरिया संकेत substrates के साथ एम्बेडेड कागज आधारित विश्लेषणात्मक उपकरणों (μPADs) का उपयोग assayed रहे हैं. प्रत्येक सब्सट्रेट μPAD पर नेत्रहीन (गुणात्मक पता लगाने) का पता लगाया जा सकता है कि रंग उत्पादों सृजन लक्ष्य संकेत बैक्टीरियल एंजाइमों के साथ प्रतिक्रिया करता है. वैकल्पिक रूप से, प्रतिक्रिया व्यक्त μPADs के डिजिटल छवियों आम स्कैनिंग या फोटोग्राफिक उपकरणों के साथ उत्पन्न और ImageJ सॉफ्टवेयर, अल का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता हैपरिणामों की अधिक उद्देश्य और मानकीकृत व्याख्या के लिए lowing. जैव रासायनिक जांच प्रक्रिया aforementioned बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की पहचान करने के लिए डिजाइन कर रहे हैं, एंजाइमों पृष्ठभूमि microbiota या वर्णमिति substrates की गिरावट द्वारा उत्पादित कुछ मामलों में एक झूठी सकारात्मक उत्पादन हो सकता है. इसलिए, एक अधिक भेदभावपूर्ण निदान का उपयोग कर पुष्टि की जरूरत है. बहरहाल, इस जीवाणु एकाग्रता और पहचान मंच एक प्रारंभिक जांच पद्धति के रूप में इसके प्रयोग को न्यायोचित ठहरा, (एकाग्रता, संवर्धन, और पता लगाने के लिए लगभग 24 घंटे के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं), सस्ती (0.1 CFU / एमएल पता लगाने सीमा) संवेदनशील, प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और तेजी से है कृषि पानी की सूक्ष्मजीवविज्ञानी गुणवत्ता के लिए.
Introduction
यह खाद्य जनित रोग एजेंटों खाद्य जनित रोग के बोझ को कम करने के लिए क्षेत्र आधारित सेटिंग्स में तेजी से और बेहतर पता चला रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. खाद्य जनित बैक्टीरियल रोगज़नक़ों का पता लगाने के लिए आम रणनीतियों जैव रासायनिक रूपरेखा, चयनात्मक और अंतर संवर्धन, प्रतिरक्षा अलगाव और पहचान है, और आणविक पता लगाने में शामिल हैं. हालांकि, इन तरीकों छिटपुट संदूषण के द्वारा बाधा उत्पन्न कर रहे हैं, परीक्षण किया गया छोटा सा नमूना आकार, खाद्य जनित रोगजनक बैक्टीरिया की अक्सर कम मात्रा, लंबे समय प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है, और / या क्षेत्र सेटिंग्स के लिए लागू नहीं कर रहे हैं. इसके अलावा, कई खाद्य matrices में यौगिकों का पता लगाने और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए निरोधात्मक हैं. माइक्रोबियल जांच की संभावना को बेहतर बनाने के क्रम में, संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (जैसे धोने के पानी और सिंचाई के पानी के रूप में) कृषि पानी के परीक्षण के ताजा उपज का एक बड़ा सतह क्षेत्र के साथ संपर्क में आता है या एक वाहन के रूप में कार्य करता है, जो या तो सुझाव दिया है कि पी के लिएroduce संदूषण खाद्य 1 के प्रत्यक्ष परीक्षण के लिए एक व्यवहार्य विकल्प है. फिर भी, प्रतिनिधि कृषि पानी के नमूने के कमजोर पड़ने के प्रभाव के साथ मिलकर अक्सर कम प्राकृतिक रोगज़नक़ बोझ रोगज़नक़ एकाग्रता के लिए नमूना तैयार करने के तरीकों आवश्यक बनाता है. इस तरह की एक विधि पानी (≥ 10 एल), पर्याप्त रोगज़नक़ एकाग्रता, और नीचे की ओर पता लगाने की रणनीति के साथ संगतता की बड़ी मात्रा के नमूने की आवश्यकता होगी.
संशोधित मूर swabs (एमएमएस) पानी में 2-4 की बड़ी मात्रा में (≥ 10 एल) से बैक्टीरिया ध्यान केंद्रित के लिए इस्तेमाल किया, सस्ती, सरल, और बीहड़ उपकरणों रहे हैं. एमएमएस एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर कैसेट के माध्यम से पंप पानी की बड़ी मात्रा के लिए एक मोटे फिल्टर के रूप में कार्य करता है जो धुंध से भरा एक प्लास्टिक कैसेट के होते हैं. एमएमएस संसाधित ली में सूक्ष्मजीवों सहित कार्बनिक और अकार्बनिक सामग्री कण है कि कब्जा जीवाणु एकाग्रता (≥ 10 गुना एकाग्रता) के एक गैर भेदभावपूर्ण विधि हैरुपये के नमूने. यह एमएमएस द्वारा लक्ष्य सूक्ष्मजीवों की एकाग्रता के उत्कृष्ट प्रभावकारिता सूक्ष्मजीवों गाद मिट्टी अंश या निलंबित ठोस 3 की जैविक सूक्ष्म समुच्चय से जुड़े होने की उम्मीद कर रहे हैं कि इस तथ्य से समझा जा सकता है कि संभावना है. एमएमएस के बीहड़ डिजाइन इस तरह के फिल्टर के clogging, बड़ी मात्रा प्रक्रिया करने में असमर्थता, उच्च मैलापन साथ फिल्टर के नमूने, और उच्च लागत के रूप में पानी से बैक्टीरिया का कब्जा है और एकाग्रता के लिए अन्य निस्पंदन तरीकों के साथ जुड़े अधिकांश कमियों पर काबू पाने के लिए अनुमति देता है. इन कारणों के लिए, एफडीए एमएमएस के पर्यावरण और उत्पादन से संबंधित नमूना संग्रह की प्रक्रिया 5 के लिए सरकारी प्रक्रियाओं में शामिल किया जा सिफारिश की है कि है.
इधर, एक विधि एकाग्रता, संवर्धन, और Escherichia कोलाई का पता लगाने, साल्मोनेला एसपीपी., और कृषि जल से लिस्टेरिया monocytogenes के लिए वर्णित है. एक एमएमएस BACT की एकाग्रता के लिए प्रयोग किया जाता हैeria, और भी चयनात्मक या गैर चयनात्मक जीवाणु संवर्धन के लिए एक पोत के रूप में कार्य करता है. बैक्टीरिया का पता लगाने कागज आधारित विश्लेषणात्मक उपकरणों (μPADs) 6 का उपयोग कर biochemically हासिल की है. μPADs fluidic नेटवर्क या फोटोलिथोग्राफी, inkjet मुद्रण, मुद्रण, और मोम 7-11 मुद्रण सहित तरीकों की एक किस्म का उपयोग मौके परीक्षण के रूप में निर्मित किया जा सकता है. Fluidic डिजाइन के उदाहरण नमूना केन्द्र में जमा है और बाद में नमूना या सब्सट्रेट केंद्र 12 में केशिका कार्रवाई द्वारा चैनल के बाहरी जलाशयों से खींच रहे हैं, जिसमें बाहर का जलाशयों या एक चैनल पैटर्न में बहती है, जहां वृक्ष के समान चैनल पैटर्न हो सकता है. इस प्रोटोकॉल के लिए, हम यहाँ परीक्षण सूक्ष्मजीवों का संकेत एंजाइमों द्वारा कार्रवाई की जा सकती है कि वर्णजनीय substrates के साथ imbedded 7 मिमी व्यास मोम कागज मौके सरणियों के लिए रोजगार के लिए चयनित किया है: Chlorophenol लाल β-D-galactopyranoside (CPRG) और 5 – ब्रोमो-4-क्लोरो 3 indolyl β-D-glucuronide (एक्स gluc)ई. द्वारा उत्पादित β-galactosidase और β-glucuronidase का पता लगाने के लिए कोली; साल्मोनेला एसपीपी द्वारा उत्पादित C8-esterase का पता लगाने के लिए 5 ब्रोमो 6 क्लोरो 3 indolyl Caprylate (मैजेंटा Caprylate).; phosphatidylinositol विशेष phospholipase सी का पता लगाने के लिए और 5 ब्रोमो-4-क्लोरो 3 indolyl-myo-inositol फॉस्फेट (एक्स InP) (पीआई-पीएलसी) एल द्वारा उत्पादित 6 monocytogenes. इस प्रकार, एक विशेष जीवाणु की मौजूदगी जटिल उपकरण या डेटा व्याख्या की आवश्यकता के बिना नेत्रहीन देखा जा सकता है. इन विशिष्ट लक्ष्य बैक्टीरिया के एंजाइम आधारित वर्णमिति μPAD पता लगाने की विशिष्टता और संवेदनशीलता पहले 6 पता लगाया गया है. इसके अलावा, इन लक्ष्य बैक्टीरिया के लिए एकीकृत एकाग्रता का पता लगाने विधि की संवेदनशीलता सूक्ष्मजीवों (अप्रकाशित डेटा और Bisha एट अल. 13) के पूर्व निर्धारित स्तर के साथ पानी की बड़ी मात्रा के spiking द्वारा मूल्यांकन किया गया था.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल ई. का पता लगाने के लिए एक एकीकृत विधि का वर्णन कोलाई, साल्मोनेला एसपीपी., और एल कृषि पानी में monocytogenes. इधर, कृषि पानी की बड़ी मात्रा से बैक्टीरिया का एमएमएस एकाग्रता (10 एल), जीवाणु सं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
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- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
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