诱导肌内膜增生对战动脉粥样硬化小鼠:两种有效的模型介绍

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Summary

该视频显示两个模型内膜斑块的发展在小鼠动脉,并强调在肌内膜增生和动脉粥样硬化的差异。

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Stubbendorff, M., Hua, X., Deuse, T., Ali, Z., Reichenspurner, H., Maegdefessel, L., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models. J. Vis. Exp. (87), e51459, doi:10.3791/51459 (2014).

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Abstract

已经建立了各种体内实验室啮齿动物模型中对动脉狭窄的诱导以模仿包括动脉斑块的形成和狭窄,如在缺血性心脏疾病观察例如疾病。两个高度可重复的小鼠模型 - 既导致动脉狭窄,但每个底层不同的途径发展 - 在这里介绍。该模型代表动脉狭窄的两种最常见的原因;即会显示一个鼠标型号为每个肌内膜增生,动脉粥样硬化。为了诱导肌内膜增生,进行腹主动脉球囊导管损伤。对于粥样硬化斑块的发展,ApoE基因 - / - 与西方脂肪的饮食组合的小鼠模型被使用。对结果的衡量和评估不同的模式适应选项将在本手稿命名和描述。这两款车型的引进和比较提供了信息离子为科学家选择在按照要求科学问题的相应动脉狭窄模型。

Introduction

在工业化国家,缺血性心脏疾病的死亡率仍1的主要原因。起因于冠状动脉狭窄是多方面的,包括肌内膜增生和动脉粥样硬化,血管再通与剩余的最常见的治疗策略2。研究模型内膜增生和动脉粥样硬化的机制途径明确区分是必不可少的探讨动脉斑块发展的病理生物学和病理生理过程。在这段视频中用于研究肌内膜增生或动脉粥样硬化无论是发展的两个不同的小鼠模型进行了介绍。

肌内膜增生是假设,形成通过最初描述为动脉粥样硬化3“响应到伤害”的范式。内皮细胞层的机械破坏导致一个强烈的重塑通过旁分泌作用增强。有几种二fferent动物模型通常用于研究肌内膜增生。有些团体使用的金属器件在大鼠4的升主动脉。用气囊导管进行的主动脉剥脱模型也常用于实验室大鼠5,6。在实验室老鼠7执行的血管内膜增生模型实现了颈动脉结扎诱导肌内膜病变8。在我们的实验室中,腹主动脉剥脱模型-研究肌内膜增生的发展-以及一个人性化的支架内再狭窄模型9常用。这部影片强调,选择合适的实验动物模型是动脉狭窄的机械或病理生理的研究是至关重要的。

肌内膜增生模型必须从动脉粥样硬化模型的区别。对于后者,载脂蛋白E缺陷(ApoE基因 - / - )小鼠与西方饮食组合常用于诱导atheroscl色情病变10,11,12,13。对于这两种类型的小鼠肌内膜疾病的诱导例子如下所示,随着不同的模型适应选择,分析血管狭窄14。

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Protocol

所有的动物工作应按照有关动物护理指引进行。获得批准的机构动物工作开始前协议。

1,肌内膜增生模型(一)

对于血管内膜增生模型,购买C57BL/6J(股票编号000664,C57BL/6J)小鼠在8周体重大约25克的年龄。房子老鼠常规条件下这些实验;喂小鼠标准鼠标饲料,并提供水随意

  1. 鼠标的准备:介绍鼠标采用感应腔麻醉状态,异氟醚(2%)。
    1. 用头发剪取出腹毛,奠定了鼠标在它的后面,覆盖它的鼻子和嘴的面罩以保证麻醉。
    2. 与普罗沃碘,消毒腹部区域普遍,其次是80%的乙醇,在两个周期。
    3. 确保不存在反射捏住后肢监测麻醉深度足够的。
    4. 分离皮肤和肌肉沿两个步骤,露出腹部器官的白线。
    5. 躺在肠子在盐水滋润手套。环绕肠子的手套,以保持湿润。
    6. 认真清除脂肪组织压片腹主动脉。暴露下腹主动脉至其分叉处,小心不要伤到任何分支血管。
    7. 首先,放置一个显微外科钳上的近端,下腹主动脉关闭血流量。现在,适用旁边主动脉分叉第二远端钳。
    8. 当血液流动被中断,使一个小的切口进入主动脉靠近近侧钳。
    9. 插入球囊导管尖,这已被加湿用0.9%生理盐水中,并前进朝向主动脉的远端夹具。
    10. 对于内皮损伤,通过虚报了巴鲁剥夺主动脉Ñ​​小心缓慢地拉出导管进入近端夹具的方向。
    11. 重复剥蚀机动两次。
    12. 取出导管和使用10-0普理灵缝线运行关闭主动脉切口。
    13. 小心打开远端钳​​。若在织脉切开术部位出血,再次关闭夹,找到出血,并把额外的中断针,是必要的。
    14. 如果没有出血可以观察,慢慢打开近端钳。
    15. 主动脉脉冲应该​​从切口向远侧可见。现在肠子可以安排回原位
    16. 冲洗,利用预热的无菌生理盐水腹腔。
    17. 关闭腹壁开始与肌肉层用6-0 Prolene线连续缝合。
    18. 接下来适应皮肤使用5-0普理灵进行连续缝合下。
    19. 在当时的鼠标还在麻醉,适用4-5毫克/公斤卡洛芬通过皮下麟蹄CTION。
    20. 加入安乃近的饮用水(每100毫升50毫克安乃近)进行疼痛控制和持续3天手术后。监测动物在整个恢复。
      注:观察期为这个模型是28天。

2,动脉粥样硬化模型(B)

对于动脉粥样硬化模型,购买载脂蛋白E缺陷(ApoE基因- / - )小鼠(股份编号002052,B6.129P2-Apoetm1Unc / J)在4周龄时,再喂4-6个月。房子老鼠常规条件下这些实验;小鼠喂高脂饮食西部抵达时(哈伦实验室TD.88137)和4至6个月期间提供自由饮水

  1. 鼠标的准备:
    1. 喂的ApoE - / - 小鼠与西方的饮食开始,在4周龄。饮食控制应直接抵达时开始。
    2. 维持西方饮食在整个实验持续时间。</ LI>

3。分析

  1. 肌内膜增生模型(一)
    在此模型中感兴趣的区域是“病变区域”。分析选项包括管腔闭塞,I / M比值(内膜/中膜比),最大myointima厚度,肌内膜面积,三色染色纤维化,和H&E染色的单个核细胞(如如图1A-1C)。根据科学问题众多其他染色像天狼猩红胶原蛋白,免疫组织化学和共焦的方法可以被应用。
  2. 动脉粥样硬化模型(B)
    在此模型中感兴趣的区域是主动脉瓣,主动脉弓以及降主动脉。分析选项:苏丹红染色血脂和主动脉瓣,主动脉弓和降主动脉( 如图1D)的三色染色。
    这种模式也产生了各种像其他染色选项例如油红O为中性脂肪,天狼猩红,免疫组织化学和激光共聚焦方法。
    1. 苏丹红染色:对刚收获的主动脉组织执行苏丹红染色。
      1. 收获前去除饮食6小时。
      2. 介绍鼠标利用感应腔麻醉状态,用异氟烷(2%)。按捏后肢监测麻醉深度足以确保不存在反射消失。
      3. 打开胸腔;切断心脏的顶点和通过左心室灌注,先用生理盐水(3毫升)中,随后加入4%PFA(3ml)中通过主动脉根部修复主动脉。
      4. 从根释放到主动脉分叉处。尽量去除脂肪组织,尽可能多地。
      5. 切断心脏和主动脉根部,并把它们在4%PFA存储的组织学。
      6. 用于组织学的主动脉根部有仔细放置在石蜡块在垂直位置,以允许AOR的切割抽动根生成幻灯片,显示所有3瓣膜小叶。
      7. 切开主动脉树的一端固定到硅层用细销。纵向打开主动脉和​​修复主动脉组织。
      8. 冲洗的组织用50%的乙醇。浸入所述组织与约15分钟苏丹III染色溶液。
      9. 用50%乙醇冲洗轻轻除去过量的苏丹III。 (注:50%的乙醇可洗染料的路程。)冲洗DH 2 O,并拍照作进一步的分析。

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Representative Results

图1显示了不同的分析选项,并为这两个模型中引起的疾病状态。对于内膜增生模型,示出了在三色染色的代表横截面的分析。从这些横截面,如I / M比,最大斑块厚度,最大内膜厚度在管腔内,以百分比管腔闭塞,以及斑块面积的结果可以被测量和计算。

为了评估动脉粥样硬化模型中的结果,可以使用所有上面提到的方法。此外,定量斑块面积在腹主动脉,斑块形成于主动脉瓣,主动脉弓和降主动脉的程度,可以通过三色染色测定。

图1
图1。裸露的小鼠主动脉收获,石蜡包埋,并有代表性的横截面中示出三色染色(A)。 I / M比率是通过使用计算机分析后的比(B)的计算测量内膜和中膜厚度计算的三色染色的切片。最大斑块厚度测量为最大内膜厚度在管腔通过计算机形态(B)。管腔闭塞(以百分数表示)中减去来自前腔中,由前腔,再乘以100%(C)除以新内腔确定。斑块面积中减去由前腔(C)的新的内腔进行评估。降主动脉,纵向开有亲脂性结构和染色,苏丹红显示(D)。以确定定量斑块面积,苏丹红染病灶以及总主动脉面积,计量和ANALY使用图像分析软件捷思。主动脉瓣的石蜡包埋标本,主动脉弓,并在三色降主动脉横截面描绘(E)。管腔闭塞,斑块面积和最大斑块厚度计算方法如上所述。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

虽然这两种疾病导致在患者类似的症状,斑块发展的基本机制,因此,治疗方法有很大的不同2。在不同形式的动脉狭窄的病人的临床表现以及斑块发展的时间表取决于底层机制。

取决于在患者中的临床发现,样品的分析方法的不同,必须执行5,15。有必要分析适应于这种疾病的特征的研究结果,是被模仿由所选择的模型14。反之亦然,这取决于疾病正在研究,最可行的和适当的动物模型应选择。另外,至关重要的是,新的药物应的模型机理上匹配。

本出版物中介绍了这两款机型是快速和易于操作,重现性好。有一些马模型之间的差异约旦。例如,在肌内膜增生模型的观测时间是28天16,而动脉粥样硬化斑块的发展需要四到六个月17。

另一个主要区别是是否适用于不同的小鼠品系。动脉粥样硬化模型依赖于ApoE基因 - / - 或低密度脂蛋白 - / - 小鼠,因此只能在执行这个特定的基因敲除小鼠进行。要创建承载两个ApoE基因小鼠 - / - 和其他所需的淘汰赛是非常耗时的。该肌内膜增生引起球囊损伤手术可以在任何鼠标来完成。该肌内膜增生模型的产量更多的潜在修改感兴趣的小鼠品系,而动脉粥样硬化模型面临着严格限制携带ApoE基因小鼠 - / - 。

球囊剥脱的强度为肌内膜增生性病变的结果是至关重要的。如果导管损伤进行了AGGressively,动脉瘤形成可能发生;如果执行的剥蚀太温柔,斑块的发展可能是太弱,无法看到群体之间的差异。在此过程中它是有益的,如果一项研究之内的所有手术均由同一人担任。对其他需要引入导线一样硬或尖锐障碍物技术气囊损伤的优点,就是它的灵活性以及选择通过球囊导管尖端的充气以调节气囊的大小和压力。此外,未充气的气球导管尖薄,并且可以通过一个相对小的切口相比更厚,更硬的剥蚀工具插入到主动脉。对于动脉粥样硬化斑块的形成模式也可以是至关重要的,开​​始在小鼠年轻时喂养的西方饮食,因为这可能对病变的严重程度有很大的影响。由于病变在介绍这两种发展模式在女性和男性的小鼠,性别可以ADAPTEd,来实验的要求。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

作者感谢克里斯蒂安Pahrmann的技术援助。 SS收到的资金从德意志研究联合会(DFG)(SCHR992/3-2和SCHR992/4-2)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thyoglycollate Broth 3% Fluka 70157 powder
PFA 4% Electron Microscopy Sciences #157135S 20%
Sudan III staining solution Sigma Aldrich S4131 powder
mouse C57BL/6J Jackson Laboratories Stock # 0006664
mouse ApoE -/- Jackson Laboratories Stock #002052
Western Diet Harlan Laboratories TD.88137
hair clipper WAHL 8786-451A ARCO SE
Forene Abbott Isoflurane
microsurgical clamp Fine Science Tools 18055-04 Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator Fine Science Tools 18056-14
catheter
10-0 prolene suture Ethicon 788G
6-0 prolene suture Ethicon 8709H
5-0 prolene suture Ethicon EH7229H
Rimadyl Pfizer Carprofen
Metacam 1.5 mg/ml Boehringer Ingelheim Metamizol

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References

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