Inducing Myointimal Hyperplasi Versus Åreforkalkning i Mus: En introduksjon av to gyldige modeller

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne videoen viser to modeller av intimal plakk utvikling i murine arterier og understreker forskjellene i myointimal hyperplasi og åreforkalkning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stubbendorff, M., Hua, X., Deuse, T., Ali, Z., Reichenspurner, H., Maegdefessel, L., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models. J. Vis. Exp. (87), e51459, doi:10.3791/51459 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Forskjellige in vivo-gnagerlaboratoriemodeller for induksjon av arteriestenose er blitt etablert for å etterligne sykdommer som inkluderer arteriell plaque dannelse og stenose, som observert for eksempel ischemisk hjertesykdom. To svært reproduserbare musemodeller - både som resulterer i arteriestenose men hver underliggende en annen vei for utvikling - er innført her. Modellene representerer de to vanligste årsakene til nyrearteriestenose; nemlig en musemodell for hver myointimal hyperplasia, og aterosklerose er vist. Å indusere myointimal hyperplasi, er et ballongkateter skade av abdominal aorta utført. For utviklingen av aterosklerotisk plakk, til ApoE - / - er musemodellen i kombinasjon med western fet diett anvendes. Ulike modelltilpassede alternativer for måling og evaluering av resultatene er navngitt og beskrevet i dette manuskriptet. Innføringen og sammenligning av disse to modellene gir information for forskere å velge riktig arteriestenose modell i henhold til den vitenskapelige spørsmål spurt.

Introduction

I industrialiserte land iskemisk hjertesykdom er fortsatt en ledende dødsårsak en. Årsakene til koronar stenose er mangfoldige og omfatter myointimal hyperplasia samt aterosklerose, med revaskularisering rester den vanligste behandlingsstrategi to. Forskningsmodeller som klart skiller mellom de mekanistiske veier av intimal hyperplasi og aterosklerose er viktig å undersøke pathobiological og patofysiologiske prosesser i arteriell plakk utvikling. I denne video to forskjellige musemodeller som brukes til å studere enten utvikling av myointimal hyperplasia, eller aterosklerose er innført.

Myointimal hyperplasia er postulert å danne via "respons-til-skade" paradigme opprinnelig beskrevet for aterosklerose tre. Den mekaniske forstyrrelse av endoteliale sjikt fører til en intens ombygging forsterket av parakrine effekter. Det er flere different dyremodeller som vanligvis brukes til å studere myointimal hyperplasia. Noen grupper bruker metall enheter i stigende aorta av rotter fire. Den aorta denudation modellen utføres med et ballongkateter blir også ofte brukt i laboratorierotter 5,6. Den intimal hyperplasia modell utført i laboratoriet mus 7 implementerer ligation av halspulsåren og induserer myointimal lesjoner åtte. I vårt laboratorium, abdominal aorta-modell denudation - for å studere utviklingen av myointimal hyperplasia - så vel som et humanisert stent restenosis modell 9 blir ofte brukt. Denne videoen understreker at det å velge riktig eksperimentell dyremodell er avgjørende for mekanistiske eller pathophysiologic studier av arteriell stenose.

Myointimal hyperplasi modeller må skilles fra aterosklerose modeller. For sistnevnte, apolipoprotein E-mangel (ApoE - / -) er mus i kombinasjon med vestlig kosthold som vanligvis brukes til å indusere atherosclerotiske lesjoner 10,11,12,13. Eksempler for induksjon av begge disse typer av myointimal sykdom hos mus er vist her, sammen med forskjellige modell innrettet muligheter for å analysere fartøy stenose 14..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeid skal utføres i henhold til gjeldende retningslinjer dyr omsorg. Skaff institusjonell godkjenning for dyr arbeid før begynnelsen protokollen.

En. Myointimal Hyperplasi Modell (A)

For intimal hyperplasia modell, kjøpe C57BL/6J (Stock nummer 000664, C57BL/6J) mus i en alder av 8 uker som veier ca 25 g. Hus mus for disse eksperimentene henhold konvensjonelle forhold; mate mus standard mus chow og gi vann ad libitum.

  1. Mus forberedelse: Introduser musen til en bedøvelse tilstand med isofluran (2%) benytter en induksjonskammeret.
    1. Fjern mage hår ved hjelp av et hår trimmer, lå musa på ryggen og dekke sin nese og munn med ansiktsmasken for å sikre anestesi.
    2. Med Provo-Jod, desinfisere mageområdet universelt, etterfulgt av 80% etanol, i to sykluser.
    3. Sikre fraværav reflekser ved å knipe den hind lem å overvåke tilstrekkelig dybde av anestesi.
    4. Separer huden og muskelen langs linea alba i to trinn for å avsløre abdominal organer.
    5. Lå tarmen i en salt fuktes hanske. Pakk hansken rundt tarmen for å holde dem fuktige.
    6. Oppmerksomt fjerne fettvev dørk abdominal aorta. Expose infrarenal aorta ned til sin bifurcation, tar seg ikke å skade noen gren fartøy.
    7. Først plasserer en mikro klemme på den proksimale, infrarenale aorta å stenge blodstrømmen. Nå gjelder en andre distal klemme ved siden aortabifurkasjonen.
    8. Når blodstrømmen blir avbrutt, blir et lite snitt inn i aorta nær den proksimale klemme.
    9. Sett ballong-kateter tippet, som har blitt fuktet med 0,9% saltløsning, og videre mot den ytre klemme av aorta.
    10. For endothelial skade, denude aorta ved å blåse i ballongn forsiktig og langsomt å trekke kateteret inn i retning av den proksimale klemme.
    11. Gjenta denudation manøver to ganger.
    12. Fjern kateteret og lukke aortic snitt bruker 10-0 prolene kjører sting.
    13. Åpne forsiktig distal klemmen. I tilfelle av blødning på aortotomy nettstedet, lukkes klemmen igjen, finn blødning og plassere flere avbrutte masker, som er nødvendig.
    14. Hvis ingen blødning kan observeres langsomt etter den proksimale klemme.
    15. En aortic puls skal være synlig distalt fra snittet. Nå tarmen kan arrangeres tilbake in situ.
    16. Skyll bukhulen utnytte forvarmede sterilt saltvann.
    17. Lukk bukveggen begynner med muskelen laget ved hjelp av 6-0 prolen kjører sting.
    18. Neste tilpasse huden under anvendelse av 5-0 prolen utføre løpe suturer.
    19. I løpet av tiden musen er fortsatt bedøvet, påfør 4-5 mg / kg Carprofen via en subkutan injeDette skjer.
    20. Legg Metamizol til vannet drikkevann (50 mg Metamizol per 100 ml) for smertekontroll og fortsette i 3 dager etter kirurgi. Overvåke dyr i hele utvinning.
      Merk: Observasjonsperioden for denne modellen er 28 dager.

2. Atherosclerosis Modell (B)

For aterosklerose modell, kjøpe apolipoprotein E-mangel (ApoE - / -) mus (Stock nummer 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) i en alder av fire uker, og deretter matet i 4-6 måneder. Hus mus for disse eksperimentene henhold konvensjonelle forhold; mate mus høy lipid vestlig kosthold ved ankomst (Harlan Laboratories TD.88137) og gi vann ad libitum for en varighet på 4 til 6 måneder.

  1. Mus forberedelse:
    1. Strøm APOE - / - mus med vestlig kosthold som begynner ved 4 ukers alder. Dietary manipulasjon bør begynne direkte ved ankomst.
    2. Oppretthold vestlig diett hele varigheten av forsøket. </ Li>

Tre. Analyse

  1. Myointimal hyperplasia modell (A)
    Den region av interesse i denne modellen er den "lesjon-området". Alternativer for analyse inkluderer luminal utslettelse, I / M ratio (intima / media ratio), maksimal myointima tykkelse, myointimal område, Trikrom fibrosefarging, og H & E farging for mononukleære celler (som illustrert i figur 1A-1C). I henhold til vitenskapelig aktuelle tallrike andre stainings som Picrosirius rødt for kollagen, immunhistokjemi og confocal metoder kan bli anvendt.
  2. Åreforkalkning modell (B)
    De regioner av interesse i denne modellen er Aortaklaff, aortabuen samt synkende aorta. Alternativer for analyse: Sudan rød flekker for lipider og Trikrom farging av aortaklaffen, aortabuen og synkende aorta (som illustrert i figur 1D).
    Denne modellen gir også en rekke andre fargings alternativer somfor eksempel Oil Red O for nøytrale lipider, Picrosirius rød, immunhistokjemi, og confocal metoder.
    1. Sudan rød flekker: Utfør Sudan røde flekker på nyhøstet aortic vev.
      1. Fjern dietten 6t før høsting.
      2. Introduser musen til en bedøvelse tilstand med isofluran (2%) benytter en induksjonskammeret. Sikre fravær av reflekser ved å knipe den hind lem å overvåke tilstrekkelig dybde av anestesi.
      3. Åpne brystet; skjære av toppen av hjertet og perfuse via den venstre ventrikkel, først med saltløsning (3 ml), etterfulgt av 4% PFA (3 ml), via aortaroten å fastsette aorta.
      4. Frigjør aorta fra roten til sin bifurkasjon. Prøv å fjerne fettvev så mye som mulig.
      5. Skjær av hjerte og aorta roten, og lagre dem i 4% PFA for histologi.
      6. For histologi den aortaroten må nøye plasseres i parafinblokk i oppreist stilling, slik at kuttingen av aortic root genererer lysbilder som viser alle tre klaffebrosjyrer.
      7. Skjær den ene enden av aorta treet og fikse det på silikon lag med fine nålene. Åpne aorta lengde og fikse aortic vev.
      8. Skyll vevet med 50% etanol. Fordyp vevet med Sudan III flekker løsning i ca 15 min.
      9. Skyll lett med 50% etanol for å fjerne overskudd av Sudan III. (Merk: 50% etanol kan vaske fargestoffet unna.) Skyll med dH 2 O, og ta bilder for videre analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser ulike analysemuligheter og den induserte sykdomstilstand for begge modellene. For intimal hyperplasia modell, er analysen av representative tverrsnitt i Trikrom farging vist. Fra disse tverrsnitt, kan resultatene som I / M-forhold, maksimal plakktykkelse, maksimal intimal tykkelse i lumen, luminal utslettelse i prosent, samt plakkområdet måles og beregnes.

For å vurdere resultatet av aterosklerose modell, kan alle metoder som er nevnt ovenfor brukes. I tillegg er den kvantitative plakkområdet i den abdominale aorta, graden av dannelse av plaque på aorta-ventilen, aortabuen, og den nedadgående aorta kan måles via Trichrome farging.

Figur 1
Figur 1. Denuded muse aortas høstes, parafin innebygd, og et representativt tverrsnitt er vist i Trikrom farging (A). I / M forholdstall er beregnet på Trikrom farget seksjoner ved å måle intima og media tykkelse ved hjelp av dataanalyse etterfulgt av beregning av forholdet (B). Maksimal plakktykkelse måles som den maksimale intimal tykkelse i lumen av en datamaskin morfometri (B). Luminal utslettelse (i prosent) bestemmes ved å trekke de nye innvendige lumen fra de tidligere lumen, dividert med den tidligere lumen, multiplisert med 100% (C). Plakk området vurderes ved å subtrahere de nye indre lumen fra de tidligere lumen (C). Den synkende aorta, åpnet på langs med lipofile strukturer og farget med Sudan rød vises (D). For å bestemme den kvantitative plakkområdet, Sudan Red farget lesjoner så vel som total aorta-område, blir målt og analyzed ved bildeanalyse programvare. Tverrsnitt av parafin innebygde prøver av aortaventilen, aortabuen, og den nedadgående aorta i Trichrome blir avbildet (E). Luminal utslettelse, plakk området, og maksimal plakk tykkelse er beregnet som beskrevet ovenfor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om begge sykdommene gi lignende symptomer hos pasienten, de underliggende mekanismene for plakk utvikling og dermed de behandlingsmetoder er svært forskjellige to. I forskjellige former av arteriell stenose de kliniske funn i pasienter så vel som den tidslengde for utvikling av plaque, avhenger av den underliggende mekanisme.

Avhengig av de kliniske funn hos pasienten, må ulike fremgangsmåter for analyse av prøver utføres 5,15. Det er nødvendig å tilpasse analysen til de karakteristiske funn i sykdommen som blir etterlignet ved den valgte modell 14.. Vice versa, avhengig av sykdommen som blir studert, den mest mulig og passende dyremodell som bør velges. Videre er det avgjørende at nye legemidler bør mechanistically matche modell.

Begge modeller introdusert i denne publikasjonen er raske og enkle å utføre og reproduserbar. Det er noen maJor forskjeller mellom modellene. For eksempel er den observasjon tid i myointimal hyperplasia modellen 28 dager 16, mens aterosklerotisk plakk utvikling krever 4-6 måneder 17.

En annen stor forskjell er resirkulering av ulike musestammer. Denne aterosklerose-modellen er avhengig av ApoE - / - eller LDL - / - i mus og kan derfor bare utføres i mus som bærer denne spesifikke utstansing. For å opprette mus som bærer både APOE - / - og en annen ønsket knockout er svært tidkrevende. Den myointimal hyperplasia induserende ballong skade kirurgi kan utføres i en hvilken som helst mus. De myointimal hyperplasia modell gir mer potensielle å endre muse stamme av interesse, mens den aterosklerotiske modellen står overfor en streng begrensning til mus som bærer APOE - / -.

Intensiteten av ballongen denudation er avgjørende for utfallet av de myointimal hyperplasi lesjoner. Hvis kateteret skade utføres for aggressively, kan aneurysmidannelse oppstå; hvis denudation utføres for forsiktig, kan plakkutvikling være for svakt til å vise forskjellene mellom gruppene. I denne prosedyren er det nyttig hvis alle operasjoner innen én studie er utført av samme person. Fordelen med ballongskade til andre teknikker som krever innføring av stive eller skarpe hindringer som ledninger, er fleksibilitet så vel som muligheten til å justere størrelsen og trykket i ballongen gjennom oppblåsing av ballongkatetertupp. Videre er den uoppblåste ballong-kateter tippet er tynn og kan føres inn i aorta via et forholdsvis lite snitt i forhold til tykkere, stivere denudation verktøy. For den aterosklerotiske plakk dannelse modell kan det være avgjørende å starte fôring det vestlige kostholdet i ung alder av musene fordi det kan ha en stor innvirkning på alvorlighetsgraden av lesjoner. Siden lesjoner i begge introdusert modeller utvikle seg i både kvinnelige og mannlige mus, kan kjønn være ADAPTEd til kravene i eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Christiane Pahrmann for teknisk assistanse. SS fått støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 og SCHR992/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thyoglycollate Broth 3% Fluka 70157 powder
PFA 4% Electron Microscopy Sciences #157135S 20%
Sudan III staining solution Sigma Aldrich S4131 powder
mouse C57BL/6J Jackson Laboratories Stock # 0006664
mouse ApoE -/- Jackson Laboratories Stock #002052
Western Diet Harlan Laboratories TD.88137
hair clipper WAHL 8786-451A ARCO SE
Forene Abbott Isoflurane
microsurgical clamp Fine Science Tools 18055-04 Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator Fine Science Tools 18056-14
catheter
10-0 prolene suture Ethicon 788G
6-0 prolene suture Ethicon 8709H
5-0 prolene suture Ethicon EH7229H
Rimadyl Pfizer Carprofen
Metacam 1.5 mg/ml Boehringer Ingelheim Metamizol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
  2. ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
  3. Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
  4. Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
  5. Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
  6. Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
  7. Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
  8. Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
  9. Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. 3663 (2012).
  10. Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. (2003).
  11. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
  12. Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
  13. Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
  14. Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
  15. Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
  16. Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
  17. Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics