Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

Biology
 

Summary

Cryo elektronenmicroscopen, ofwel Scanning (SEM) of Transmission (TEM), worden op grote schaal gebruikt voor de karakterisering van biologische monsters of andere materialen met een hoog watergehalte 1. Een SEM / focused ion beam (FIB) wordt gebruikt om kenmerken van belang in monsters identificeren en extract een dun, elektron-transparante lamellen overbrenging op een cryo-TEM.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rubino, S., Melin, P., Spellward, P., Leifer, K. Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam. J. Vis. Exp. (89), e51463, doi:10.3791/51463 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hier presenteren we een protocol om cryo-TEM monsters van Aspergillus niger sporen bereiden, maar die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor een aantal micro-organismen of oplossingen. We maken gebruik van een custom-built cryo-overslagstation en een aangepaste cryo-SEM voorbereiding kamer 2. De sporen zijn afkomstig uit een cultuur, duik-ingevroren in vloeibare stikstof slush en waargenomen in de cryo-SEM een regio van belang te selecteren. Een dunne lamel wordt vervolgens geëxtraheerd met behulp van de FIB, bevestigd aan een TEM rooster en vervolgens verdund tot transparantie elektron. Het rooster wordt overgebracht naar een cryo-TEM-houder en een TEM voor hoge resolutie studies. Door de introductie van een gekoelde nanomanipulator uiteinde en een cryo-overslagstation Dit protocol is een eenvoudige aanpassing aan cryogene temperatuur van de routinematig gebruikte FIB bereiding van TEM. Als zodanig heeft de voordelen van die een kleine hoeveelheid wijzigingen van bestaande instrumenten, opstellingen en procedures; het is eenvoudig te implementeren; het heeft een breed toepassingsgebied in principe hetzelfde als voor cryo-TEM monstervoorbereiding. Een beperking is dat het kundige behandeling van de monsters bij kritische stappen om verontreinigingen te vermijden of te minimaliseren.

Introduction

In dit protocol een cryo-FIB/SEM wordt gebruikt om TEM stalen te produceren uit een bepaalde regio van het monster, eerder geïdentificeerd met hoge precisie door SEM-analyse. Elektronenmicroscopie (scanning of transmissie) analyse van biologische monsters is een routine-techniek die gebruikt wordt voor onderzoek en diagnose. SEM is vrij snel en makkelijk te gebruiken en te interpreteren, maar de informatie wordt alleen verkregen uit het monster oppervlak en met een resolutie van 1,5 nm. TEM heeft een hogere resolutie, maar is moeilijker te implementeren, de beeldanalyse minder eenvoudig en dat bulk zijn verkregen monsters worden verdund transparantie elektron (minder dan ongeveer 500 nm dik). Een bijkomend probleem is dat het vacuüm eisen van deze instrumenten zelden getolereerd door waterbevattende monsters. Meestal biologische monsters moet ofwel chemisch vastgesteld (vervangen water met bijvoorbeeld polymeren) en gedroogd. In beide gevallen, belangrijke wijzigingen in demorfologie en structuur van het model zijn te verwachten. Cryo TEM bereiding van gehydrateerde preparaten induceert minimale chemische veranderingen en produceert monsters zo dicht mogelijk bij hun natuurlijke toestand, vooral als verglazing ijs verkregen 1-6.

De FIB wordt wijd gebruikt om TEM monsters te bereiden vanwege de vele voordelen 7. Om een ​​paar te noemen: het gebruik van hoge-energie-ionen bij bijna-normale inval minimaliseert het effect van materiaal ivm differentieel frezen tarieven; de regio uit het verzamelmonster kan worden gekozen met een sub-micron precisie; een zeer kleine hoeveelheid materiaal wordt geëxtraheerd. Enkele recente technische ontwikkelingen hebben het mogelijk gemaakt met behulp van de FIB ook voor TEM monstervoorbereiding bij cryogene temperaturen 2,8-10. Er zijn verschillende voordelen boven de traditionele bereidingswijze van cryo-coupes 11,12 voornamelijk voor zachte materie monsters, zoals het ontbreken van mechanische vervorming van de lamel gesneden,Aangezien mes merken en de mogelijkheid samengestelde monsters met harde / zachte interfaces of componenten te bereiden.

Protocol

OPMERKING: alle parameters gegeven in dit protocol gelden voor de instrumenten en modellen hier aangegeven. Sommige van deze parameters (aangegeven door * in de tekst) kan afwijken als andere fabrikant of model gebruikt.

1. Start-up van de FIB / SEM

  1. Monteer de custom-built koud nanomanipulator (NM) tip zonder bevestiging van de Cu vlechten aan de anticontaminator (AC). In plaats daarvan ervoor zorgen dat de vlechten zijn aangesloten op de rest van de NM boven de isolatie punt op te laden te voorkomen tijdens de verscherping stap (1.2).
    1. Sluit het SEM kamer, pompen naar hoog vacuüm en het imago van de NM tip.
    2. Als de tip is stomp, gebogen of besmet door eerder gebruik, verscherpen door middel van de ionenbundel: selecteer veelhoekige freespatronen langs de zijkanten van de tip, zodat na het malen, zal de punt taps toelopen tot 1 micrometer of minder.
    3. Zodra de zijkanten van de tip zijn weg gefreesd, handmatig 90 ° te draaien de hele NM stangvan buiten de SEM kamer.
    4. Pas de veelhoekige freespatronen aan te passen aan de gedraaide punt en herhaal frezen vanuit een andere hoek.
  2. Zodra de punt is geslepen, om minder dan 1 micrometer, trek de NM en de naald van de Gas Injection System (GIS); positie van de naald zich ongeveer 1 mm boven de werkafstand (in plaats van de gebruikelijke 175 urn).
  3. Bij gebruik van een Pt-precursor, veranderen de bedrijfstemperatuur tot 24-26 ° C (in plaats van de gebruikelijke 40 ° C). Deze stappen zijn nodig voor cryo-afzetting 13 van de Pt.
  4. Open de SEM kamer en bereiden de FIB / SEM voor cryo-modus door de montage van de cryo monster podium en de AC.
  5. Schakel de NM naar de geplaatste positie en sluit de Cu vlechten op de AC. Zorg ervoor dat u niet per ongeluk de NM tip raken. Het systeem wordt gekoeld met de NM opgenomen om ervoor te zorgen dat het verlies aan flexibiliteit van de Cu gevlochten bij cryogene temperaturen NM beweging niet belemmerenment.
  6. Spoel de buizen voor koeling met droog stikstofgas gedurende enkele minuten.
  7. Pomp de cryo voorbereiding kamer en de belangrijkste monsterkamer te hoog vacuüm.
  8. Voeg vloeibare stikstof aan de Dewars beide kamers te koelen. Wacht tot de gewenste temperatuur wordt bereikt.

2. Sample Bevriezing

    1. Monteer twee TEM roosters voor FIB monsters op de SEM overdracht houder. Zet ze vast met de bijbehorende schroeven met een schroevendraaier.
    2. Monteer een monster stub geschikt is voor het model en voeg een deel van de monsters. Afhankelijk van het monster, kan het monster worden bevestigd met cryogene lijm of met een klem. Gebruik bedragen zo klein mogelijk optimaal worden bevroren.
    3. Monteer de SEM overdracht houder op het vacuüm overbrengingsapparaatje (VTD).
    1. Voeg vloeibare stikstof in de slushing station en pomp omlaag naar stikstof slush verkrijgen.
    2. Open de slushing station en duik-vries de SEM overdracht houder. Pump down weer aan de kook is voltooid en weer slush wordt verkregen. Opgemerkt zij dat ethaan of propaan slush of hogedruk vriezen beter technieken om de verglazing van het monster te verkrijgen.
    1. Trek de SEM overdracht houder in de vacuümkamer van de VTD en verzegelen.
    2. Vent de slushing station en de cryo voorbereiding kamer luchtsluis.
    3. Overeenkomen met de VTD afdichting met de luchtsluis van de cryo voorbereiding kamer en pomp.
    4. Wanneer een goede vacuüm is bereikt, gaan de luchtsluis pin om het zegel van de VTD en de buitenste luchtsluis openen; Steek de SEM overdracht houder. Er zijn markeringen op de glijdende contacten in de voorbereiding kamers met vermelding van de steekproef positie voor sputteren en breken.
  1. Indien nodig, kan het monster worden: gebroken met de koude mes; gesublimeerd door een hogere temperatuur (gewoonlijk -1006, C); bedekt met Au / Pd of Pt via de koude sproei (300 V, 10 mA, 60 seconden voor een 2-3 nm Au / Pd cap) *. Sublimatie mag niet worden gebruikt voor verglaasd monsters hun herkristallisatie te voorkomen.
    1. Gebruik de koude mes om de beschermende deksels van de TEM rooster sleuven openen.
    2. Breng de koude fase in de monsterkamer naar de ontvangende hoogte (16 mm *).
    3. Schakel de HT op het FIB / SEM en open de binnenste luchtsluis.
    4. Gebruik de VTD aan de SEM houder te zetten in de monsterkamer. Dimmen van de verlichting in de kamer kan helpen in deze stap.
    5. Zodra de SEM houder is in de koude fase, schakel de VTD door te drukken en te draaien.
    6. Trek de VTD staaf helemaal in de VTD vacuümkamer en sluit de binnenste luchtsluis, de buitenste luchtsluis en de VTD afdichting. De buitenste luchtsluis kan nu worden afgevoerd naar de VTD afdichting te verwijderen. Deze laatste stap is niet vereist, maar het wordt aanbevolen als de VTD staaf gemakkelijk kan worden verdreven door een ongeval, wat schade kan veroorzakende VTD of de luchtsluis.

3. Ionenverdunningstechnieken

  1. Schakel de hoge spanning op beide kolommen en stel de juiste beeldvormende parameters (versnellende spanning: 10 kV voor de elektronenbundel, 30 kV voor de ionenbundel; stipafmeting: 3; werkafstand: 5 mm, ionenbundelstroom: 10-100 pA voor imaging, 1-3 nA voor frezen) *.
  2. Gebruik de elektronenbundel een kenmerk van belang te vinden en om beelden te verwerven om de status van het monster voor de extractie van de lamel documenteren.
  3. Zodra een regio van belang (ROI) voor extractie is geïdentificeerd, markeren door ionenbundel patronen, tenzij de topografie van het monster zelf zorgt voor een gemakkelijke identificatie van de ROI, zelfs na Pt depositie. Voor grotere precisie, gebruikt de door Pettersson et al.. Methode 14 De markeringen moeten diep, breed en ver genoeg nog steeds zichtbaar na waarop de cryo-Pt depositie (die niet-sel te zijnecterende en zal enkele mm 2 van het monster oppervlak bedekken).
  4. Verwarm de precursor gas 24-26 ° C en breng de GIS naald tot een hoogte van ongeveer 1 mm boven het monsteroppervlak (zie ook stap 1.3).
  5. Terwijl de beeldvorming met de elektronenbundel, opent de gasklep voor een paar seconden. De snelheid van cryo-Pt depositie 100-500 nm / s of meer, afhankelijk van de afstand van de GIS naald, het monster en ruwheid van de gebruiker. Het is raadzaam om een ​​aantal verklaringen proef uitgevoerd om de optimale parameters bepalen.
  6. De rauwe cryo-Pt depositie is erg ruw en inhomogeen. Genezen van de borg over de ROI met behulp van een 1000 pA ionenbundel bij een lage vergroting (bijvoorbeeld 2000 X). In tegenstelling tot de cryo afzetting Dit uitharding plaats selectief en worden uitgevoerd op alleen de ROI. Het doel van deze eerste cryo-afzetting is het oppervlak van het monster tegen ionenbundel beschadiging en curtaining verminderen tijdens ion dunner 13.
  7. Kantel het monster52 ° zodat het oppervlak loodrecht op de ionenbundel. Molen afstand twee rij sleuven aan weerszijden van het ROI. Typische afmetingen voor de sleuven zijn 20-30 urn in de richting (X) parallel aan de lamel te extraheren 10-15 urn in de loodrechte richting (Y) en een variabele, schuin diepte (Z), met het diepste punt dicht bij het ROI. De helling moet 45-55 ° zijn. In sommige instrumenten, kan een rij loopgraven alleen worden gefreesd met het diepste punt op de top. In een dergelijk geval, molen een onder de ROI, roteer vervolgens het beeld 180 ° en molen de tweede aan de andere kant. De diepte van het frezen kan worden geselecteerd als de sputtersnelheid van het materiaal bekend. Voor de meeste bevroren gehydrateerde monster, kan de sputter tarief van ijs worden gebruikt 7.
  8. Kantel het monster terug naar 0 ° en gebruik de ionenbundel om weg te snijden de zijkanten en onderkant van de lamel, zorg ervoor dat de snijtekens doorlopen de lamel (ze moeten frezen sporen achterlaten op de terrasvormige hellingen molened in de vorige stap). Voeg slechts twee kleine bruggen die de lamellen met de rest van het monster.
  9. Steek de GIS naald (dit kan enigszins verschuiven de steekproef). Manoeuvreren NM totdat de punt is in fysiek contact met de lamellen, bij voorkeur aan de kant. Zorg ervoor dat de NM wordt niet belemmeren van de ionenbundel weergave van de twee kleine verbindingsbruggen.
    1. Open het GIS ventiel voor een paar seconden en het toezicht op de cryo afzetting door continue beeldvorming met de elektronenbundel.
    2. Als er een extra 1-2 urn van Pt cryo-gedeponeerd is geweest, sluit de klep.
    3. Hard de Pt (zie stap 2.6) alleen de enkele urn rond het punt waar de NM in contact is met de lamellen.
    4. Gebruik een hoge ionenbundelstroom aan de lamel gratis knippen. De twee aangrenzende bruggen worden weggefreesd, alsmede boven Pt dat nieuwe contactpunten tussen de lamellen en de rest van het monster hebben gevormd. Laat de GIS naald nog niet ingetrokken.
    Manoeuvreren voorzichtig de NM om de lamel uittreksel uit de loopgraven en beweeg minstens 500 micrometer boven het monster oppervlak. Pas na deze stap, trek de GIS naald.
  10. Verlaag het monster podium een ​​paar mm en verplaats het tot een van de TEM roosters is in zicht. Verplaats de bevestiging gebied op de grid naar de werkende stand en steekt de GIS naald.
    1. Manoeuvreren voorzichtig NM bijgaande lamel in fysiek contact met het bevestigingsgebied van de TEM rooster brengen. Er mag geen druk of spanning tussen de lamellen, de TEM-net en de NM zijn.
    2. Open de gaskraan voor een paar seconden en cryo-depot een extra 1-2 urn van Pt.
    3. Cure de Pt (zie stap 2.6) alleen in de paar micrometer rond het punt van contact tussen de lamellen en de TEM-rooster.
  11. Gebruik een hoge ionenbundelstroom aan de lamellen vrij van de NM snijden. Dit kan worden bereikt door malen afstand ofwel de NM tip of de zijkant van het monster. In thij eerste geval zal de punt opnieuw worden geslepen voor het volgende gebruik, zoals beschreven in stap 1.2.
  12. OPTIONEEL: in dit stadium is het mogelijk om de VTD gebruiken om de overdracht SEM houder nemen en opslaan O / N in een Dewar gevuld met vloeibare stikstof. Deze overdracht en O / N opslag wil ijsvorming veroorzaken op het oppervlak van de lamel als ijskristallen reeds aanwezig en / of de vloeibare stikstof is blootgesteld aan vochtige lucht; maar een dergelijke verontreiniging wordt verwijderd door de volgende stap in een relatief korte tijd. Zoals de vorige stappen enkele uren hebben genomen om te voltooien, kan het aangewezen zijn om dat te doen, want na de volgende stap een dergelijke opslag O / N wordt niet aanbevolen, omdat er geen manier om het ijs te verwijderen vervuiling behalve door sublimatie (zou zijn die kunnen niet worden uitgevoerd als verglazing van het monster moet worden gehandhaafd).
  13. Kantel het monster tot 52 ° en gebruik de ionenbundel te dun om de transparantie 7 elektron. Het wordt aanbevolen om te beginnen met hogere, roughaar bundelstromen om het grootste deel te verwijderen en door te gaan naar fijn polijsten van het oppervlak met onderbalk stromingen, uiteindelijk ook het verminderen van de versnellende spanning. De uiteindelijke dikte van de lamellen moet 100-200 nm of minder voor ultrastructuur analyse in een 100-200 kV TEM of tot 500 nm voor tomografie van een 300 kV TEM, afhankelijk van het vloeistofmonster. Tijdens dunner, kan de interne spanningen van het monster veroorzaken de lamel te krullen of buigen. In dat geval moet het gedeelte verdund beperkt. Dit gebeurde bijvoorbeeld in de figuren 11 en 12.

4. Cryo Transfer naar TEM

    1. Spoel de cryo-overslagstation met droog stikstofgas voor een paar minuten.
    2. Voeg vloeibare stikstof aan de Dewar van de TEM-AC en de cryo-overslagstation.
    3. Steek de cryo-TEM overdracht houder in de juiste sleuf van de cryo-overslagstation en vul haar Dewar ook. Wacht totdat elke compponent is de gewenste temperatuur (ongeveer 15 min.) bereikt. Indien mogelijk moet de controller van de cryo-TEM overdracht houder worden aangesloten om de temperatuur te bewaken tijdens de overdracht. Het is belangrijk te beseffen dat het uiteinde van de TEM houder (indien de temperatuursensor bevindt) in contact zal komen met de cryo-overslagstation en derhalve afkoelen sneller dan de rest van de TEM houder. Het wordt daarom aanbevolen dat de tijd die de gehele cryo-TEM overdracht houder afkoelen vooraf wordt gemeten, en dat het systeem mag thermalize tenminste die tijd.
    4. Vul een cryogene kop met vloeibare stikstof en dompel daarin: de TEM monster spangereedschap, een schroevendraaier en pincet, om af te koelen hun uiteinden aan de gewenste temperatuur. Alle instrumenten moeten goed geïsoleerd aan de andere kant zodat er geen koude brandwonden aan de hand van de bediener veroorzaken.
  1. Overeenkomen met de VTD naar de buitenste luchtsluis. Breng de koude herte om de overdracht hoogte (16 mm *). Schakel de hoge spanning.
    1. Open de VTD zegel, de buitenste luchtsluis en de binnenste luchtsluis.
    2. Gebruik de VTD stang te vergrendelen in de SEM overdracht houder door te drukken en te draaien met de klok mee.
    3. Trek de SEM overdracht houder in de cryo voorbereiding kamer.
    4. Gebruik de koude mes om de beschermende deksels van de TEM roosters sluiten. Dit is nodig om mogelijke ijs contaminatie tijdens de overdracht te verminderen.
    5. Gebruik de VTD stang waarmee het monster in de vacuümkamer van de VTD bewegen.
    6. Sluit de luchtsluizen en afdichting.
  2. Vent de buitenste luchtsluis en maak de VTD. Overeenkomen met de VTD aan de SEM-poort van de cryo-overslagstation. Terwijl spoelen met droge stikstof, gebruikt u de pin op het station naar het zegel van de VTD openen en schuif de SEM overdracht houder in de Dewar van de cryo-overslagstation.
    1. Voeg genoeg vloeibare stikstof, zodat het niveau in de cryo-overslagstation is hoog genoeggewoon onderdompelen het monster.
    2. Gebruik de eerder gekoeld schroevendraaier om een ​​van de deksels te openen en draai de bijbehorende schroef dat is het bijhouden van de TEM rooster op zijn plaats.
    3. Gebruik de eerder afgekoeld pincet om de TEM rooster halen en plaats deze in de TEM-houder.
    4. Gebruik de afgekoelde hexring de TEM rooster vast op de TEM-houder.
    5. Sluit de sluiter van de cryo-TEM overdracht houder. Het monster overdracht stap is cruciaal en zou kunnen worden belemmerd door stikstofgas verminderen van de zichtbaarheid van de kleine TEM monster.
    6. Koppel de cryo-overslagstation van het pompsysteem en het vervoer in de buurt van de TEM, samen met de zonneboiler controller van de cryo-TEM overdracht houder.
    7. Start de turbomoleculaire pomp van de TEM om de steun lijn pompen om de TEM luchtsluis.
    8. Stel de TEM monster podium om een ​​tilt * van -70 °.
    9. Stel de kortste pomptijd voor de luchtsluis (30-60 sec), met slechts een cyclus van spoelen met droog stikstofgas.
    10. Zorg ervoor dat de beschermende afsluiting van de cryo-TEM overdracht houder is gesloten. Verwijder de TEM houder van de cryo-overslagstation en steek deze in de gekantelde goniometer (vloeibare stikstof zal morsen uit de TEM houder Dewar). De pompen cyclus zal beginnen. Nadat de cyclus is voltooid, zet de goniometer terug kantelen naar 0 ° en, tegelijkertijd, houdt de TEM houder, zodat deze niet meedraait met de goniometer. Breng het goed in de TEM. Tijdens deze stap moet de cryo-TEM overdracht houder verbonden zijn verwarmerregelaar om de temperatuur te controleren. De procedure om de monsterhouder in te voegen in de TEM kunnen variëren tussen verschillende systemen. Het wordt daarom aanbevolen om de TEM fabrikant contacteren om de juiste procedure te verkrijgen.
    11. Vul het cryo-TEM overdracht houder Dewar. Wacht totdat het vacuüm in de TEM tot een aanvaardbaar niveau.

Representative Results

In dit werk hebben we gebruik gemaakt van: een dubbele bundel FIB / SEM uitgerust met een nanomanipulator en een cryo-preparaat kamer; een TEM met een cryo-overdracht houder; een prototype cryo-overslagstation. De anticontaminator (AC) bladen van de cryo-bereidingskamer en de punt van de nanomanipulator (NM) werden gemodificeerd door Gatan. Ten opzichte van een standaard cryo-voorbereiding kamer, de AC bladen zijn groter om een ​​groter koellichaam voor de NM tip bieden. Bovendien is de AC uitgerust met klemmen voor aansluiting van Cu vlechtwerk voor warmtewisseling met de NM tip. De pneumatiek van het FIB / SEM werden gewijzigd om de NM te zijn en blijven zitten, zelfs wanneer de monsterkamer werd ontlucht. Opgemerkt zij dat de parameters die in dit werk het best geschikt voor de bovengenoemde apparatuur; deze parameters aangepast moet worden bij het werken met andere soorten apparatuur. Om te werken met dit protocol, de normale voorzorgsmaatregelen voor het omgaan cryogene, vloeibare stikstof en vacuüm systemen moetenworden gevolgd.

De methode is getest op verschillende soorten monsters met goede resultaten, variërend van oplossingen of polymeermatrices met nanodeeltjes, om eencellige organisme nematoden. Voorbeelden van de verschillende stappen van de procedure zijn weergegeven in de figuren 1-12 op A. niger sporen gekleurd met osmiumtetroxide en kaliumpermanganaat. De sporen worden eerst afgebeeld door SEM (figuur 1) naar de plaats identificeren extractie. In dit geval, een dwarsdoorsnede van een spore voldoende, maar het is mogelijk om de ROI voor extractie met sub-micrometer nauwkeurig te positioneren, bijvoorbeeld snijden een bepaalde cel op een bepaalde afstand van het celmembraan. Wanneer de eigenschap van belang is geïdentificeerd, wordt de eerste stap van de cryo-Pt depositie uitgevoerd (figuur 2), het monster van bundel schade van de ionenverdunningstechnieken beschermen. Het monster wordt gekanteld tot 52 ° te gaan met de eerste stappen of het malen (figuur 3): de sputteren twee sleuven aan beide zijden van de lamel. Het monster wordt daarna weer gekanteld en verder gemalen slechts twee kleine bruggen te sluiten op de massa (Figuur 4) verlaten. De afgekoelde nanomanipulator in contact gebracht met de lamellen (fig. 5) en een cryo-afzetting Pt soldeert deze samen (figuur 6). De kleine verbindingsbruggen worden dan weg gefreesd en NM beweegt de lamellen nabij de bevestiging gebied van de TEM rooster (fig. 7), waar het wordt gesoldeerd met een laatste cryo-depositie van Pt (figuur 8). De NM wordt vervolgens van de lamel (figuur 9), die is verdund transparantie van de ionenbundel (figuur 10 en 11) elektronen. De lamel wordt tenslotte naar de TEM (figuur 12) waar een hoge resolutie imaging, spectroscopie, tomografie en andere technieken can worden gebruikt.

Figuur 1
Figuur 1. Cryo-SEM-opname van sporen van A. niger, voordat Pt depositie.

Figuur 2
Figuur 2. Hetzelfde gebied in Figuur 1 na Pt afzetting maar vóór het uitharden.

Figuur 3
Figuur 3. Cryo-SEM beeld van hetzelfde gebied in Figuur 2, schuin 52 º, na Pt depositie en uitharden, met sleuf frezen gang(Zie stap 3.7).

Figuur 4
Figuur 4. De lamellen, klaar voor lift-out.

Figuur 5
Figuur 5. De koude nanomanipulator tip contact maakt met de lamellen.

Figuur 6
Figuur 6. Een tweede Pt cryo-depositie wordt gebruikt om elkaar te solderen de nanomanipulator en de lamellen.

"Figuur Figuur 7. Het koude nanomanipulator wordt gebruikt om de lamel te dragen aan het bevestigingsgebied van de TEM rooster.

Figuur 8
Figuur 8. Cryo-depositie wordt opnieuw gebruikt om de lamel te hechten aan de TEM rooster.

Figuur 9
Figuur 9. De lamel is vrij van de nanomanipulator snijden en het is nu klaar voor of opslag of dunner transparantie elektron.


Figuur 10. Een tussenstap van de verdunning, met enkele sporen zichtbaar in dwarsdoorsnede.

Figuur 11
Figuur 11 Cryo-SEM beeld van het monster na laatste dunner.; meeste andere sporen weg moest frezen, omdat de lamel begon te krullen.

Figuur 12
Figuur 12. Een samengestelde cryo-TEM beeld van de lamel. Een deel van de Al stub is opgenomenin de lamel (zwarte pijl).

Discussion

Dit protocol is een vrij eenvoudige aanpassing aan cryogene temperaturen van de standaard FIB / TEM monsters gebruikte in materiaalkunde bij RT. De methode levert TEM monsters vrij van mechanische vervorming en mes merken (het grote nadeel van microtomie), hoewel curtaining kan optreden als het monster oppervlak is homogeen. Dit kan worden verminderd door cryo-afzetting van een deklaag (in dit werk Pt werd gebruikt), gehard tot het glad en eentonig 13. Monsters met componenten zeer verschillende hardheid kan ook worden bereid zonder het risico dat zij onder spanning zou breken tijdens de bereiding. Inwendige spanningen kunnen nog steeds leiden de dunne lamel te gaan krullen, waarbij de grootte van het deel moet worden verminderd. Een nadeel in vergelijking met andere werkwijze is de mogelijkheid om de biologische structuur te veranderen door blootstelling aan de ionenbundel en eventuele implantatie van ionen in het monster. Deze nadelen treden ook bij KT monster preparatie in de materiaalkunde 15. Ze kunnen worden verminderd door het invullen de verdunning met een laatste polijststap de laagste versnellingsspanning van de ionen (500-1.000 V). Deze zeer zachte polijsten stap zal de beschadigde laag te verwijderen uit de lamel.

Vanwege de aard van de cryo-depositie (stappen 3.5, 3.10 en 3.13), worden grote delen van het monster bedekt, waardoor de weergave van het oorspronkelijke oppervlak belemmeren. Dit kan het moeilijk maken om bij te houden van de ROI houden, tenzij meerdere markeringen worden gebruikt zoals in stap 3.3.

Tijdens de stappen 4.5 en 4.7 van de dunne lamellen risico's komen in contact met de lucht. Dit moet worden vermeden omdat daardoor de luchtvochtigheid ijskristallen op het oppervlak van het monster, eventueel het punt waardoor belangrijke functies. Deze maatregelen moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd, maar tegelijkertijd een verkeerde behandeling tijdens de overdracht waarschijnlijk resulteren in het verlies van het monster tezelf. Het wordt aanbevolen dat de gebruiker die stappen beoefent door lege TEM grids voor een aanslag op een echt monster is gemaakt.

In de materiaalkunde, heeft de FIB instrument uitgegroeid tot de belangrijkste methode van TEM monstervoorbereiding binnen een decennium van de commercialisering. Omdat het kan worden gebruikt op vrijwel elk specimen, daardoor de noodzaak om de bereidingstechniek passen aan de soort monster. Wij geloven sterk hetzelfde kan gebeuren bij cryogene temperaturen, dankzij de procedure hier beschreven. De toepassing ervan op grotere steekproeven is nog onderworpen aan de mogelijkheid om cryo-bewaar ze in een verglaasde staat, maar technieken zoals duik-bevriezen of hoge druk invriezen 3,5 kan bewijzen aan de optimale oplossingen voor dit probleem zijn.

Disclosures

Auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek kregen steun van de QNano Project http://www.qnano-ri.eu dat wordt gefinancierd door de Europese Gemeenschap onderzoeksinfrastructuren onder het FP7 programma Capaciteiten (Grant No INFRA-2010-262163).

We danken ook de onderzoeksraad Formas voor financiële steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strata DB 235 FEI FIB/SEM
Omniprobe 100 Oxford Instruments Nanomanipulator
Alto 2500 Gatan Cryo preparation chamber
Cryo-holder model 626 Gatan Cryo transfer TEM holder
Tecnai F30 FEI TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Echlin, P. Low Temperature Microscopy and Analysis. Plenum Press. New York. (1992).
  2. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. J. Struct. Biol. 180, 572 (2012).
  3. Studer, D., et al. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, 285 (2001).
  4. Umrath, W. Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy. J. Microsc. 101, 103 (1974).
  5. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212, 34 (2003).
  6. Elder, H. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry. Academic Press. London. (1989).
  7. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. Introduction to Focused Ion Beams. Springer. New York. (2005).
  8. Marko, M., et al. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy. Nat. Methods. 4, 215 (2007).
  9. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J. Struct. Biol. 172, 180 (2010).
  10. Rigort, A. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).
  11. Hsieh, C., et al. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. J. Struct. Biol. 153, 1 (2006).
  12. McDowall, A. W., et al. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. J. Microsc. 131, 1 (1983).
  13. Hayles, M. F., et al. A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens. J. Microsc. 226, 263 (2007).
  14. Pettersson, H., et al. A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision. Microsc. Microanal. 19, (1), 73 (2013).
  15. Wätjen, J. T., et al. Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact. Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics