दो photon
1Department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

Neuroscience

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Yu, X., Zuo, Y. Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (87), e51520, doi:10.3791/51520 (2014).

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Abstract

स्तनधारी प्रांतस्था में न्यूरॉन्स अत्यंत जटिल नेटवर्क और synapses पर विनिमय जानकारी के रूप में. Synaptic ताकत है, साथ ही synapses के अलावा / हटाने में परिवर्तन, neuronal plasticity की संरचनात्मक आधार प्रदान करने, एक अनुभव पर निर्भर ढंग से होते हैं. प्रांतस्था में सबसे उत्तेजक synapses के postsynaptic घटकों के रूप में, वृक्ष के समान spines synapses के एक अच्छा प्रॉक्सी माना जाता है. माउस आनुवंशिकी और फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीक, व्यक्तिगत न्यूरॉन्स और उनके synaptic संरचनाओं के ले फायदे बरकरार मस्तिष्क में लेबल किया जा सकता. यहाँ हम इन विवो में समय के साथ fluorescently लेबल postsynaptic वृक्ष के समान spines पालन करने के लिए दो photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक transcranial इमेजिंग प्रोटोकॉल परिचय. इस प्रोटोकॉल बरकरार खोपड़ी रहता है और तानिका के जोखिम और प्रांतस्था की वजह से भड़काऊ प्रभाव से बचा जाता है जो एक पतला खोपड़ी तैयारी, इस्तेमाल करता. इसलिए, छवियों सु के बाद तुरंत प्राप्त किया जा सकता हैrgery किया जाता है. प्रयोगात्मक प्रक्रिया घंटे से साल से लेकर विभिन्न समय के अंतराल पर repetitively किया जा सकता है. इस तैयारी के आवेदन भी शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत, विभिन्न cortical क्षेत्रों और परतों है, साथ ही अन्य प्रकार की कोशिकाओं की जांच करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है.

Introduction

स्तनधारी प्रांतस्था संवेदी धारणा और आंदोलन नियंत्रण से अमूर्त सूचना संसाधन और अनुभूति के लिए, कई मस्तिष्क कार्यों में भाग लेता है. विभिन्न cortical कार्यों न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के संवाद स्थापित करने और व्यक्तिगत synapses पर जानकारी का आदान प्रदान से बने होते हैं जो अलग तंत्रिका सर्किट, पर निर्माण. synapses की संरचना और समारोह लगातार अनुभवों और विकृतियों के जवाब में संशोधित किया जा रहा है. परिपक्व मस्तिष्क में, synaptic plasticity के गठन और एक कार्यात्मक तंत्रिका circuitry के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, ताकत परिवर्तन और synapses के अलावा / हटाने दोनों का रूप ले लेता है. वृक्ष के समान spines स्तनधारी मस्तिष्क में उत्तेजक synapses के बहुमत के postsynaptic घटक हैं. लगातार कारोबार और कांटा के morphological परिवर्तन synaptic कनेक्शन 1-7 में संशोधन का एक अच्छा संकेत के रूप में काम करने के लिए माना जाता है.

दो photon लेजर स्कैनिंग सूक्ष्मscopy मोटी, अपारदर्शी तैयारियाँ और बरकरार मस्तिष्क 8 में रहते इमेजिंग के लिए उपयुक्त बनाता है, जो कम phototoxicity, के माध्यम से गहरी पैठ प्रदान करता है. फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ संयोजन में, दो photon इमेजिंग रहने वाले मस्तिष्क में झांकना और उच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान के साथ व्यक्तिगत synapses पर संरचनात्मक पुनर्गठन का पालन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है. विभिन्न तरीकों रहते इमेजिंग 9-13 के लिए चूहों को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहाँ, हम माउस प्रांतस्था में postsynaptic वृक्ष के समान spines के संरचनात्मक plasticity की जांच के लिए vivo में दो photon इमेजिंग के एक पतला खोपड़ी तैयारी का वर्णन है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हमारे हाल के अध्ययनों से fluorescently लेबल neuronal सबसेट और vivo में लेबलिंग तकनीक के तेजी से विकास के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों की बढ़ती उपलब्धता के साथ सीखने मोटर कौशल के जवाब में वृक्ष के समान रीढ़ परिवर्तन की एक गतिशील चित्र दर्शाया है, यहाँ वर्णित इसी तरह की प्रक्रियाओं को भी लागू किया जा सकता है जांच करने के लिएते अन्य प्रकार की कोशिकाओं और cortical क्षेत्रों, अन्य जोड़तोड़ के साथ संयुक्त है, साथ ही 16-23 रोग मॉडल में इस्तेमाल किया.

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Protocol

स्वीकृति सर्जरी और इमेजिंग अध्ययन के प्रारंभ से पहले घर संस्थानों से प्राप्त करने की आवश्यकता है. इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगों कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सांता क्रूज़ संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति से दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

1. सर्जरी

  1. सभी सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव और अच्छी तरह से सर्जरी से पहले 70% शराब के साथ कार्यक्षेत्र बाँझ.
  2. KX संवेदनाहारी समाधान (200 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 20 मिलीग्राम / किलो xylazine) की intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) द्वारा माउस anesthetize माउस के शरीर के वजन के अनुसार नोट:. KX खुराक स्वास्थ्य की स्थिति तनाव, उम्र के हिसाब से समायोजित किया जा सकता है चूहों की. इष्टतम खुराक निर्धारित करने के लिए पशु चिकित्सा परामर्श भी सिफारिश की है.
  3. माउस के पैर की उंगलियों दबाने और संज्ञाहरण स्थिति पर नजर रखने के लिए एक reflexive प्रतिक्रिया के लिए जाँच द्वारा समय समय पर एक पैर के अंगूठे चुटकी परीक्षण प्रदर्शन करते हैं.माउस को पूरी तरह से सर्जरी शुरू करने से पहले anesthetized है कि नोट सुनिश्चित करें:. लंबे समय तक इमेजिंग सत्र के दौरान, यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त KX प्रबंधन, समय - समय माउस के संज्ञाहरण स्थिति की जांच.
  4. सर्जरी के दौरान शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर माउस रखें.
  5. खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग माउस का सिर दाढ़ी.
  6. शराब पैड और betadine बारी के साथ त्वचा पोंछते द्वारा मुंडा क्षेत्र जीवाणुरहित. किसी भी अवशिष्ट बाल कतरनों निकालें.
  7. धीरे इसलिए प्रयोग के दौरान निर्जलीकरण की वजह से स्थायी क्षति को रोकने, दोनों आंखों चिकना करने के लिए नेत्र मरहम लागू होते हैं.
  8. खोपड़ी के midline के साथ एक सीधे चीरा, और खोपड़ी के किनारों की ओर laterally त्वचा चाल है.
  9. खोपड़ी से जुड़ी संयोजी ऊतक निकालें.

2. Thinned खोपड़ी तैयारी

  1. STER पर आधारित इमेजिंग क्षेत्र की पहचान. eotaxic निर्देशांक नोट: बड़े रक्त वाहिकाओं, जो ब्लॉक प्रकाश पैठ से बचने और imaged संरचनाओं को धुंधला करने की कोशिश करो. खोपड़ी बाँझ खारा के साथ नम है जब vasculature सबसे अच्छा मनाया जाता है.
  2. खोपड़ी (0.5-1.0 मिमी व्यास) की पतली एक परिपत्र क्षेत्र के लिए उच्च गति सूक्ष्म ड्रिल का प्रयोग करें. बल्कि खोपड़ी के खिलाफ इसे पकड़ और नीचे दबाने से, खोपड़ी की सतह के लिए ड्रिल समानांतर चलते. ड्रिल बाहरी कॉम्पैक्ट हड्डी परत और मध्य चिमड़ा हड्डी परत दोनों जब तक हटा रहे हैं नोट:. Overheating की वजह से नुकसान को रोकने के लिए, ड्रिल बिट और खोपड़ी के बीच लंबे समय तक संपर्क से बचें.
  3. ड्रिल thinned क्षेत्र के केंद्र में एक microsurgical ब्लेड के साथ आंतरिक कॉम्पैक्ट हड्डी परत thinning जारी. एक समान रूप से लगभग की मोटाई के साथ छोटे क्षेत्र (200-300 माइक्रोन व्यास) पतला जब तक खोपड़ी के खिलाफ नीचे दबाने के बिना खोपड़ी परिमार्जन करने के लिए लगभग 45 डिग्री के कोण पर microsurgical ब्लेड पकड़ोly 20-30 माइक्रोन प्राप्त की है. . कारण खोपड़ी के ऑटो प्रतिदीप्ति के लिए, मोटाई दो photon माइक्रोस्कोप नोट के तहत खोपड़ी के ऊपरी और निचली सतह के बीच दूरी की स्कैनिंग से मापा जा सकता है: कम से कम 20 माइक्रोन से एक खोपड़ी मोटाई अच्छा इमेजिंग गुणवत्ता प्रदान करता है, यह बाद पुन: इमेजिंग सत्र में thinning प्रक्रिया कठिन बना देता है क्योंकि यह अनुशंसित नहीं है. पर-thinning से बचने के लिए, खोपड़ी की मोटाई (चर्चा देखें) सर्जरी के दौरान समय समय पर जाँच की जानी चाहिए.

3. स्थिरीकरण

  1. ध्यान से हड्डी मलबे को हटा दें.
  2. Autoclaved किया गया है जो बाँझ सिर थाली, के केंद्र खोलने के एक किनारे पर cyanoacrylate गोंद की एक छोटी सी बूंद (चित्रा 1 देखें) रखें. . उद्घाटन के केंद्र नोट में स्थित पतला क्षेत्र के साथ खोपड़ी के खिलाफ कसकर सिर थाली पकड़ो: गोंद पतला आर contaminates हैंदुर्घटना से egion, microsurgical ब्लेड के साथ सावधानी से इसे हटा दें.
  3. धीरे सिर थाली के केंद्र खोलने के किनारों के लिए खोपड़ी की तरफ से त्वचा खींच.
  4. सिर थाली में अच्छी तरह से खोपड़ी से जुड़ा हुआ है, जब तक लगभग 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें.
  5. (देखें चित्र 1) होल्डिंग प्लेट की दो पार्श्व ब्लॉक पर सिर थाली प्लेस और उसके बाद होल्डिंग प्लेट पर माउस स्थिर सिर थाली के किनारों पर शिकंजा कसने नोट:. के बीच कोई त्वचा या मूंछ है कि सुनिश्चित करें शिकंजा कस पहले सिर थाली और ब्लॉकों. जानवर की पीठ धीरे पीठ थपथपाई है जब एक अच्छा immobilized तैयारी विदारक खुर्दबीन के नीचे खोपड़ी का कोई प्रत्यक्ष आंदोलन को दिखाना चाहिए.
  6. . Unpolymerized गोंद निकालने के लिए नमक के साथ संपर्क में खोपड़ी कुल्ला नोट: unpolymerized गोंद छवियों blurs और हर्जाना उद्देश्यों खुर्दबीन के रूप में यह किसी भी शेष गोंद निकालने के लिए महत्वपूर्ण है <./ ली>

4. इमेजिंग

  1. (देखें चित्र 2) बाद इमेजिंग सत्र में imaged क्षेत्र को स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो नक्शा 1, के रूप में पतला क्षेत्र के साथ संपर्क में खोपड़ी की वाहिका संरचना की एक फोटो ले.
  2. इमेजिंग खुर्दबीन के नीचे माउस रखें. Epifluorescence का उपयोग कर एक 10X हवा उद्देश्य के तहत पतला क्षेत्र का पता लगाने और दृश्य के केन्द्र में सबसे पतला क्षेत्र चाल है.
  3. खोपड़ी के शीर्ष पर खारा की एक बूंद जोड़ें और बाँझ पानी से rinsed किया गया है जो 60x उद्देश्य, के लिए स्विच. व्यक्तिगत वृक्ष के समान spines स्पष्ट रूप से डेन्ड्राइट साथ कल्पना कर रहे हैं, जहां एक क्षेत्र का चयन करें. पहचानें और epifluorescent देखें और vasculature तस्वीर के बीच वाहिका संरचना की तुलना द्वारा नक्शा 1 पर इसी क्षेत्र लेबल.
  4. Fluorophores के अनुसार ट्यून दो photon लेजर तरंग दैर्ध्य. उदाहरण के लिए, YFP के लिए 920 एनएम; GFP के लिए 890 एनएम; DsRed और tdTomato 24 के लिए 1000 एनएम.
  5. 2 के साथ छवि के ढेर मोल60x उद्देश्य का उपयोग Z-अक्ष के साथ माइक्रोन कदम. इस छवि ढेर एक लगभग 200 माइक्रोन x 200 माइक्रोन क्षेत्र (512 x 512 पिक्सल) को शामिल किया गया और (देखें चित्र 2) बाद इमेजिंग सत्र के दौरान पुनर्वास के लिए नक्शा 2 के रूप में प्रयोग किया जाता है.
  6. 3X डिजिटल ज़ूम का उपयोग कर नक्शा 2 के भीतर नौ छवि के ढेर मोल. . प्रत्येक छवि पर ढेर Z-अक्ष नोट के साथ 0.7 माइक्रोन कदम के साथ, 70 माइक्रोन x 70 माइक्रोन (512 x 512 पिक्सल) की एक अनुमानित क्षेत्र शामिल हैं: phototoxicity कम करने के लिए नमूनों को मापा जब लेजर की तीव्रता 40 मेगावाट से नीचे होना चाहिए.

5. वसूली

  1. इमेजिंग के बाद, धीरे खोपड़ी से सिर थाली अलग.
  2. अच्छी तरह से खोपड़ी और सभी शेष गोंद निकालने के लिए त्वचा को साफ नोट:. त्वचा पर कोई शेष गोंद irritations कारण और खोपड़ी पर किसी भी शेष गोंद खोपड़ी का कटाव और एक कारण होगा, जबकि त्वचा चिकित्सा धीमी हो जाएगीngiogenesis नव विकसित हड्डी परत में, बाद में स्थानांतरण और फिर से इमेजिंग मुश्किल बना रही है.
  3. खोपड़ी और खारा कई बार साथ त्वचा कुल्ला.
  4. बाँझ शल्य सीवन के साथ खोपड़ी सीवन.
  5. एक अलग पिंजरे में एक हीटिंग पैड पर पशु रखें. पोस्ट ऑपरेटिव दर्द को कम करने के लिए subcutaneously buprenorphine एनाल्जेसिक (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन. पूरी वसूली के बाद घर पिंजरे में पशु लौटें. चीरा चंगा है और टांके हटा रहे हैं जब तक (प्रतिदिन कम से कम एक बार जाँच) बारीकी से पशु मॉनिटर. अगर जरूरत buprenorphine एनाल्जेसिक के बाद इंजेक्शन प्रशासन.

6. Reimaging

  1. दोहराएँ 1.1-1.8 कदम.
  2. दोहराएँ 3.1-3.6 कदम
  3. 1 मानचित्र को वाहिका संरचना पैटर्न और 2 मानचित्र को वृक्ष के समान शाखा पैटर्न की तुलना द्वारा पहले से imaged क्षेत्र जानें.
  4. Reimaging 1 सप्ताह के भीतर किया जाता है, तो पतला फिर से शीर्ष पर नव विकसित हड्डी की पतली परत को हटाने के लिए 2.3 कदम दोहरानेmicrosurgical ब्लेड का उपयोग इलाके. Reimaging अधिक से अधिक 1 सप्ताह के बाद किया जाता है, तो चरण 2.2 और 2.3 दोनों दोहराने नोट:. नव विकसित हड्डी परत कम छवि गुणवत्ता के लिए अग्रणी मूल कॉम्पैक्ट हड्डी परत की तुलना में एक कम गाढ़ा संरचना के होते हैं. इसलिए, एक ही गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, यह पिछले इमेजिंग सत्र की तुलना में थोड़ा अधिक पतली खोपड़ी के लिए आवश्यक है.
  5. पहले दो photon माइक्रोस्कोप के नीचे छवि के ढेर लिया है कि मैच छवि के ढेर प्राप्त करने के लिए स्थिति और अभिविन्यास समायोजित करें.
  6. चरण 4.6 में के रूप में छवियों मोल.
  7. दोहराएँ इमेजिंग के बाद 5.1-5.5 कदम.

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Representative Results

YFP-एच लाइन चूहों 25 में, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रांतस्था में ऊपरी परत को उनके एपिकल डेन्ड्राइट परियोजना जो परत वी पिरामिड न्यूरॉन्स की एक सबसेट में व्यक्त करता है. पतला खोपड़ी तैयारी के माध्यम से, fluorescently लेबल वृक्ष के समान क्षेत्रों repetitively घंटे से महीनों से लेकर विभिन्न इमेजिंग के अंतराल पर दो photon माइक्रोस्कोप के अंतर्गत imaged किया जा सकता है. यहाँ हम व्यक्तिगत कांटा के साथ ही filopodia स्पष्ट रूप से डेन्ड्राइट साथ देखे जा सकते हैं, जहां एक 1 महीने पुराने माउस, की मोटर प्रांतस्था में 8 दिन से अधिक एक ही डेन्ड्राइट के चार बार इमेजिंग का एक उदाहरण दिखा. आमतौर पर, छवि के ढेर की गहराई pial सतह से लगभग 100-200 मीटर है. तमाम विश्लेषणों इन छवियों के आधार पर किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, रीढ़ की हड्डी गठन, उन्मूलन और कारोबार अलग सत्रों से छवियों की तुलना द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. रीढ़ घनत्व dendrit की लंबाई से कांटा की संख्या से विभाजित करके गणना की जा सकतीआईसी खंड. रीढ़ गतिशीलता और आकारिकी का परिवर्तन भी विश्लेषण किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Vivo इमेजिंग में दो फोटोन के लिए पतला खोपड़ी तैयारी की कस्टम स्थिरीकरण प्लेटें. (ए) टेप से कवर तेज किनारों के साथ, एक साथ चिपका दो या तीन रेज़र ब्लेड से बना है जो सिर थाली, की एक तस्वीर. (बी) 1 स्टेनलेस स्टील प्लेट, 2 स्टेनलेस स्टील ब्लॉक, 2 शिकंजा, और 2 spacers के होते हैं जो होल्डिंग प्लेट, की एक तस्वीर.

चित्रा 2
चित्रा 2. माउस मोटर प्रांतस्था में एक पतला खोपड़ी तैयारी के माध्यम से Transcranial दो photon इमेजिंग, विवो छवियों में दो फोटान का अधिग्रहण किया गया है, जहां इस क्षेत्र को इंगित करता है. (ख) 1 महीने पुरानी माउस (नक्शा 2) के मोटर प्रांतस्था में वृक्ष के समान शाखाओं का एक कम बढ़ाई अधिकतम प्रक्षेपण. उसी वृक्ष के समान खंड (सी) दोहराए छवियों नवगठित कांटा (तीर), सफाया कांटा (तीर), और 0 दिन, 2, 4, और 8 पर filopodia (स्टार) प्रकट करते हैं. बाएं पैनल के एक उच्च बढ़ाई दृश्य है (बी) में बॉक्सिंग क्षेत्र में दिखाया वृक्ष के समान खंड. स्केल सलाखों: 500 माइक्रोन (ए), 20 माइक्रोन (बी), और 2 माइक्रोन (सी).

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Discussion

एक सफल पतला खोपड़ी तैयारी प्राप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में कई कदम महत्वपूर्ण हैं. 1) खोपड़ी की मोटाई. कपाल की हड्डी दो उच्च घनत्व कॉम्पैक्ट हड्डी की परतों और कम घनत्व चिमड़ा हड्डी के एक मध्यम स्तर के साथ, एक सैंडविच संरचना है. उच्च गति सूक्ष्म ड्रिल कॉम्पैक्ट हड्डी और चिमड़ा हड्डी की बाहरी परत को हटाने के लिए उपयुक्त है, microsurgical ब्लेड कॉम्पैक्ट हड्डी की भीतरी परत thinning के लिए आदर्श है. विकास के दौरान खोपड़ी बढ़ जाती है की मोटाई और कठोरता के रूप में, वयस्क चूहों की इमेजिंग अच्छी गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के क्रम में हटा दिया जाना अधिक हड्डी की आवश्यकता है. पतला क्षेत्र एक पारदर्शी ठोस उपस्थिति दर्शाती है और खोपड़ी की मोटाई लगभग 20-30 मीटर है जब अच्छा इमेजिंग गुणवत्ता प्रदान करता है. पर-thinning बाद reimaging सत्र में thinning प्रक्रिया कठिन बना देता है के रूप में खोपड़ी मोटाई thinning प्रक्रिया के दौरान समय समय पर जाँच की जानी चाहिए. 2) thinned क्षेत्र का आकार.यह एक शंकु की तरह गुहा हासिल की है, जहां एक स्थिर पतला खोपड़ी विन्यास, स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक उचित आकार के साथ thinned क्षेत्र की वास्तुकला प्रांतस्था को क्षति के कारण से बचाता है और बाद में फिर से इमेजिंग सत्र में thinning में मदद करता है. यह शीर्ष खोलने (व्यास में लगभग 0.5-1.0 मिमी) की तुलना में छोटे पतला क्षेत्र के तल क्षेत्र (व्यास में लगभग 200-300 मीटर) बनाने की सिफारिश की है. 3) छवियों की स्थिरता. एक अच्छी तरह से स्थिर तैयारी श्वसन प्रेरित आंदोलन कलाकृतियों को कम करने से छवि गुणवत्ता में सुधार करने में मदद करता है. यह सिर थाली खोपड़ी पर संलग्न करने से पहले सूखे और संयोजी ऊतक और हड्डी मलबे से रहित खोपड़ी रखने के लिए महत्वपूर्ण है. अतिरिक्त गोंद भी सिर थाली और खोपड़ी के बीच शेष अंतराल को भरने के लिए आवेदन किया जा सकता है. इसके अलावा, दूर बड़ा वाहिका संरचना से एक क्षेत्र को लक्षित भी रक्त पंप की वजह से आंदोलनों को कम करता है.

ब्रा में परिवर्तन की जांचदो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग उच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान के साथ रहने वाले जानवरों के में एक ऑप्टिकल खिड़की की पीढ़ी की आवश्यकता है. पतला खोपड़ी तैयारी के अलावा, fluorescently लेबल संरचनाओं भी खोपड़ी को दूर करने और एक स्पष्ट इमेजिंग खिड़की 10, 13 में प्रावधान है कि एक गिलास को कवर (व्यास में आम तौर पर 3-5 मिमी) के साथ जगह से देखे जा सकते हैं. पतला खोपड़ी और खुले खोपड़ी इमेजिंग प्रोटोकॉल दोनों में vivo इमेजिंग अध्ययन के लिए मोटे तौर पर लागू कर रहे हैं, वहीं प्रत्येक विधि अपने फायदे हैं और विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए उपयुक्त है. उदाहरण के लिए, खुले खोपड़ी तैयारी अपेक्षाकृत बड़े मस्तिष्क क्षेत्रों (जैसे, 5 मिमी व्यास) की जांच और कम अंतराल (यानी, दिन) के साथ कई इमेजिंग सत्र की आवश्यकता है कि अध्ययन के लिए उपयोगी है. कपाल खिड़की सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित किया जाता है एक बार, कोई अतिरिक्त सर्जरी की आवश्यकता है. हालांकि, एक के बाद सर्जरी की अवधि (आमतौर पर लगभग 1 महीना) पहले इमेजिंग से पहले आवश्यक हैसर्जरी की वजह से संभावित भड़काऊ प्रतिक्रियाओं उन्नति सत्र. कपाल खिड़की हड्डी और / या meninges की उमड़ना के regrowth द्वारा अवरुद्ध है जब पुनः इमेजिंग असंभव हो जाता है. इसके विपरीत, एक पतला खोपड़ी तैयारी के साथ जानवरों (2 सप्ताह पुराने उदाहरण के लिए,) छोटे जानवरों की पुरानी इमेजिंग के लिए यह अधिक उपयुक्त बनाने, प्रारंभिक सर्जरी के बाद तुरंत imaged किया जा सकता है. हड्डी regrowth और ड्यूरा उमड़ना समस्याग्रस्त नहीं है, क्योंकि यह लंबे इमेजिंग अंतराल (वर्षों तक यानी महीने) के साथ जांच के लिए उपयुक्त है. हालांकि, खोपड़ी के फिर से thinning आमतौर पर बाद में फिर से इमेजिंग सत्र के लिए कारण हड्डी regrowth के लिए (यहां तक ​​कि के साथ 2 दिन के अंतराल) की आवश्यकता है. इसके अलावा, नव विकसित हड्डी परत बहुत पतला खोपड़ी क्षेत्र की पारदर्शिता को कम करने, मूल कॉम्पैक्ट हड्डी की तुलना में एक कम गाढ़ा संरचना के होते हैं. इसलिए, छवियों का एक ही गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, यह पूरी तरह से नव विकसित हड्डी परत को हटाने के लिए आवश्यक है. और इस तरह एकttempts आमतौर पर पिछले तैयारी की तुलना में पतली बाद इमेजिंग में खोपड़ी के अंतिम मोटाई को जन्म दे. खोपड़ी मोटाई फिर से thinning के लिए सीमित कमरे में जा, प्रारंभिक इमेजिंग सत्र में 20-30 माइक्रोन के लिए तैयार किया गया था, पतला खोपड़ी तैयारी की कुल इमेजिंग बार आम तौर पर कम से कम 5 बार है. हाल ही में, पॉलिश और प्रबलित नाम का एक नया प्रयोगात्मक दृष्टिकोण पतला खोपड़ी (बंदरगाह) दोनों पतला और खुले खोपड़ी तैयारी 11, 26, 27 गठबंधन करने के लिए विकसित किया गया है.

अब तक, प्रांतस्था में vivo इमेजिंग के बहुमत neuronal विशिष्ट Thy1 प्रमोटर के तहत EGFP या YFP व्यक्त ट्रांसजेनिक माउस लाइनों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है. इन ट्रांसजेनिक चूहों कम एक सबसेट में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त, लेकिन cortical न्यूरॉन्स 25 की मिश्रित आबादी. सबूत के कई लाइनों अनुभव पर निर्भर संरचनात्मक plasticity sele में होता सुझाव है कि चूंकिअच्छी तरह से परिभाषित सर्किट की ctive सेल प्रकार, यह एक सेल प्रकार विशिष्ट ढंग से लेबल और छवि के लिए महत्वपूर्ण है. तिथि करने के लिए, कई दृष्टिकोण से इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए लागू किया गया है. उदाहरण के लिए, अलग cortical परतों में पिरामिड न्यूरॉन्स परिभाषित भ्रूण चरणों में 28, 29 में utero electroporation में प्रदर्शन से निशाना बनाया जा सकता है. इसी तरह, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त इंजीनियर वायरल वैक्टर का इंजेक्शन भी अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में 30 में कोशिकाओं लेबल इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों के कई लाइनों सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों 31, 32 के तहत Cre recombinase की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए उत्पन्न किया गया है. इस तरह इन चूहों में एक floxed बंद codon निम्नलिखित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन ले एडिनो से जुड़े वायरस के रूप में वायरल वैक्टर इंजेक्शन एक प्रतिबंधित क्षेत्र 33 में न्यूरॉन्स की एक निर्दिष्ट वर्ग को लक्षित करने की संभावना प्रदान करता है. इन नए लेबलिंग के संयोजन से हमारे thinned-S के साथ दृष्टिकोणKull तैयारी, cortical न्यूरॉन्स की synaptic कनेक्शन में परिवर्तन एक सेल प्रकार और / या सर्किट विशेष तरीके में vivo इमेजिंग में दो photon द्वारा जांच की जा सकती है.

ट्रांसजेनिक जानवरों की बढ़ती उपलब्धता के साथ साथ fluorescently लेबल सेल आबादी और यहां वर्णित vivo में लेबलिंग तकनीक, इसी तरह की प्रक्रियाओं का तेजी से विकास भी अन्य प्रकार की कोशिकाओं (glial कोशिकाओं) और रहने वाले मस्तिष्क में वाहिका संरचना की जांच के लिए लागू किया जा सकता है. व्यवहार जोड़तोड़ और रोग मॉडल, vivo इमेजिंग में दो फोटोन के साथ संयुक्त बहुत मस्तिष्क कार्यों अंतर्निहित आणविक, सेलुलर, और सर्किट तंत्र की हमारी समझ का विस्तार होगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgements

हम ग्राफिक चित्रण के लिए जेम्स Perna धन्यवाद. इस काम YZ के लिए मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Bioniche Pharma 67457-034-10 Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine Lloyd laboratories 139-236 Mixed with ketamine for anesthesia
Saline Hospira 0409-7983-09 0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades Electron microscopy sciences 72000 Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62 Sterile alcohol prep pads
Eye ointment Henry Schein 102-9470 Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill Fine Science Tools 18000-17 The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs Fine Science Tools 19007-14 1.4 mm diameter
Microsurgical blade Surgistar 6961 The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue Fisher Scientific NC9062131 Fix the head plate onto the skull
Suture Havard Apparatus 510461 Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope Olympus SZ61
CCD camera Infinity
Two-photon microscope Prairie Technologies Ultima IV
10X objective Olympus NA 0.30, air
60X objective Olympus NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP

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References

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