Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

Bioengineering

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Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).

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Abstract

Una gran parte del genoma umano viene trascritto ma non tradotto. In questo post genomica, funzioni di regolamentazione di RNA hanno dimostrato di essere sempre più importante. Dato che la funzione RNA spesso dipende dalla sua capacità di adottare strutture alternative, è difficile prevedere RNA strutture tridimensionali direttamente dalla sequenza. Singola molecola approcci mostrano potenzialità per risolvere il problema di RNA polimorfismo strutturale monitorando strutture molecolari una molecola alla volta. Questo lavoro presenta un metodo per manipolare con precisione la piegatura e la struttura delle molecole di RNA singoli utilizzando pinzette ottiche. In primo luogo, i metodi per sintetizzare molecole adatte a singola molecola lavoro meccanico sono descritti. Avanti, diverse procedure di calibrazione per garantire le operazioni corrette delle pinzette ottiche sono discussi. Successivamente, vari esperimenti sono spiegati. Per dimostrare l'utilità della tecnica, i risultati di dispiegamento meccanicamente forcine RNA e un singolo RNA kissing complesso sono utilizzati come prova. In questi esempi, la tecnica nanomanipolazione stato utilizzato per studiare piegatura di ciascun dominio strutturale, comprese secondaria e terziaria, in modo indipendente. Infine, le limitazioni e le future applicazioni del metodo sono discussi.

Introduction

Lo sviluppo della tecnica pinzette ottiche è stata a lungo accompagnato con la sua applicazione nella ricerca biologica. Quando l'effetto intrappolamento ottico è stato scoperto, Arthur Ashkin osservato che i batteri in acqua contaminata potrebbero essere intrappolati nel fuoco del laser 1. Da allora, i batteri trapping è diventato un involontario, divertente esperimento per generazioni di studenti biofisica, nonché come strumento di ricerca seria per studiare la fisiologia microbica 2,3. La tecnica di intrappolamento ottico utilizza focalizzato fascio laser per immobilizzare un oggetto microscopico 1. In pratica, una funzione di limitatore laser come una molla ottico, che misura anche la forza (F) sull'oggetto intrappolato dal suo spostamento dal centro della trappola (AX). Entro un breve intervallo, F = κ x AX, in κ è la costante della molla della trappola. La trappola ottica può essere utilizzato per esercitare una forza in piconewton (PN) di precisione ad un microsoggetto Copic e misurare la sua posizione con nanometri (nm) di precisione. Negli ultimi due decenni, pinzette ottiche sono diventati una delle più utilizzate tecniche di singola molecola in biofisica. La tecnica è stata impiegata per studiare piegatura e la meccanica di 4-6 DNA, RNA 7-9, e le proteine ​​10,11. Pinzette ottiche sono stati utilizzati anche per osservare la replicazione del DNA 12, trascrizione dell'RNA 13, e la sintesi proteica 14,15, così come molti altri eventi biomolecolari 16-18.

Approcci singola molecola sono impiegati in RNA ricerca strutturale principalmente per esplorare il paesaggio aspro energia folding di RNA. Una sequenza di RNA di solito può piegare in più stabili, strutture si escludono a vicenda, a causa delle semplici di composizione chimica e di sbucciatura base di regole di RNA. E 'noto da tempo che l'RNA polimorfismo strutturale, come ad esempio che si verifica in riboswitches 19,20, gioca un ruolo importante nella regolazione genica. A Recent sondaggio a livello di genoma ha rivelato che le variazioni di temperatura di soli pochi gradi influenzano notevolmente la struttura e la sintesi proteica di una grande porzione del trascrittoma cellulare 21. Questo esempio suggerisce che il ruolo biologico di RNA folding alternativa è forse più importante e pervasivo di quanto precedentemente ipotizzato. Polimorfismo strutturale, tuttavia, rappresenta una sfida per i tradizionali approcci biochimici e biofisici, che esaminano le proprietà medie di molte molecole. Ad esempio, la "a" e conformazioni "off" di un riboswitch si escludono a vicenda. Una struttura media derivato da strutture eterogenee non è in grado di assomigliare uno dei conformeri biologicamente rilevanti. Inoltre, RNA non tradotta e mRNA di solito formano strutture. La loro interazione con proteine ​​e RNA regolatori comunemente richiede svolgersi della struttura esistente come parte dell'interazione. Pertanto, lo studio di RNA dispiegamento / ripiegamento diventa un pertinentequestione di RNA biologia. Per rispondere a tale sfida, l'approccio di singola molecola è stato impiegato per svelare RNA polimorfismo strutturale studiando una molecola alla volta 22-27.

Rispetto al popolare metodo di fluorescenza singola molecola, pinzette a base meccanica dispiegarsi offre un vantaggio che conformazioni delle singole molecole possono essere manipolati con la forza applicata e essere misurate con precisione nanometrica. Questa capacità nanomanipolazione può essere utilizzato per monitorare il dispiegamento / ripiegamento dei singoli domini strutturali tali che la piegatura gerarchica di un grande RNA può essere sezionato 28. In alternativa, un singolo filo può essere diretto a piegare in uno dei diversi conformeri; o una struttura esistente può essere indotta meccanicamente per ripiegare in una diversa conformazione 29. In condizioni biologiche, una struttura di RNA può essere modificato in caso di cambio di temperatura o ligando. La capacità di manipolare direttamente s molecolariTRUTTURA apre una nuova sede di RNA studio strutturale. In linea di principio, altre tecniche meccaniche come microscopio a forza atomica e pinzette magnetiche, possono anche essere utilizzati per studiare piegatura di singole molecole di RNA. Tuttavia, tali applicazioni sono limitate soprattutto a causa della risoluzione spaziale relativamente bassa 30.

L'impiego di pinzette ottiche permette strutture di RNA di essere spiegati con la forza meccanica.

Il vantaggio di meccanica svolgimento è diverse volte. La forza può essere usata per spiegare sia le strutture secondarie e terziarie, mentre gli ioni metallici e ligando indotta piegatura sono limitati principalmente a strutture terziarie. Temperatura e denaturante possono influenzare in modo significativo le attività di acqua e soluti. Al contrario, la forza viene applicata localmente per perturbare strutture molecolari; l'effetto della forza sull'ambiente circostante è trascurabile. Inoltre, la fusione termica è meglio utilizzato per studiare la termodinamica pieghevoli di piccole strutture di RNA,considerando pinzette ottiche sono stati utilizzati per studiare le strutture di RNA con diverse dimensioni, che vanno da un sette-base-pair tetraloop tornante 28 per un ribozyme 400-nucleotide 31. Inoltre, le strutture di RNA possono essere spiegati meccanicamente a temperature mesofili. In contrasto, di dispiegarsi RNA in un esperimento di fusione termica, la temperatura è in genere ben sollevato sopra temperature fisiologiche, che aumenta significativamente l'RNA all'idrolisi, soprattutto in presenza di ioni Mg 2 +.

È importante notare che l'effetto meccanico della forza dipende da come viene applicato ad una struttura. La forza applicata inclina il pieghevole panorama energetico. Ad esempio, quando la forza è applicata ad una forcina, le coppie di basi sono rotti in sequenza, uno alla volta (Figura 1a). La forcella strappo avanza lungo l'asse elicoidale, che è perpendicolare alla forza applicata. Al contrario, quando un complesso baciare minima è sotto tensione, i due baciandocoppie di basi, che sono parallele alla forza applicata, condividono il carico di forza (Figura 1b). Le diverse geometrie del tornante e baciare relativo complesso al risultato forza applicata nella loro risposta meccanica differente, che può essere utilizzata per distinguere secondaria e terziaria piegatura 28,32. L'aspetto teorico della meccanica svolgimento è stato già recensito 8,9,30. Questo lavoro descrive gli approcci di base per impostare ed eseguire una singola molecola meccanico test dispiegarsi.

Setup sperimentale. Nel nostro esperimento trazione meccanica, il campione di RNA per tweezing è costituito da RNA di interesse affiancato da due manici a doppio filamento di DNA / RNA (Figura 2) 7. L'intera molecola può essere legato a due perle di micron-size superficie rivestita (Spherotech) tramite streptavidina-biotina e interazioni anticorpi anti-digossigenina-digoxigenin rispettivamente. Una perla è detenuto da un tr ottica forza di misuraap, mentre l'altra si tiene sulla punta di una micropipetta. La distanza relativa tra le perline può essere cambiato da uno sterzo trappola o spostando la micropipetta. Usando questo approccio, una singola molecola di RNA legare le perline può essere allungato e rilassato.

Preparazione dei campioni. La sintesi di campioni di RNA per tweezing comprende a pochi passi (Figura 3). Innanzitutto, la sequenza di DNA corrispondente alla RNA di interesse viene dapprima clonato in un vettore plasmidico. Avanti, tre reazioni di PCR vengono eseguite per generare le due maniglie e un modello per la trascrizione. Il modello trascrizione comprende le regioni della leva e le sequenze inserite. La lunghezza totale RNA è sintetizzato in vitro trascrizione. Infine, l'RNA e le maniglie modificati chimicamente sono sottoposti a ricottura insieme per generare le molecole per tweezing.

Taratura e funzionamento delle pinzette. Il disegno di base dell'uso Minitweezersd in questo lavoro segue quello dei dual-beam pinzette ottiche 33. Con molti miglioramenti, i Minitweezers visualizzare straordinaria stabilità rispetto alle pinzette ottiche di prima generazione. Un certo numero di gruppi di ricerca in diversi paesi utilizzano le Minitweezers nella loro ricerca singola molecola 14,15,34-37. I dettagli di costruzione, taratura e il funzionamento del dispositivo, inclusi video di istruzioni, sono disponibili sul sito "Pinzetta Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Qui, miglioramenti e procedure di calibrazione che devono essere eseguite su basi giornaliere sono descritte in dettaglio.

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Protocol

1 Preparazione di RNA Molecole per singola molecola Togliersi

  1. Clonazione la sequenza di interesse. Clonare la sequenza di DNA corrispondente alla struttura di RNA in un vettore.
  2. Sintesi e purificazione del template trascrizione. Sintetizzare un modello di trascrizione mediante PCR. [Tabella 1 posto qui] Avanti, purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR, e concentrare il campione> 200 ng / ml. Poiché il DNA purificato viene utilizzato per la trascrizione, RNasi acqua libera deve essere utilizzato nelle fasi di eluizione e concentrazione.
  3. Nella trascrizione in vitro. Sintetizzare RNA da trascrizione in vitro a 37 ° C per una notte per massimizzare la resa di RNA. [Tabella 2 posto qui] Dopo la trascrizione, aggiungere 1 ml DNasi I per digerire il DNA stampo per 15 minuti a 37 ° C. Purificare l'RNA utilizzando una colonna di spin di silice.
  4. Sintesi del biotinilato maniglia A. In primo luogo, produce la maniglia non modificato A mediante PCR utilizzando primers Af e Ar e concEntrate il DNA amplificato a> 200 ng / ml. Successivamente, incorporare modifiche biotina nel prodotto di PCR utilizzando una reazione di primer extension. [Luogo tabella 3 qui] NOTA: La maniglia biotinilato A (biotina-HA) può essere utilizzato direttamente nel ricottura, senza purificazione. Come la biotina-HA deve essere ricotto con l'RNA, è fondamentale utilizzare RNasi acqua libera in entrambe le fasi.
  5. Sintesi della maniglia digossigenina modificato B. Synthesize digossigenina modificato maniglia B (dig-HB) mediante PCR utilizzando fondo Bf e oligo-digossigenina modificato Dig-Br (Figura 3). Avanti, purificare il prodotto di PCR e concentrare il campione> 200 ng / ml.
  6. Ricottura RNA alle maniglie. Anneal l'RNA con maniglie. [luogo tabelle 4 e 5 qui]
  7. Purificare campione ricotto. Aggiungere 3 volumi di etanolo del campione ricotta e mescolare bene. Conservare la miscela a -70 ° C per almeno 1 ora. Spin down a 15.800 xg e scartare il surnatante. Asciugare il pellet con un liofilizzatore. Sciogliere il pellet in100 microlitri RNasi acqua libera. NOTA: Il campione è pronto per essere utilizzato e può essere conservato a -20 ° C.

2 Taratura e funzionamento delle pinzette ottiche

  1. Calibrare Pixel Dimensioni di Video Monitor
    1. Utilizzare la trappola ottica per intrappolare un cordone con diametro noto (dimensioni standard).
    2. Cattura immagini di un cordone intrappolato utilizzando software di imaging (Figura 4).
    3. Determinare il diametro della perlina utilizzando il software di imaging basata sul metodo centroide.
    4. Ripetere questa procedura per determinare diametri di perle di varie dimensioni.
    5. Montare i diametri misurati e conosciute di perle da una regressione lineare per ottenere la dimensione fisica di un pixel.
  2. Verifica Distanza di calibrazione
    1. Utilizzare la trappola ottica per intrappolare una perlina.
    2. Determinare la posizione dei pixel del suo baricentro dal software di acquisizione delle immagini e registrare la propria posizione utilizzando i Minitweezers.
    3. Steer il tallone di diffe affittare posizioni e ripetere la determinazione della posizione.
    4. Convertire le posizioni X e Y del tallone da pixel a m unità utilizzando la dimensione dei pixel calibrata.
    5. Confrontare il X e Y tra le posizioni misurate dal video e dai Minitweezers. I due insiemi di valori dovrebbero concordare. Poiché la risoluzione dell'immagine è> 0,1 micron, spostare il tallone sopra 1 micron tra le misure per garantire l'accuratezza. Se la calibrazione distanza non è paragonabile a quella memorizzata nei Minitweezers, ricalibrare lo strumento.
  3. Trappola Rigidità Calibrazione
    1. Catturare una perlina utilizzando la trappola ottica e tenerlo ancora.
    2. Registrare la forza della trappola con un bypass di acquisizione veloce di dati a una velocità> 5 kHz per 3 sec.
    3. Genera uno spettro di potenza dalla registrazione del movimento tallone utilizzando il software. Montare lo spettro di potenza di un Lorentziana (Figura 5) 38:
      542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Eq. 1)
      in cui S (f) è la potenza alla frequenza di f, f c è la frequenza di taglio, e S 0 è la potenza asintotica. La frequenza di taglio f c è la frequenza in cui la potenza del moto termico è sceso a metà del valore asintotico. Come f c varia con la potenza del laser e le dimensioni tallone, calibrare ogni perla intrappolati individualmente.
    4. Calcola la costante elastica della trappola, κ, da f c:
      Equazione 2 (Eq. 2)
      in cui γ è il coefficiente di resistenza del tallone (Eq. 3). Utilizzare la costante della molla per determinare le variazioni di estensione di un RNA dal cambiamento vigore.
  4. Stokes 'Legge di prova
    1. Catturare una perlina utilizzando la trappola ottica. Spostare il tallone posteriore-e-forza a velocità diversa.
    2. Registrare il movimento del tallone e la forza con i Minitweezers.
    3. Calcola il raggio del tallone.
      NOTA: La forza di attrito, F d, generato dal moto di una particella sferica in un fluido può essere descritto dalla legge di Stokes ':
      Equazione 3 (Eq. 3)
      in cui r è il raggio della sfera, v è la velocità, e h è la viscosità dinamica del fluido, che si trova in tabelle di riferimento. Utilizzando la forza misurata come F d, il raggio del cordone può essere calcolato utilizzando l'Eq. 3 (Figura 6) e deve concordare con quello determinato dal software di acquisizione immagini. Il test di legge di Stokes 'test efficace le tarature e le prestazioni dello strumento.

3. nanomanipolazione di Single RNA Molecole

  1. Fare fluidica.
    1. Praticare sei fori (mm diametro 2 ciascuno) su un vetro di copertura n ° 2 (Figura 7a) e tagliare tre fessure (larghezza 2 mm) nel lato doppio nastro poliimmide (Figura 7b) utilizzando un incisore laser.
    2. Fare una camera di flusso da sandwich di due vetro di copertura con due strati di nastro biadesivo Kapton. Inserire una micropipetta e due tubi bypass tra il nastro (Figura 7c).
    3. Montare la camera di flusso su un telaio metallico, facendo corrispondere i fori fluidici (Figura 7d).
    4. Collegare i canali fluidici della camera a 10 ml siringhe riempite con tampone di scelta tramite tubi di polietilene (Figura 7e).
    5. Montare l'intera camera sulle pinzette ottiche tra i due obiettivi. Assicurarsi che il lato anteriore della camera con i canali fluidici rivolto verso destra. Ritrarre l'obiettivo a destra e inserire i perni di ottone del telaio (Figura 7e) per fori di montaggio sulla tegli pinzette. Serrare le viti per fissare la posizione della camera.
  2. Mescolando il campione e perline ricotto. Mescolare il campione ricotto con perle anti-digossigenina-rivestite (DIG-sfere), e lasciare che la miscela di rimanere a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Tipicamente, 1 ml di campione ricotto è mescolato con 5 microlitri dig-perle in 1 ml di tampone. NOTA: La quantità di perline da caricare nella camera di flusso deve essere scelto al fine di garantire una ragionevole quantità di perline da consegnare dal tubo bypass. Il rapporto del campione ricotto per le perline non è facilmente quantificabile. In un caso ideale, la maggior parte dei branelli hanno RNA tale che solo una piccola frazione di perline può avere solo una molecola di RNA a tallone. Mentre i campioni ricotti e la sospensione di sferette sono difficili da quantificare, il migliore e unico modo attualmente è di variare il rapporto di miscelazione e testare il composto sulle pinzette.
  3. Invia perline al sito di reazione nella camera di flusso (cioè, alcuni micrometri in cima al mipunta cropipette, Figura 7c).
    1. Caricare una sospensione di perline rivestite di streptavidina (strep-sfere) in una siringa da 1 ml.
    2. Collegare la siringa al tubo fluidico che conduce al canale inferiore della camera di flusso (figura 7a).
    3. Spingere la siringa a scorrere le strep-perle nella camera.
    4. Spostare l'intera camera utilizzando il software di controllo del motore per posizionare la trappola ottica vicino all'apertura del tubo bypass inferiore (figura 7b). Quindi azionare la trappola ottica da una trackball per catturare una strep-tallone.
    5. Spostare il tallone vicino alla punta della micropipetta utilizzando il software di controllo del motore.
    6. Estrarre la siringa collegata alla micropipetta a succhiare il tallone sul micropipetta.
    7. Applicare flusso premendo delicatamente la siringa per il canale centrale per scovare strep-perline extra.
    8. Allo stesso modo, consegnare la miscela del campione e dello scavo-perline (vedi punto 3.2) al canale superiore della camera.
    9. Cattura uno scavo-tallone e portarlo vicino alla strep-tallone utilizzando la trappola ottica.
    10. Pulire il canale centrale mediante l'applicazione di flusso. NOTA: Il strep- e Dig-perle sono scelti per essere diverse dimensioni in modo che possano essere distinti visivamente sotto la vista microscopico (Figura 4).
  4. Pesca "una singola molecola di legare tra una coppia di perline.
    1. Posizionare il dig-tallone in verticale sulla parte superiore del strep-tallone (Figura 4).
    2. Spostare il dig-tallone verso il strep-tallone dal governare la trappola. Aprire una finestra del grafico forza-distanza sul computer per visualizzare i cambiamenti di forza.
    3. In caso di contatto delle due perle, spostare il dig-tallone verticalmente dalla strep-tallone.
    4. Se non viene fatto alcun contatto specifico, la forza rimane quasi zero. Se i due talloni sono collegati da molecole, la forza aumenta notevolmente quando i due talloni separati. Questa procedura, comunemente indicato come "pesca", è spesso perfORMED più volte su ogni coppia di perline per trovare un efficace cavezza singola molecola.

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Representative Results

Limitato dallo spazio, nanomanipolazione di singole molecole di RNA è dimostrato mostrando solo esempi meccanici dispiegarsi di forcine RNA e di un RNA con struttura terziaria.

Manipolare singolo Hairpin Molecole

Una volta che una pastoia è stabilito tra le perle, l'estensione di e vigore alla cavezza possono essere manipolati tramite un protocollo definito dall'utente. Quattro protocolli comuni di manipolazione sono comunemente usati.

Esperimento Forza-rampa. L'esperimento più intuitivo e comune a manipolare un singolo RNA è di allungare ripetutamente e rilassare la molecola nella direzione dell'asse elicoidale delle maniglie (verticalmente come mostrato nella Figura 4). La forza, F, e la posizione trappola, Y, sono registrati come una funzione del tempo. L'estensione della molecola, e, può essere calcolata e = Y - F / κ, in cui è la costante della molla del TRAp. Il risultato di trazione può essere visualizzato come la curva di forza-estensione (Figura 8a). L'allungamento delle maniglie a doppio filamento è indicato dalla curva in salita con pendenza positiva. La curva di rilassamento delle maniglie ricalca quella della stiramento. La transizione strutturale di un semplice, tornante-due stati pieghevole visualizza un "rip" con pendenza negativa, indicando un singolo, cooperativa di transizione dispiegarsi 39. Il ripiegamento della forcella è indicata da una "cerniera" sulla curva forza-estensione. È importante sottolineare che la stessa molecola può essere spiegato e ripiegato a forze diverse di volta in volta. Tale tendenza è evidente sulle distribuzioni delle forze di transizione (Figura 8B). Comunemente, la forza viene modificato come funzione lineare del tempo, cioè, ad un carico fisso / tasso di scarico. Sotto un regime di carico / scarico costante, la cinetica carico di forza possono essere estratti dalle distribuzioni delle forze di transizione 40-42.

a forza costante Experiment. In modalità forza costante, lo strumento utilizza un meccanismo di feedback per compensare le deviazioni di forza da un valore impostato. L'estensione di una molecola di RNA viene registrata in funzione del tempo (Figura 9). Impostazione della forza o vicino la forza di transizione della transizione particolare molecola di RNA permette l'osservazione e la quantificazione degli stati estensionali molecolari. Le vite della molecola ad ogni stato possono essere raggruppati insieme per calcolare la cinetica di transizione strutturale 7. L'esperimento forza costante viene utilizzata per monitorare piegatura reversibili, come quelle di forcine 7,28.

Forza Salto Experiment. In un esperimento forza salto, la forza è rapidamente trasformata in un valore diverso e mantenuta costante; la durata della prima transizione viene monitorata 43. Il salto forza è particolarmente utile per caratterizzare la cinetica diprocessi irreversibili, perché le vite di andata e d'inversione reazioni possono essere misurate direttamente separatamente in forze diverse. Ad ogni forza salto / drop, solo una vita si osserva. Pertanto, vari cicli di tali esperimenti devono essere eseguite al fine di raccogliere osservazioni sufficienti per estrarre cinetica.

Esperimenti passivi. In modalità passiva, le posizioni della trappola e la micropipetta sono entrambi fissati (Figura 10). Un tornante presenta due stati corrispondenti a RNA spiegato e ripiegato vicino le sue forze di transizione. A differenza dell'esperimento forza costante, sia la forza e l'estensione del cambiamento molecola sulla transizione strutturale. Eliminare controllo di feedback permette transizioni molecolari da monitorare direttamente senza interferenze esterne. Tuttavia, è difficile mantenere forza costante in modalità passiva rivela. Come la diffusa tallone intrappolato nella trappola ottica, forza cambia di conseguenza. Thmodalità passiva e non è adatto per la misurazione di stati molecolari con tempo di sosta lungo, durante il quale la forza è significativamente alterato. I pro ei contro della forza costante e le modalità passiva sono stati ampiamente studiati e discussi 44.

Svelare pieghevole di strutture secondarie e terziarie

Meccanico dispiegarsi di un baciare RNA a due-base-coppia formata da due tornanti tetraloop GACG collegati è utilizzato come esempio (Figura 11a). Entrambi forcine uno stelo 9-base-pair, anche se le sequenze staminali sono diversi. Il percorso svolgimento meccanica del RNA (Figura 11a) è stato caratterizzato da metodi di forza rampa 34. Quando la forza è sollevato, il complesso baciare viene prima interrotta, seguita da sequenziale svolgimento delle forcine. Il ripiegamento, le forcine piega prima, seguita da una interazione bacia alla bassa forza. Queste transizioni sono visibili sulla curva forza-estensione (Figura11b). Per confermare l'assegnazione delle transizioni tornanti, ciascuna delle forcine possono essere studiate singolarmente. L'assegnazione dei unkissing / transizioni baciare può essere verificata studiando un RNA mutante, in cui i tetraloops sono mutati per prevenire la formazione dell'interazione baciare 28. In alternativa, la forza minima può essere impostata a 10 pN, superiori alle forze baciare. Come previsto, la curva forza-estensione in tali condizioni visualizza solo il dispiegamento / ripiegamento delle forcine (Figura 11C) 34. Pertanto, è possibile indagare piegare l'interazione baciare e ciascuna delle due forcelle indipendente a forze differenti.

E 'evidente che la piegatura delle due tornanti è reversibile, mentre l'interazione baciare è altamente irreversibile, come evidente da molto diversa unkissing e forze baciare, e da grandi isteresi. Directl Pertanto, la cinetica di piegatura delle forcine possono essere studiatiy utilizzando gli esperimenti a forza costante. La cinetica dell'interazione baciare, tuttavia, devono essere misurati utilizzando il metodo della forza di salto. La 12a figura mostra un esperimento salto forza tipica 28. A 3 pN, l'intera RNA è piegato. La forza viene quindi rapidamente portata a 22 PN e mantenuta costante. Dopo alcuni secondi, l'intero RNA viene dispiegato in un singolo filamento, come evidente da un improvviso aumento di estensione di ~ 30 nm. La forza viene quindi portata a 30 pN per allungare ulteriormente l'RNA, prima che sia abbassato a 13 pN. Dopo la piegatura delle forcine, la forza è rapidamente sceso a 8 pN. La formazione del complesso kissing è indicato accorciando dell'estensione di ~ 7-8 nm. Con la raccolta di molte di queste misure a vita, unkissing e baciare cinetica a forze costanti può essere calcolato.

In tutte le condizioni sperimentali, il complesso baciare è sempre spiegato prima. Alle forze che le forcine instabili di per sé, la interagiscono baciareion protegge le strutture tornanti da svolgersi. Tale effetto limitante è rivelato anche da esperimenti di forza di salto. Come mostrato nella Figura 12b 28, quando la forza è salito a 16 pN, l'estensione della molecola rimane sostanzialmente invariato per pochi secondi, seguito da un dispiegamento aumentando l'estensione di ~ 20 nm. Le variazioni di estensione indicati il ​​più debole di sette-base-pair tornante viene spiegato subito dopo interrompere del complesso baciare. La metastabilità del tornante è evidente dalle vite. Una volta che il bacio è rotto, il tornante transita rapidamente tra gli stati piegati e spiegate; le vite sono meno di 1 sec. In sostanza, questa osservazione è un esperimento forza costante per svolgersi il tornante. Al contrario, ci vogliono più di 10 secondi per rompere il complesso baciare con il tornante. Analogamente, la forza è salito a 17,7 pN (Figura 12c), in cui l'intera RNA viene dispiegato in un singolo filamento, come evidente dalla inpiega l'estensione di ~ 30 nm. La bistabilità del grande, 11-base-pair tornante può essere visto come l'estensione luppolo tra due valori. Anche in questo caso, le brevi vite della forcella sono in netto contrasto con la sua lunga durata nello stato metastabile. Utilizzando una combinazione di forza di rampa e la forza di salto esperimenti, la termodinamica e la cinetica dei singoli che si svolgevano / fasi di piegatura può essere misurata 28. Osservazioni dirette di rottura e formazione del complesso kissing ci permette di analizzare i contributi energetici di accompagnamento basi al complesso minimo kissing 34 e per misurare la dipendenza sale dell'interazione kissing 45.

Figura 1
Figura 1 strutture RNA relativi alla forza applicata. a) Un tornante sotto tensione. b) Tirare a due base-coppia baciare complesso. I due anse a gomito sono colorati in rosso e giallo.

Figura 2
Figura 2 impostazione sperimentale. La struttura dell'RNA è fiancheggiato da due maniglie di DNA / RNA. Attraverso le modificazioni chimiche sulle estremità delle maniglie, l'intera molecola può essere collegato ad una coppia di proteine ​​rivestite perline micron dimensioni. Una delle perle è detenuto da una orientabile, trappola ottica-forza di misura. L'altro è posto su una micropipetta, che è guidato da una fase flexture piezoelettrico. Il disegno non è in scala.

Figura 3
Figura 3 Uno schema generale per sintetizzare molecole di RNA con maniglie. La maniglia A, B gestire, e tTemplate ranscription sono generati mediante PCR da un plasmide con la sequenza di RNA clonata. La maniglia A viene modificato da digoxigenins (DIG) alle estremità 3 '. La maniglia B ha una modificazione biotina al 5 'estremità di un filo. La lunghezza totale RNA è trascritto dal modello di trascrizione. Le maniglie RNA e modificati sono misti e ricotta. Le correttamente molecole possono essere collegati a un paio di perle rivestite da streptavidina e anticorpo anti-digossigenina. Il disegno non è in scala.

Figura 4
Figura 4 Immagini di pesca una singola molecola tra due talloni catturate dalla scheda video. Un tallone è posto sulla punta di una micropipetta per aspirazione. L'altro è tenuto e guidato da una trappola ottica forza di misura. Le direzioni dei movimenti trap sono indicati da frecce. Le prime mosse tallone intrappolativerticalmente verso il tallone sul micropipetta. Dopo i contatti, il tallone intrappolato sposta verso l'alto. Se si stabilisce un tether tra le perline, la separazione delle perline tira sulla molecola e forza aumenta come la molecola è estesa. Se due perle non sono collegate da qualsiasi molecola, il movimento di retrazione genera alcuna forza.

Figura 5
Figura 5 Un spettro di potenza del moto browniano di una perlina in trappola. La curva solido è una misura per l'equazione di Lorentz (Eq. 1), mostrata nell'inserto. La costante della molla della trappola può essere calcolata dalla frequenza d'angolo (Eq. 2).

Figura 6
Figura 6 Esempio di prova legge di Stokes '.

Figura 7
Figura 7 Una cella di flusso per tweezing. a) sei fori, ciascuno con un diametro di 2 mm, sono perforati in un vetro di copertura n ° 2 utilizzando un incisore laser. b) Tre 2 fessure largo mm vengono tagliati in nastri in poliammide su due lati. c) Uno sguardo da vicino presso la regione sperimentale contenente la micropipetta e due tubi bypass. Le perle dei canali superiore e inferiore attraversano attraverso i rispettivi tubi bypass (blu e verde) al CENcanale trale nelle direzioni indicate dalle frecce. d) Montare la camera fluidico su un telaio metallico da corrispondenti fori fluidici. e) Una camera a tre canali collegata a fluire tubi. Il canale centrale viene utilizzato per tirare l'RNA. La parte superiore (blu) e inferiore (verde) i canali vengono utilizzati per la consegna di perline. La regione sperimentale è indicato da un quadrato rosso.

Figura 8
Figura 8 Forza rampa. a) curva A forza-estensione del meccanico dispiegarsi di un tornante. Tirando è mostrato in blu e relax in rosso. Il dispiegamento / ripiegamento del tornante sono indicati dalle frecce. B) Distribuzioni di svolgimento (blu) e ripiegamento (rosso) forze del tornante. Il dato è tratto da un manoscritto presentato 39.


Figura 9 Una forcina RNA in forza costante. a) Schema di esperimento. La posizione della trappola viene modificato attraverso il feedback in modo da mantenere una forza costante sul tornante. B) Forza e la posizione in funzione del tempo per tornante UN / pieghevole. Poiché la forza è mantenuta costante, la posizione della trappola oscilla tra due valori, mostrando bistabilità della forcina alla forza. La distribuzione binomiale della distribuzione trappola produce il cambiamento di estensione sul tornante dispiegarsi di 19,4 ± 0,2 nm. Il dato è tratto da un manoscritto presentato 39.

Figura 10
Figura 10 modalità passiva di un tornante. a) B) Forza ed estensione rispetto al tempo di una forcina in modalità passiva.

Figura 11
Figura 11 Forza rampa del due-base-coppia baciare RNA. a) piegatura gerarchica di un due-base-coppia baciare RNA sotto tensione meccanica. b) Curva forza-estensione. Transizioni strutturali sono indicati da frecce. C) Curva forza-estensione quando la forza minima è fissata a 10 pN per impedire l'interazione baciare. Il figura è adattato con il permesso Journal of American Chemical Society 34.

Figura 12
Figura 12 Forza salto dei due-base-coppia baciare RNA. a) ciclo Una forza salto / drop per misurare unkissing e vite a baciare due forze diverse. Il pannello superiore mostra la traccia temporale di forza. Il pannello inferiore mostra la relativa estensione della molecola. La forza viene prima passato da 3 PN a 22 pN per misurare la durata del complesso baciare al 22 pN. Il unkissing è indicata da un rapido aumento in estensione da ~ 30 nm, che indica l'intero RNA viene dispiegato in un unico filo. Il rilassamento, la forza viene decelerato fino a 14 pN per permettere ai due tornanti a ripiegare. La forza è poi sceso a 8 pN. Formazione dell'interazione baciare è indicato dalla riduzione in estensione di circa 7-8 nm b.)Come forza è salito a 16 pN, la traccia temporale estensione dimostra che ci vogliono diversi secondi per il complesso baciare e sette-base-pair tornante a svolgersi, dopo di che il tornante si dispiega e ripiega rapidamente. C) L'intero complesso è baciare dispiegato in un singolo filamento pochi secondi dopo la forza è saltato a 17,7 pN. La traccia rimanente mostra la bistabilità del 11-base-pair tornante. Ognuna delle transizioni strutturali nel dispiegarsi del RNA baciare mostra X. distintivo La figura è adattato con il permesso di Proceedings of National Academy of Sciences 28.

Reagente microlitri
Plasmidi (10 ng / mL) 10
Primer T7F (100 mm) 10
Primer Br (100 mm) 10
mix di dNTP (25 mM ciascuno) 10
10xPCR buffer 100
H 2 O 850
Taq DNA polimerasi 10
Totale 1.000

Nota: Un ciclo termico tipico per la sintesi di 3 kb DNA è: 95 ° C 45 secondi, 53 ° C 1 minuto, 72 ° C 3 minuti.

Tabella 1 Un esempio di PCR per sintetizzare modello trascrizione.

Reagente microlitri
template (> 200 ng / mL) 8
PTR 8 (2 mL ciascuno)
Tampone di reazione 10x 2
T7 RNA polimerasi 2
Totale 20

Nota: Incubare la reazione a 37 ° C overnight.

Tabella 2 Nella trascrizione in vitro.

Reagente microlitri
Maniglia A (~ 10 mg) 50
Biotina-11UTP 5
T4 tampone di reazione pol 5
Soluzione di BSA 1
DNA polimerasi T4 5
Totale 66

Nota: Incubare la reazione a temperatura ambiente per 20 minuti. Inattivare l'enzima mediante riscaldamento a 70 ° C per 20 minuti, seguiti da raffreddamento lento a temperatura ambiente.

Tabella 3 Primer reazione di estensione.

Reagente microlitri
Formammide 800
EDTA (0.5 M, pH 8.0) 2
TUBI (1 M, pH 6.3) 40
NaCl (5M) 80
Totale 922

Tabella 4 Ricetta del buffer di tempra.

Reagente
Biotina-HA 1.000 ng
Dig-HB 1.000 ng
RNA 1.000 ng
Buffer di ricottura 80 mL

Nota: Un ciclo termico tipico per la ricottura è: 95 ° C 10 minuti, 62 ° C 1 ora, 52 ° C 1 ora, seguita da rampa a 4 ° C.

Tabella 5 Anneal RNA con maniglie.

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Discussion

Modifica e risoluzione dei problemi in preparazione di campioni tweezing

Scelta di clonazione vettoriale. Sebbene lo schema generale qui descritto (Figura 3) non richiede una speciale clonazione vettore, il vettore è preferito non avere T7 intrinseca o promotore T3 per la facilità di trascrizione tale che un promotore può essere introdotto tramite PCR in posizioni desiderate.

Sequenza e Lunghezze delle maniglie. Non vi è alcun requisito sequenza specifica per le maniglie. Tuttavia, una stretta GC rapporto AT è preferito, mentre le sequenze omopolimero e altamente ripetute dovrebbero essere evitati. Nelle opere pubblicate, le due maniglie sono tenuti lunghezze analoghe, in modo che la struttura dell'RNA di interesse è posta all'incirca a metà. Lavoro precedente dimostra che la lunghezza totale dei manici variava da 500 a 10.000 coppie di basi influisce sottilmente cinetica misurati 46,47.

ve_content "> Quality Check e quantificazione della miscela ricotto. Oltre l'RNA previsto con maniglie, il prodotto finale contiene anche le maniglie unannealed DNA e RNA, così come gli altri. 'difficile e antieconomico per purificare le molecole tweezing. Invece, il ricotto miscela può essere utilizzato direttamente per tweezing, perché solo gli acidi nucleici correttamente ricotto possono essere legati a due perle di superficie rivestita. prodotto correttamente ricotto è anche difficile da distinguere dalle maniglie e l'RNA su gel di agarosio. Il modo migliore per testare la qualità e per quantificare la concentrazione del prodotto ricotto è quello di testare su le pinzette. Tuttavia, è utile verificare e quantificare la PCR e prodotti di trascrizione in ogni passaggio utilizzando varie tecniche di biologia molecolare.

Approcci alternativi per Tether RNA a perline. Ci sono molti metodi possibili per collegare molecole di RNA a superfici covalentemente o non covalentemente 48

Singola vs Multiple-molecola Tether. Un paio di strep- e scavare-perline può essere collegato da più molecole. Per prendere in giro una tale possibilità di molteplici molecole di legare gli il tallone, le curve forza-distanza devono essere attentamente esaminati. Visualizzazione singola molecola tether una elasticità vermiforme catena 4, che è generalmente invisibile in pastoie multi-molecola. Ulteriori esperimenti di controllo specifici per ciascun sistema può essere richiesto per confermare la cavezza singola molecola.

Miglioramenti delle Minitweezers

Veloce e Lento registrazione dei dati. Il Minitweezers ha un built-in di acquisizione dati che registra fino a 21 parametri strumentali ad una velocità di 200 Hz in un computer, che sarà indicato come il computer operativo in questo lavoro. Tuttavia, alcune applions e calibrazioni richiedono una velocità di acquisizione dati veloce. A tal fine, i segnali elettronici di potenza e la distanza sono divisi da registrare in un nuovo computer, il computer "fast-registrazione", oltre all'acquisizione dei dati nel computer operativo. Il computer veloce registrazione legge i dati attraverso una scheda di acquisizione dati e software separato, che consente a più canali fino a 1 MHz. Il nuovo computer e acquisizione dati non interferisce con il funzionamento dello strumento, che è controllata esclusivamente dal computer operativo. In un esperimento, i dati vengono registrati simultaneamente su entrambi i computer a prezzi diversi. La sincronizzazione dell'ora viene eseguita durante l'analisi dei dati confrontando i file di dati corrispondenti.

Video Registrazione di immagini. Una scheda video e il software di imaging sono installati sul computer veloce registrazione per catturare le immagini in diretta della reazione e di analizzare immagini video. Questo sviluppo rende possibile implementare tegli dimensione dei pixel e calibrazioni distanza sopra descritti.

Limitazioni e future applicazioni del metodo

Metodi di manipolare con precisione e misurare i cambiamenti conformazionali di una singola molecola di RNA sono stati discussi. Tali capacità permettono di monitorare riarrangiamento strutturale di un filamento di RNA in tempo reale. Inoltre, la forza può essere usata per influenzare la struttura dell'RNA e pieghevoli percorsi, permettendo strutture rari e / o meno che ottimale per essere piegati.

Tuttavia, esistono limitazioni dell'approccio meccanico. Soprattutto, l'estensione, che viene utilizzato per interpretare i cambiamenti conformazionali, è una proiezione monodimensionale delle strutture tridimensionali. E 'possibile che alcuni cambiamenti conformazionali non possono essere misurati 49-52, e / o barriere cinetiche sono nascosti dall'osservazione 53. Ci sono anche vari effetti strumentali e le limitazioni che può unffect la termodinamica e la cinetica 44,46,47 osservati.

Le pinzette ottiche sono stati applicati per studiare un numero limitato di strutture di RNA, rispetto a numerose trascrizioni suggerite dalle indagini genome-wide 54. La tecnica sarà utilizzata per studiare diversi motivi strutturali e grandi RNA. Inoltre, il metodo troverà nuove applicazioni nella ricerca dell'RNA. Ad esempio, ligando di RNA-binding proteine ​​e può stabilizzare o modificare la struttura di RNA, che può essere misurato usando l'approccio meccanico.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D

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