Профили микроРНК выражение человеческой плюрипотентных клеток, пигментного эпителия сетчатки, полученных из IPS, и плода пигментного эпителия сетчатки

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

МикроРНК (микроРНК) профили антропогенного-плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток, пигментный эпителий сетчатки (ПЭС), полученные из стебля антропогенного-плюрипотентные (IPS) клеток (IPS-ПЭС), и плода ПЭС, были сопоставлены.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Greene, W. A., Muñiz, A., Plamper, M. L., Kaini, R. R., Wang, H. C. MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (88), e51589, doi:10.3791/51589 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Цель данного доклада является описание протоколов для сравнения микроРНК (микроРНК) профили из стебля антропогенного-плюрипотентные (IPS) клеток, пигментный эпителий сетчатки (ПЭС), полученных от человека плюрипотентных клеток (IPS-РПЭ) и плода РПЭ. Протоколы включают коллекцию РНК для анализа методом микрочипов, а также анализ данных микрочипов для выявления микроРНК, которые разному экспрессируются среди трех типов клеток. Методы культуры плюрипотентных клеток и плода ПЭС объясняются. Протокол, используемый для дифференциации ПЭС от человека IPS также описывается. Методика экстракции РНК мы описываем была выбрана, чтобы позволить максимальное восстановление очень малых РНК для использования в микрочипов микроРНК. Наконец, сотовой пути и сеть анализ микрочипов данных объясняется. Эти методы будут способствовать сравнение профилей микроРНК трех различных типов клеток.

Introduction

Стволовые клетки обладают способностью к репликации без ограничения и потенциал дифференцироваться в любой соматической типа клеток. Развитие методов перепрограммировать соматические клетки в плюрипотентные стволовые клетки уже вызвали большой ажиотаж в научно-исследовательского сообщества и среди врачей, так как появление персонализированной регенерации тканей на горизонте 1. Индуцированные-плюрипотентные стволовые (IPS) клетки обладают теми же функциями неограниченного репликативного потенциала и плюрипотентности, как эмбриональных стволовых (ES) клетки ограниченной этическими дилеммами, связанные с ЭСК. Кроме того, пациент стволовые клетки не будут стимулировать иммунный ответ, что значительно увеличивает вероятность успешных терапевтических применений 2-3. При определенных условиях культивирования, плюрипотентных клеток, как было показано дифференцироваться в нескольких различных типов клеток в пробирке, в том числе кардиомиоцитов, нейронов, панкреатических бета-клеток, гепатоцитов и пигментного эпителия сетчатки (RPЕ) 4-12.

RPE является специализированным слой пигментных эпителиальных клеток, расположенных в задней части сетчатки, которая выполняет несколько функций, которые необходимы для здоровья глаз и функции, такие как поглощение рассеянного света, фагоцитоз из наружных сегментов фоторецепторов, и обработка ретиноидов для производства визуального хромофора. Дисфункция ПЭС из-за повреждения или болезни глубоко влияет на здоровье фоторецепторов и зрительные функции, о чем свидетельствует, слепящих глаза болезней, которые являются результатом основного НПП патологии, такие как возрастной макулярной дегенерации (ВМД), болезни Штаргардта, и пигментный ретинит (RP) 13. Действительно эффективные методы лечения, которые могут восстановить зрение, не были достигнуты, и замена больного ПЭС со здоровой РПЭ может быть лучшим вариантом, чтобы предотвратить потерю зрения 14-15. НПП происходит от IPS (IPS-РПЭ) является возможным источником клеток для замены поврежденного НПП. IPS-НПП выражает характик белки ПЭС LRAT, CRALBP, PEDF и RPE65; отображает классический высоко пигментированные гексагональную НПП морфологию; и выполняет RPE функции, такие как фагоцитоз, ретиноидов обработки и секреции 11 - цис-ретиналь 5,16. Однако, прежде чем IPS-НПП может использоваться в терапевтических целях, IPS-НПП должны быть тщательно описаны. Понимание факторов, которые регулируют НПП дифференциацию необходимо улучшить выход и чистоту клеток, который будет использоваться для клинических применений.

Дифференциация Cell является результатом высокой регулируемой экспрессии генов. Эпигенетическая реконструкция генома и координации транскрипционных факторов, необходимых для клеточных судеб решений, которые происходят во время дифференцировки и развития 17. Регулирование сообщения РНК (мРНК) перевод на микроРНК (микроРНК) представляет еще один уровень регулирования, который влияет клеток судьбу 1. MiRNAs короткие, ~ 22 нт, длины нуклеотидов, которые либо подавляют переводсвязывание с 3 'UTR мРНК или целевой мРНК деградации. MiRNAs были обнаружены практически во всех тканях и на сегодняшний день более 2000 уникальных человека микроРНК были зарегистрированы в базе данных miRBase. С микроРНК требуют только частичное взаимодополняемости для привязки к мРНК-мишени, одна микроРНК может потенциально связываются с десятков или сотен целей, и наоборот, т.е. один мРНК могут быть направлены на несколько различных микроРНК. Это беспорядочный связывания характерно резко повышает уровень сложности регулирования, а также уровень сложности определения функций отдельных микроРНК и роль каждый из них играет в клеточных функций 18-21. Тем не менее, исследования показали, что микроРНК уточняет экспрессию генов в процессе дифференцировки, влияя статус метилирования ДНК 17. В исследовании, более конкретной, чтобы ПЭС, miR-204/211 было показано, чтобы способствовать эпителиальный фенотип ПЭС 22. Другая группа проанализировала профиля микроРНКНПП во время дифференцировки из ЭС клеток и показали различные наборы микроРНК экспрессируются в процессе дифференцировки 23. На самом деле, профили микроРНК можно однозначно отличить типы клеток, в том числе ЭС клеток, клеток-предшественников, и терминально дифференцированных клеток 24,25. Более 250 микроРНК экспрессируются в сетчатке. На основе этих исследований, мы предполагаем, что микроРНК играют важную роль в дифференциации ПЭС от IPS.

Цель данного доклада является описание протоколов для дифференциации ПЭС от IMR90-4 IPS клетки, коллекция РНК для анализа микрочипов, а также анализ данных микрочипов для выявления микроРНК, которые разному экспрессируются среди трех типов клеток, иПСК , IPS-НПП и плода НПП. Суммарную РНК экстрагировали из культур каждого типа клеток и гибридизовали с микрочипов микроРНК, содержащий зонды, специфичные для человека микроРНК 1205 и 144 вирусных микроРНК. Результаты микрочипов были сравнитьD, чтобы определить, которые были дифференциально экспрессируются микроРНК среди различных типов клеток. были выбраны микроРНК с 2 раза или более кратное изменение в выражении для дальнейшего анализа. Программа, анализ микроРНК был использован для выявления потенциальных целей в дифференциально выраженных микроРНК и генерировать сотовых сетей регулируются выбранных микроРНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка культуры Реагенты и культуры Плиты

  1. mTeSR1 СМИ: Подготовка mTeSR1 СМИ в соответствии с инструкциями изготовителя. Оттепель 100 мл mTeSR1 5x дополнения в течение ночи при 4 ° С. Добавьте 100 мл mTeSR1 5x дополнение к 400 мл mTeSR1 базальных СМИ и хорошо перемешать. Этот носитель является стабильным при 4 ° С в течение до 2 недель и при -20 ° С в течение 6 месяцев.
  2. Среде для дифференцировки: Подготовка среде для дифференцировки в DMEM/F12 с получением 0,1 мм β-меркаптоэтанол, 0,1 мМ заменимые аминокислоты, 2,0 мМ L-глутамина, 10% нокаутом сыворотки и 10 мкг / мл гентамицина.
  3. IPS-RPE медиа: Подготовка IPS-НПП носители в MEM с получением 1x N1 дополнение, 0,1 мМ заменимые аминокислоты, 250 мкг / мл таурин, 13 нг / мл трииодо-L-тиронина соль натрия, 20 нг / мл гидрокортизона, 5 мкг / мл гентамицина и 15% FBS 26.
  4. Трийод-L-тиронина натриевая соль раствор. Для подготовки исходного раствора растворить 1,0 мг Трийод-L-тиронинанатриевая соль в 1 N гидроксида натрия, осторожно вращая. Затем добавьте 49,0 мл основани массовой информации, чтобы сделать 50,0 мл 20 мкг / мл трииодо-L-тиронина натриевой соли. Подготовка аликвоты и замораживают при -20 ° С до использования. Используйте соответствующий объем для достижения требуемой концентрации в окончательном питательных сред.
  5. Гидрокортизон раствор: Для подготовки гидрокортизон маточного раствора, растворить 1 мг гидрокортизона в 1 мл абсолютного этанола на легком помешивании. Затем добавьте 19,0 мл базовых сред в течение 20 мл гидрокортизона исходного раствора 50 мкг / мл. Аликвоту и замораживание при -20 ° С до использования. С помощью соответствующего объема для достижения желаемой концентрации в конечной культуральной среде.
  6. Плод НПП ростовую среду. Подготовьте СМИ роста путем смешивания всех реагентов в комплекте RTEGM в базисной информации, в соответствии с указаниями производителя для FBS кроме.
  7. Плод НПП покрытие СМИ. Подготовка обшивки носитель путем передачи небольшого количества питательной среды в стерильный контейнер и адд FBS до конечной концентрации 2%.
  8. Диспаза: Подготовка рабочего раствора диспаза из 1 мг / мл в DMEM/F12.
  9. Matrigel покрытием пластин: Подготовка Матригель в DMEM/F12 до 0,08 мг / мл.
  10. Coat каждую лунку 6-луночного планшета с 1,0 мл раствора матригеля.
  11. Инкубируйте пластин, покрытых при комнатной температуре в течение 1,0 часов.
  12. После 1,0 часов инкубирования аспирации избыточного DMEM/F12.
  13. Добавить 0,5 мл mTeSR1 СМИ, чтобы избежать высыхания. В Matrigel покрытием пластины готов к использованию.

2. Плюрипотентных Культура

  1. До иПК посева клеток есть все трубы, теплый mTESR1 СМИ до комнатной температуры, и Матригель покрытием пластин готовые.
  2. Быстро промойте плюрипотентных клеток IMR90-4 в водяной бане при 37 °. Затем снимите криопробирку из водяной бани и стерилизовать с помощью 70% этанола.
  3. Передача клеток в 15 мл коническую пробирку с использованием 2 мл пипетки чтобы свести к минимуму нарушение клеточных агрегатов.
  4. По каплям добавить 5 мл вагт mTeSR1 СМИ в клетках и осторожно перемешать. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и удалить супернатант.
  5. Тщательно ресуспендирования клеточных агрегатов в 2 мл mTeSR1 сред и семян клеток на одну лунку пластины шесть.
  6. Место пластины в 37 ° С инкубатор и культуры с 5% CO 2, 95% влажности.
  7. Измените культуры клеток IPS ежедневно. Недифференцированные колонии появится через 5-7 дней после посева. Проверьте недифференцированных колоний, которые готовы для прохода (колоний с плотной центра).

3. Пассажи плюрипотентных клеток

  1. До начала и до прохождения клетки IPS, которые все трубы, диспаза решение, DMEM/F12 и mTERS1 СМИ нагревали до комнатной температуры, а матригель покрытием пластин готов.
  2. Перед пассажей плюрипотентных клеток, удалите все области дифференциации путем соскоба область и аспирационных СМИ. Дифференциация должна оставаться ниже 20% от ямы для высокойкачество культур. Тщательно промойте клеток, содержащих хорошо с 2 мл DMEM/F12 IPS и добавить 1 мл 1 мг / мл диспаза в каждую лунку.
  3. Инкубировать при 37 ° С в течение 7 мин. Аспирируйте диспазу и осторожно промыть клеточные колонии с 2 мл DMEM/F12 дважды.
  4. После промывки, добавить 2 мл mTSER1 в каждую лунку.
  5. Использование 5 мл пипетку осторожно очистить колонии пластины с образованием агрегатов.
  6. Перенесите отдельные колонии в 15 мл коническую трубку. Добавить достаточные средства массовой информации mTeSR1 сеять на следующий прохождение клеток.

4. Дифференциация плюрипотентных клеток к IPS-РПЭ

  1. Пластина клетки плюрипотентных на тарелку недавно покрытием в mTESR1 СМИ.
  2. Разрешить колонии плюрипотентных клеток расширить в течение 4-5 дней в культуре.
  3. Вышедший на замену mTeSR1 носители с дифференцировки 4 мл СМИ. Изменение половину СМИ каждые 3 дня.
  4. Разрешить пигментные очаги расти достаточно большой, чтобы быть вручную вырезали культуры (40-50 дней).
  5. Используйте200 мкл пипетки обвести и поднимите пигментированные колонии.
  6. Сбор и объединить расчлененные колонии в 15 мл коническую трубку.
  7. Затем добавить 5 мл DMEM/F12 для объединенных клетках ПЭС и центрифуги при 300 мкг в течение 5 мин в два раза.
  8. Подготовка одно решение клеток путем инкубации вариант объединенного IPS-RPE с 0,25% трипсина ЭДТА.
  9. Промойте клетки IPS-РПЭ с IPS-РПЭ СМИ и пластины собранные клетки на свежий матригель покрытием хорошо в 4 мл IPS-РПЭ СМИ.
  10. Культуры клеток в течение 3 недель до прохода. Изменение СМИ каждые 3 дня. Для эксперимента, пластинчатые IPS-НПП на 100000 клеток / см 2. Сбор клеток на 17 день. Подсчитайте день посева как день 0.

5. Отбор проб

  1. плюрипотентных Коллекция Сотовый
    1. Культура клетки плюрипотентных до недифференцированные колонии не наблюдаются плотным в центре.
    2. Промыть колонии в DMEM/F12.
    3. Распадаются на отдельные клетки, используя accutas э. Сбор клеток в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют в 2 мл DMEM/F12.
  2. Плод НПП Коллекция
    1. Промыть клеточных культур плода РПЭ с DMEM/F12 и распадаются на отдельные клетки, используя 0,25% трипсин ЭДТА.
    2. Соберите клеток в 15 мл коническую трубку. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют в 2 мл DMEM/F12.
  3. IPS-НПП Коллекция Сотовый
    1. Когда IPS-НПП достичь проход 3 и канал 5, сбора клеток на 17 день после прохождения. Промыть IPS-RPE дважды в PBS и готовить суспензии отдельных клеток путем инкубации с 1,0 мл 0,25% трипсина.
    2. Нейтрализовать трипсин с 2 мл охлажденного льдом IPS-РПЭ СМИ.
    3. Сбор клеток в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант.
    4. Ресуспендируют клеточной суспензии в 3 мл окрашивающего буфера с микрогранулами комплекта.
ve_title "> 6. Отрицательный Выбор IPS-РПЭ удалить недифференцированных клеток

  1. Хранить все реагенты при температуре 4 ° С до использования, но не работают на льду. Центрифуга клеточной суспензии с шага 5.3.4 при 300 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант.
  2. Ресуспендируют клеток в 100 мкл окрашивания буфера из микрогранулами комплект на 2 х 10 6 клеток.
  3. Добавить 10 мкл Анти-TRA-1-60-PE антитела на 2 х 10 6 клеток.
  4. Хорошо перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 10 мин.
  5. Вымойте клеток в 1-2 мл буфера в 2 х 10 6 клеток. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г. Аспирируйте супернатант.
  6. Ресуспендируют клеток в 80 мкл окрашивания буфера в 2 х 10 6 клеток. Добавить 20 мкл анти-PE меченых микросфер (от комплекта) за 2 х 10 6 клеток. Все хорошо перемешать. Инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С.
  7. Добавить 1-2 мл окрашивания буфера на 2 х 10 6 клеток. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г. Аспирируйте супернатант.
  8. Ресуспендируют клеток в 500 & #956; л окрашивания буфера.
  9. Магнитная сепарация клеток:
    1. Столбец Место в магнитном сортировщика клеток. Столбец Промыть 3 мл окрашивания буфера.
    2. Применить клеточной суспензии с 6,8 на колонку.
    3. Поместите трубку на отрицательном порт для сбора TRA-1-60 негативных клеток.

7. Всего Экстракция РНК

  1. Лизиса клеток путем запуска образцов через промышленную колонку микроцентрифужных гомогенизатор мини спина, предназначенного для минипрепараты нуклеиновых кислот.
  2. Извлечение общей РНК из плюрипотентных клеток, IPS-РПЭ и плода РПЭ с коммерчески доступной набора для экстракции РНК предназначена для сохранения малых молекул РНК 27.
  3. Определите общую концентрацию РНК с использованием NanoDrop спектрофотометр.

8. Bioanalyzer и микрочипов анализа

  1. Проверьте целостность РНК с Bioanalyzer в сочетании с коммерчески доступного набора качества РНК.
  2. Выдержите 100 нгтотальную РНК с кишечной фосфатазы теленка при 37 ° С в течение 30 мин
  3. Денатурации РНК с использованием 100% ДМСО при 100 ° С в течение 5 мин.
  4. Этикетка образцы с PCP-Cy3 использованием Т4-лигазы инкубируют при 16 ° С в течение 1 часа.
  5. Гибридизации на формате 8_x_15K массива человеческого микроРНК.
  6. Вымойте массивов в соответствии с инструкциями изготовителя и сканировать с разрешением 5 мкм, с использованием сканера.
  7. Приобретать данные с помощью функции микрочипов извлечения программы, совместимые с микрочипом микроРНК.
  8. Обрабатывать сигналы микроРНК для определения относительного уровня экспрессии в каждом образце.
  9. Сравните уровни экспрессии каждого микроРНК между образцом групп. Выбор микроРНК, по крайней мере два раза дифференциальной экспрессии для дальнейшего анализа.
  10. Использование коммерческое программное обеспечение для анализа данных, следуйте инструкциям для получения тепловой карты для визуализации разному экспрессируются микроРНК 28.

9. Путь Анализ

  1. Сохранить данные из микроРНК, выбранных в 8,9 в формате Excel.
  2. Войти в программу РНК тропа анализа онлайн. Загрузите файл Excel. Выберите "гибкий формат" для формата файла и выберите "Agilent" выпадающего списка для типа идентификатора с.
  3. Под сырой заголовком данных, назначить "ID", чтобы исследовать ID колонку и назначить "Наблюдение 1" и "соотношение войти" в колонку журнала рациона. Выберите "игнорировать" для всех остальных столбцов.
  4. Выберите параметры для анализа следующим образом: Доверие: экспериментально наблюдалось только; включают прямые и косвенные отношения; и включают эндогенные химические вещества; Выберите базы знаний изобретательности в качестве опорного набора. Выберите базу данных эталонных молекул, которая включает данные от всех видов, все клеточные линии и ткани, и все мутации.
  5. Выполнить сети и пути анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

плюрипотентных клеток (фиг.1А) выращивали в условиях дифференцировки для индукции дифференцировки в IPS-RPE клеток. IPS-НПП выставлены классические НПП фенотип гексагональной пигментного морфологии клеток (рис. 1В) похож на плода ПЭС (рис. 1в).

Чтобы лучше понять ту роль, которую микроРНК могут играть в процессе дифференциации из IPS для IPS-РПЭ, был проведен микрочипов анализ экспрессии микроРНК. Общую РНК была получена из плюрипотентных клеток, плода РПЭ и IPS-РПЭ с использованием набора изоляции Mirvana микроРНК для обеспечения максимального сохранения малых РНК. РНК подвергали количественному анализу и проверены на чистоту перед гибридизацией к микрочипов LabChip. Зонды, представляющие 1205 человека и 144 вирусных микроРНК были использованы для анализа экспрессии микроРНК из каждого набора образца. Сигналы были проанализированы для определения относительных уровней экспрессии микроРНК каждого из каждого образца. Данные были использованы для сравнения микроРНК е Xpression профиль IPS-РПЭ в IPS и плода РПЭ. Тепловые карты были получены для того, чтобы визуализировать дифференциального выражения микроРНК между группами (рис. 2а). 83 микроРНК, которые были дифференциально выраженные в IPS по сравнению с IPS-РПЭ, с 47 микроРНК активируется в IPS по сравнению с IPS-РПЭ и 36 подавляется в IPS (рис. 2б). 110 микроРНК были дифференциально экспрессируются в эмбриональной ПЭС по сравнению с IPS-РПЭ, с 61 микроРНК активируется в fRPE, и 49 подавляется в fRPE сравнению с IPS-РПЭ (рис. 2С). Путь анализ с программным обеспечением Изобретательность МПА показал разному экспрессируются микроРНК целевых стенограммы для генов, вовлеченных в сотовой развития, роста, пролиферации и выживания, клеточного цикла, и клеточного движения. MiRNAs выражается в тканях глаза в естественных условиях было обнаружено, что обогащенный IPS-ПЭС и плода ПЭС по сравнению с IPS (рис. 3 и 4).

т "FO: держать-together.within-страницу =" всегда "> Рисунок 1
Рисунок 1. Светлопольные образы IPS, плода РПЭ и IPS-РПЭ. Светлопольные изображения (100X) из плюрипотентных клеток до дифференциации, плода ПЭС и ПЭС, полученных от IPS. Оба плода НПП и IPS-НПП показать классическую НПП морфологию гексагональной формы и пигментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Профиль экспрессии микроРНК от IPS-РПЭ по сравнению с IPS и плода РПЭ. A) Тепловые карты изображают относительную степень дифференциальной экспрессии микроРНК. Цветшкала представляет уровни экспрессии микроРНК, как указано выше (красный), ниже (зеленый), или на средний уровень экспрессии (черный) во всех образцах. B) Сравнение микроРНК профилей IPS-РПЭ в плюрипотентных клеток. C) Сравнение микроРНК профили IPS-РПЭ до плода РПЭ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3.) Сеть анализ профилей экспрессии микроРНК родительских клеток плюрипотентных сравнению с IPS-производного РПЭ. Верхние 4 сети, приведены отдельно (слева) и объединены (в центре). B) Pathway анализ разному экспрессируются микроРНК. Плехановаазы нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4.) Сеть анализ профилей экспрессии микроРНК плода ПЭС по сравнению с IPS-производного РПЭ. Топ-7 сети показаны отдельно (слева) и объединены (центр). Б) Pathway анализ разному экспрессируются микроРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В заключение, этот доклад описывает методы, используемые для культивирования плюрипотентных клеток, IPS-РПЭ и плода НПП. НПП происходит от IPS морфологически и функционально похож на плода РПЭ. IPS-НПП также выражает характерные гены РПЭ включая RPE65, CRALBP, PEDF и ТАПБР 16. Для дальнейшего характеризуют эти клетки, РНК экстрагировали и используется для выполнения анализа микрочипов для идентификации дифференциально выраженную микроРНК. Анализ интенсивности сигналов показал, что наибольшее число разному экспрессируются микроРНК был обнаружен в плодового ПЭС против сравнений IPS-РПЭ, предполагая, IPS-НПП может быть более зрелым. Будущие исследования планируется проверить эти результаты с RT-PCR.

Есть несколько критических точек во время этого эксперимента, которые должны быть тщательно выполнены, чтобы обеспечить успех анализа и приобретение точных данных. Первый ключевой шаг происходит во время культивирования клеток IPS. иПСК должны оставаться в PLUripotent состояние для поддержания их стволовости. Клетки должны быть тщательно проверены ежедневно на признаки дифференциации. Недифференцированные клетки плюрипотентных расти как компактные многоклеточных колоний. Клетки должны иметь высокую ядерного соотношение цитоплазмы и выраженными ядрышками. Колонии плюрипотентных характеризуются отчетливой границы, с несколькими слоями клеток в центре. Признаки дифференциации включают потерю определенных колонии границ, неравномерной морфологии клеток и появления очевидных типов клеток, таких как нейроны и фибробласты. Отдельные клетки, которые дифференцировались могут быть удалены диспазы и полоскания, однако, колонии с этими характеристиками должны быть вручную удалены из культуры 29.

Подготовка РНК для анализа микрочипов является следующим важным шагом. Непоследовательность качество РНК представляет собой значительный источник изменчивости в данных микрочипов. Выделение РНК должны дать высокую молекулярную массу и минимально деградированных РНК для достижения наилучших результатов. УспешныйВыделение РНК даст полную РНК с минимальными искажениями и без каких-либо загрязняющих РНКаз. После определения концентрации РНК спектрофотометрически при 260 нм, чистота образца должна быть определена в 230 и 280 нм для обнаружения загрязнения с полисахаридами или белка. Отношение 230:260:280 РНК должна быть 1:02:01 указать высокого качества РНК, не загрязнения 30.

При планировании эксперимента микрочипов, наиболее важным шагом является включение отрицательных контролей, чтобы обеспечить гибридизацию с зондами специфично, а также запускать каждый образец в трех экземплярах чтобы гарантировать, что сигналы, обнаруженные действительны для этого набора образцов. В ходе анализа результатов микрочипов, ключевым моментом является коррекция фона, в котором фоновый шум вычитается из наблюдаемого сигнала, чтобы дать истинную интенсивность сигнала для каждого конкретного зонда. Этот шаг позволит устранить ложные срабатывания, подчеркивая истинные положительные сигналы. </ Р>

Наконец, во время сети и пути анализа результатов микрочипов, самый важный шаг заключается в создании правильных параметров и фильтров до запуска анализ. Этот шаг будет определять, какие базы данных будут использоваться программным обеспечением для создания сетей и выявления клеточных путей, влияют микроРНК показано, что дифференциально экспрессируются в сопоставлениях.

После получения данных с использованием методов, описанных в настоящем докладе, необходимо учитывать ограничения этих анализов во время интерпретации результатов. Хотя вряд ли, остается возможность, что НПП культура не однородная популяция клетках ПЭС. Процесс сортировки анти-TRA-1-60 является отрицательным процесс отбора, который удаляет клетки, которые еще выразить маркеров стволовых клеток; Однако это не гарантирует оставшиеся клетки чистые клетки ПЭС. Хотя морфологически клетки проявляют классический НПП морфологию пигментации ай многоугольной формы клеток, вполне возможно, что не все клетки RPE.

Микрочиповых экспериментов может привести к ложных срабатываний для экспрессии РНК, особенно в случае микроРНК из-за очень коротких последовательностей. Хотя система микрочипов используются для этого эксперимента включены несколько зондов для целевых различные регионы каждой цели, результаты всегда должны быть подтверждено Qrt-PCR.

Анализ микрочипов данных изобретательностью IPA зависит от количества и качества информации в базе данных изобретательность. Большая часть информации о функции гена и клеточных путей происходит от экспериментов, проведенных на трансформированных клеточных линий или в контексте исследований рака. Таким образом, результаты пути и анализа сети, использующие эту программу не всегда может быть актуально для первичных клеток или, в данном случае, стволовые клетки.

Несмотря на эти ограничения, способы, описанные в этом отчете могут быть использованы длякультура плюрипотентных клеток и плода РПЭ, вытекающих РПЭ из плюрипотентных клеток, и извлечения РНК для микрочипов анализа микроРНК. Данные, полученные с помощью этих анализов могут быть использованы для идентификации микроРНК, участвующие в процессе дифференцировки, а также те, которые регулируют функции RPE.

Хотя все больше микроРНК были найдены, что дифференциально экспрессируются в эмбриональной ПЭС против сравнению IPS-НПП, чем в IPS против сравнению IPS-НПП, существует множество возможных причин для этого. Прежде всего, в то время этот анализ был выполнен, микрочипов микроРНК платформа была способна обнаруживать 1205 человека и 144 вирусных микроРНК. С этого времени платформа была расширена за счет включения зонды для более чем 2000 человека микроРНК. Это, конечно, возможно, что микроРНК дифференциальные профили экспрессии изменится, если больше микроРНК обнаружены. Из 1349 микроРНК, обнаруженных этом анализе, большинство из микроРНК не выявило различий в выражении между типами клеток (рис. 2В и

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мнения или утверждения, содержащиеся здесь, являются частные взгляды авторов и не должны быть истолкованы в качестве официальной или в качестве точки зрения Департамента армии или министерства обороны.

Это исследование было проведено в то время как авторы Уитни А. Грин, Альберто Мунис, и Рамеш Р. Kaini провел Национальный исследовательский совет докторской научный Associateship на USAISR.

Microarray анализы проводили по Greehey Детской научно-исследовательский институт рака микрочипов основной комплекс и биоинформатика Департамента в UT Health Science Center Сан-Антонио.

Эта работа была поддержана армии США программы Клиническая восстановительная медицина исследований (CRMRP) и военной программе Оперативный медицины Научно-исследовательский (MOMRP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5X supplement Stem Cell Technologies 5850
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-β-mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Fetal RPE media RTEGM kit Life Technologies 195406
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Trypsin Hyclone(Fisher) 25200-072
Miltenyi Biotec washing buffer StemGent 130-092-987
Miltenyi Biotec rinsing buffer StemGent 130-092-222
Anti-TRA-1-60 microbead kit StemGent 130-095-816
Miltenyi Biotec cell sorter column StemGent 130-021-101
RNeasy micro kit Qiagen 74004
QIA shredder Qiagen 79654
RNA 6000 Pico LabChip kit Agilent G2938-90046
Human miRNA microarray v16 Agilent G4471A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
  2. Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
  3. Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
  4. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
  5. Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
  6. Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
  7. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  8. Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
  9. Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
  10. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
  11. Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  12. Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
  13. la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
  15. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
  16. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
  17. Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
  18. Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
  19. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
  20. Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
  21. Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
  22. Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
  23. Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
  24. Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
  25. Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
  26. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
  27. Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. (2013).
  28. Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. (2011).
  29. Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. (2010).
  30. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics