Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium

Biology

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Summary

O microRNA (miRNA) perfis de tronco humanas pluripotentes induzidas por células (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS) (IPS-RPE) e RPE fetal, foram comparados.

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Greene, W. A., Muñiz, A., Plamper, M. L., Kaini, R. R., Wang, H. C. MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (88), e51589, doi:10.3791/51589 (2014).

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Abstract

O objetivo deste relato é descrever os protocolos para comparar o microRNA (miRNA) perfis de humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células iPS humanas (iPS-RPE) e RPE fetal. Os protocolos incluem a recolha de RNA para análise de microarray, e a análise de dados de microarrays para identificar miRNAs que são diferencialmente expressos entre os três tipos de células. Os métodos para cultura de células iPS e RPE fetal são explicados. O protocolo utilizado para a diferenciação de RPE de iPS humana também é descrito. A técnica de extracção de RNA descrevemos foi seleccionado para permitir a recuperação máxima de ARN muito pequena para ser utilizado em um microarray miARN. Finalmente, via celular e análise de redes de dados microarray é explicado. Estas técnicas vão facilitar a comparação dos perfis de miRNA de três tipos de células diferentes.

Introduction

As células estaminais têm a capacidade de se replicar sem limite e o potencial para se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. O desenvolvimento de técnicas para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes suscitou grande entusiasmo na comunidade científica e entre os médicos, como o advento da regeneração do tecido personalizado está no horizonte 1. Induzido por células-tronco pluripotentes (iPS) apresentam as mesmas características do potencial replicativo ilimitado e pluripotência como células-tronco embrionárias (ES), contornando os dilemas éticos associados à CES. Além disso, as células estaminais derivadas de pacientes não irão estimular uma resposta imune, aumentando grandemente a probabilidade de sucesso de 2-3 aplicações terapêuticas. Sob condições específicas de cultura, as células iPS foram mostrados para se diferenciar em vários tipos de células diferentes in vitro, incluindo os cardiomiócitos, neurónios, células beta pancreáticas, hepatócitos, e epitélio pigmentado da retina (RPE) 4-12.

A EP é uma camada de células epiteliais especializadas pigmentadas localizadas na parte posterior da retina, que desempenha várias funções que são essenciais para a saúde visual e função, tais como a absorção de luz dispersa, a fagocitose dos segmentos externos de fotorreceptores, e processamento de retinóides para a produção de cromóforo visual. Disfunção do EPR devido a lesão ou doença afeta profundamente fotorreceptor saúde e função visual como evidenciado pelas doenças que causam cegueira que são o resultado de patologia RPE subjacente, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), doença de Stargardt, e retinite pigmentosa (RP) 13. Tratamentos realmente eficazes que possam restaurar a visão não foram alcançados, e substituição de RPE doente com RPE saudável pode ser a melhor opção para evitar a perda de visão 14-15. RPE derivado iPS (IPS-RPE) é uma possível fonte de células para substituir o RPE danificadas. iPS-RPE expressa caracteproteínas RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF e RPE65; exibe a morfologia RPE hexagonal altamente pigmentada clássica; e executa funções tais como RPE fagocitose, processamento de retinóide, e secreção de 11 - 5,16 retina cis. No entanto, antes iPS-RPE pode ser usada terapeuticamente, o IPS-RPE deve ser completamente caracterizada. Compreender os factores que regulam a diferenciação EPR é necessário para melhorar o rendimento e a pureza das células a serem utilizadas para aplicações clínicas.

Diferenciação de células é o resultado da expressão de genes altamente regulada. Remodelação epigenética do genoma e da coordenação dos fatores de transcrição são necessários para as decisões do destino da célula que ocorrem durante a diferenciação e desenvolvimento 17. Regulamento de mensagem de RNA (mRNA) Tradução por microRNA (miRNA) apresenta ainda um outro nível de regulação que afeta o destino da pilha 1. MiRNAs são curtos, ~ 22 nt, comprimentos de nucleotídeos que seja tradução suprimir porligação à extremidade 3 'UTR do ARNm ou o ARNm alvo para degradação. MiRNAs foram detectados em praticamente todos os tecidos e até o momento mais de 2.000 microRNAs humanos únicos foram registrados no banco de dados miRBase. Desde miRNAs exigem complementaridade parcial de se ligar ao mRNA-alvo, num único miARN pode potencialmente se ligam a dezenas ou centenas de alvos, e vice-versa, isto é, um único mRNA pode ser alvo de várias miRNAs diferentes. Esta característica de ligação promíscua aumenta dramaticamente o nível de complexidade da regulamentação, bem como o nível de dificuldade de determinar as funções dos miRNAs individuais e do papel que cada um desempenha nas funções celulares 18-21. No entanto, estudos têm mostrado que miRNA refina expressão gênica durante a diferenciação por afetar o estado de metilação de DNA 17. Num estudo mais específico para o EPR, miR-204/211 foi mostrado para promover o fenótipo epitelial do RPE 22. Outro grupo analisado o perfil miRNAde RPE durante a diferenciação de células-tronco embrionárias e revelou conjuntos distintos de miRNA são expressos durante o processo de diferenciação 23. De facto, os perfis de miRNA pode distinguir inequivocamente os tipos de células, incluindo células embrionárias, células precursoras, e células terminalmente diferenciadas 24,25. Mais de 250 miRNAs são expressos na retina. Com base nesses estudos, a hipótese de que os miRNAs desempenham um papel importante durante a diferenciação de RPE de iPS.

O objetivo deste relato é descrever os protocolos para a diferenciação de RPE de IMR90-4 células iPS, coleção de RNA para análise por microarray, e da análise de dados de microarrays para identificar os miRNAs que são diferencialmente expressos entre os três tipos de células, as células iPS , iPS-RPE e RPE fetal. O RNA total foi extraído a partir de culturas de cada tipo de célula e hibridado com uma micromatriz miARN, contendo sondas específicas para 1205 miRNAs humanos e 144 miRNAs virais. Os resultados de microarray foram comparard para determinar quais miRNAs foram diferencialmente expressos entre os diferentes tipos de células. miRNAs com 2 vezes ou mais alterações vezes na expressão foram seleccionadas para posterior análise. Um programa de software de análise de miARN foi usada para identificar potenciais alvos dos miRNAs expressos diferencialmente e para gerar redes celulares regulados por miRNAs seleccionados.

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Protocol

1. Preparação de Culturas Reagentes e placas de cultura

  1. mídia mTeSR1: Preparar mídia mTeSR1 acordo com as instruções do fabricante. Descongelar 100 ml de suplemento mTeSR1 5x durante a noite a 4 ° C. Adicione os 100 ml de suplemento mTeSR1 5x para 400 ml de mTeSR1 mídia basais e misture bem. Este meio é estável a 4 ° C durante até 2 semanas e à temperatura de -20 ° C durante 6 meses.
  2. Meios de diferenciação: Preparar meios de diferenciação em DMEM/F12 para produzir 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2,0 mM de L-glutamina, 10% de soro de knockout, e 10 ug / ml de gentamicina.
  3. mídia iPS-EPR: Preparar mídia iPS-RPE em MEM, para se obter N1 1x suplemento, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 250 ug / ml de taurina, 13 ng / ml de sal de sódio tri-iodo-L-tironina, 20 ng / ml de hidrocortisona, de 5 ug / ml de gentamicina, e 15% de FBS 26.
  4. Solução estoque de sal de sódio tri-iodo-L-tironina. Para preparar a solução-mãe de dissolver 1,0 mg de tri-iodo-L-tironinasal de sódio em 1 N de hidróxido de sódio rodando suavemente. Em seguida adicione 49,0 ml de meios de base para fazer 50,0 ml de 20 ug / ml de sal de sódio tri-iodo-L-tironina. Preparar alíquotas e congelar a -20 ° C até ser necessário. Use volume adequado para atingir a concentração desejada em meio de cultura final.
  5. Solução-mãe de hidrocortisona: Para preparar uma solução de estoque de hidrocortisona, solubilizar 1 mg de hidrocortisona em 1 ml de etanol absoluto com agitação suave. Em seguida adicione 19,0 ml de meios de base para 20 ml de solução de estoque de hidrocortisona de 50 ug / ml. aliquota e congelamento a -20 ° C até ser necessário. Use volume apropriado para atingir a concentração desejada no meio de cultura final.
  6. Meio de crescimento RPE Fetal. Preparar o meio de crescimento por mistura de todos os reagentes no kit RTEGM no meio basal, de acordo com as instruções do fabricante, com excepção para o FBS.
  7. Fetal mídia RPE chapeamento. Prepare a mídia chapeamento por transferência de uma pequena quantidade de meio de crescimento para um recipiente estéril e umFBS DD para uma concentração final de 2%.
  8. Dispase: Preparar a solução de trabalho de dispase de 1 mg / ml em DMEM/F12.
  9. Placas revestidas com Matrigel: Preparar matrigel em DMEM/F12 de 0,08 mg / ml.
  10. Bata de cada poço de uma placa de 6 poços com 1,0 ml da solução de matrigel.
  11. Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente durante 1,0 h.
  12. Após a incubação de 1,0 hr, aspirar o excesso DMEM/F12.
  13. Adicionar 0,5 ml de mídia mTeSR1 para evitar a secagem. As placas Matrigel revestido está agora pronto para o uso.

2. Cultura iPS

  1. Antes da semeadura de células iPS tem todos os tubos, quente mídia mTESR1 à temperatura ambiente, e as placas Matrigel revestido prontos.
  2. Rapidamente descongelar os IMR90-4 células iPS em um C banho de água 37 °. Em seguida, remover o frasco de congelação do banho de água e esterilizar utilizando etanol a 70%.
  3. Transferência das células para um tubo de 15 ml com uma pipeta de 2 ml para minimizar a quebra de agregados celulares.
  4. Gota a gota, adicionar 5 ml de warm media mTeSR1 para as células e misture delicadamente. Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
  5. Ressuspender com cuidado os agregados celulares em 2 ml de mídia mTeSR1 e semear as células em um poço de uma placa de seis bem.
  6. Colocar a placa num incubador e a cultura C 37 ° com 5% de CO 2, 95% de humidade.
  7. Altere o meio de cultura de células iPS diária. Colônias indiferenciadas aparecerá 5-7 dias após a semeadura. Verifique a existência de colônias indiferenciadas que estão prontos para a passagem (colônias com um centro denso).

3. Passaging de iPS Cells

  1. Antes de começar a passagem das células iPS, ter todos os tubos, solução dispase, mídia DMEM/F12 e mTERS1 aquecido à temperatura ambiente, eo matrigel placas revestidas pronto.
  2. Antes passaging células iPS, remova quaisquer áreas de diferenciação por raspagem da área e aspirando a mídia. Diferenciação deve permanecer abaixo de 20% do poço em altaculturas de qualidade. Lavar cuidadosamente o contendo células bem com 2 ml de DMEM/F12 iPS e adicionar 1 ml de 1 mg / ml de dispase a cada poço.
  3. Incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar o dispase e lavar cuidadosamente as colônias de células com 2 ml de DMEM/F12 duas vezes.
  4. Depois de enxaguar, adicionar 2 ml de mTSER1 a cada poço.
  5. Usando uma pipeta de 5 ml raspe as colônias da placa para formar agregados.
  6. Transfira as colônias isoladas para um tubo cônico de 15 ml. Adicionar mídia mTeSR1 suficientes para semear a próxima passagem das células.

4. Diferenciação de células iPS para iPS-RPE

  1. Placa as células iPS para uma placa recém revestido em mídia mTESR1.
  2. Permitir colônias de células iPS a se expandir por 4-5 dias em cultura.
  3. Mídia mTeSR1 substituto com a mídia 4 ml diferenciação. Mude metade dos media a cada 3 dias.
  4. Permitir focos pigmentadas para crescer o suficiente para ser dissecado manualmente fora da cultura (40-50 dias).
  5. Use uma200 mL ponteira para cortar ao redor e levantar as colônias pigmentadas.
  6. Coletar e reunir as colônias dissecados em um tubo cônico de 15 ml.
  7. Em seguida, adicionam-se 5 ml de DMEM/F12 para as células de RPE reunidas e centrifugar a 300 xg durante 5 min, duas vezes.
  8. Prepara-se uma solução de uma única célula, incubando a reunidas iPS-EPR com 0,25% de tripsina EDTA.
  9. Lavar as células iPS-RPE com a mídia iPS-RPE e placa as células coletadas em um poço em 4 ml de mídia iPS-RPE revestido de matrigel fresco.
  10. Cultura das células durante 3 semanas antes da passagem. Troque a mídia a cada 3 dias. Para o experimento, placas IPS-RPE em 100.000 células / cm 2. Coletar as células no dia 17. Conte o dia da semeadura como Dia 0.

5. Coleta de Amostras

  1. Coleção de células iPS
    1. Cultura as células iPS indiferenciadas até colônias são observados para ser denso no centro.
    2. Lavar as colônias em DMEM/F12.
    3. Dissociar-se em células individuais usando accutas e. Recolher as células para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 2 ml de DMEM/F12.
  2. Coleção RPE Fetal
    1. Lavar culturas de células de RPE Fetal com DMEM/F12 e dissociar-se em células individuais usando 0,25% de tripsina EDTA.
    2. Coletar as células em um tubo cônico de 15 ml. Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 2 ml de DMEM/F12.
  3. Coleção de células iPS-RPE
    1. Quando a IPS-RPE atingir passagem 3 e passagem 5, recolher as células no dia 17 após a passagem. Lavar iPS-RPE por duas vezes em PBS e preparar uma suspensão de células individuais por incubação com 1,0 ml de 0,25% de tripsina.
    2. Neutralizar tripsina com 2 ml de gelo frio mídia iPS-RPE.
    3. Recolher as células num tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
    4. Ressuspender a suspensão de células em 3 ml de tampão de coloração de kit de microesferas.
ve_title "> 6. Negativa Seleção de iPS-RPE para remover as células indiferenciadas

  1. Manter todos os reagentes a 4 ° C até à sua utilização, mas não funcionam em gelo. Suspensão de células a partir do passo 5.3.4 Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
  2. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de coloração de kit de microesferas por 2 x 10 6 células.
  3. Adicionar 10 ul de anticorpo anti-TRA-1-60-PE por 2 x 10 6 células.
  4. Misturar bem e incubar a 4 ° C durante 10 min.
  5. Lavar células em 1-2 ml de tampão por 2 x 10 6 células. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Aspirar o sobrenadante.
  6. Suspenda as células em 80 ul de tampão de coloração por 2 x 10 6 células. Adicionar 20 ul de microesferas anti-PE rotulados (do kit) por 2 x 10 6 células. Misture bem. Incubar durante 15 minutos a 4 ° C.
  7. Adicionar 1-2 ml de tampão de coloração por 2 x 10 6 células. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Aspirar o sobrenadante.
  8. Ressuspender as células em 500 & #956; l de tampão de coloração.
  9. Separação celular magnética:
    1. Colocar a coluna no seleccionador de células magnético. Lavar coluna com 3 ml de tampão de coloração.
    2. Aplicar a suspensão de células a partir de 6,8 em coluna.
    3. Colocar um tubo na porta negativa para recolher os TRA-1-60 células negativas.

7. ARN total Extracção

  1. Lyse as células executando as amostras através de uma coluna de microcentrífuga homogeneizador mini-rotação disponível no mercado projetado para minipreps ácidos nucleicos.
  2. Extrato de RNA total a partir de células iPS, iPS-RPE e RPE fetal com o kit de extração de RNA disponível no mercado projetado para preservar as pequenas moléculas de RNA 27.
  3. Determine as concentrações totais de RNA usando um espectrofotômetro Nanodrop.

8. Bioanalyzer e Microarray Assay

  1. Verifique a integridade do RNA com Bioanalyzer em conjunto com o kit de qualidade RNA disponíveis comercialmente.
  2. Incubar 100 ng deRNA total com fosfatase intestinal de vitelo a 37 ° C durante 30 min
  3. Desnaturar o RNA utilizando 100% de DMSO a 100 ° C durante 5 min.
  4. Rotular as amostras com PCP-Cy3 usando ligase T4 por incubação a 16 ° C durante 1 hora.
  5. Hibridizar em um formato de matriz 8_x_15K miARN humano.
  6. Lavar as matrizes de acordo com as instruções do fabricante e digitalizar a uma resolução de 5 mM usando um scanner.
  7. Aquisição de dados usando o recurso de microarray software extração compatível com o microarray miRNA.
  8. Processar os sinais miRNA para determinar o nível relativo de expressão em cada amostra.
  9. Comparar os níveis de cada um miARN entre os grupos de amostra de expressão. Escolha miRNAs com expressão diferencial, pelo menos, duas vezes maior para posterior análise.
  10. Usando um software disponível no mercado para análise de dados, siga as instruções para gerar mapas de calor para visualização de miRNAs diferencialmente expressos 28.

9. Análise Pathway

  1. Salve os dados dos miRNAs selecionados em 8,9 em formato Excel.
  2. Faça o login no programa de análise de RNA via online. Faça o upload do arquivo do Excel. Selecione "Format flexível" para o formato de arquivo e selecione "Agilent" da lista drop-down para o tipo de identificador.
  3. Sob rubrica de dados brutos, atribuir "ID" para sondar coluna ID e atribuir "Observação 1" e "relação de log" para a coluna de ração log. Selecione "ignorar" para todas as outras colunas.
  4. Selecione os parâmetros para análise, conforme segue: Confiança: experimentalmente apenas observado; incluir as relações diretas e indiretas; e incluem produtos químicos endógenos; Seleccione a base de conhecimento Ingenuity como o conjunto de referência. Escolher a base de dados de referência de moléculas que inclui os dados de todas as espécies, todas as linhas de células e tecidos, e todas as mutações.
  5. Rede Run e caminho analisa.

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Representative Results

células iPS (Figura 1A) foram cultivadas em condições de diferenciação para induzir a diferenciação em células iPS-RPE. O iPS-RPE exibiu clássico fenótipo de RPE hexagonal morfologia das células pigmentadas (Figura 1B), semelhante ao RPE fetal (Figura 1C).

Para entender melhor o papel que pode desempenhar miRNA durante o processo de diferenciação de iPS a iPS-EPR, análise de microarray de expressão miRNA foi conduzido. O RNA total foi coletado a partir de células iPS, RPE fetal e iPS-RPE usando o kit de isolamento Mirvana miRNA para assegurar a retenção máxima de pequenos RNAs. O RNA foi quantificado e testadas para a pureza antes da hibridação com o microarray LabChip. Sondas representando 1.205 144 miRNAs viral humana e foram utilizados para analisar a expressão de miRNA de cada conjunto de amostras. Os sinais foram analisados ​​para determinar os níveis relativos de expressão de cada miARN de cada amostra. Os dados foram utilizados para comparar a miARN e perfil xpression de iPS-RPE para iPS e RPE fetal. Mapas de calor foram geradas para permitir a visualização de expressão miARN diferencial entre os grupos (Figura 2A). 83 miRNAs que foram diferencialmente expressos nas iPS em comparação com iPS-RPE, com 47 miRNAs upregulated nas iPS, em comparação com iPS-RPE, e 36 downregulated nas iPS (Figura 2B). 110 miRNAs foram diferencialmente expressos em RPE fetal em relação ao IPS-RPE, com 61 miRNAs upregulated no fRPE e 49 downregulated no fRPE comparação com iPS-RPE (Figura 2C). A análise via com software Engenho IPA indicou os diferencialmente expressos transcritos alvo miRNAs para genes envolvidos no desenvolvimento celular, o crescimento, a proliferação e sobrevivência, do ciclo celular, e o movimento celular. MiRNAs expressa em tecidos oculares in vivo foram encontrados para ser enriquecido em iPS-RPE e RPE fetal em comparação com iPS (Figuras 3 e 4).

t "fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 1
Figura 1. Imagens de campo claro de iPS, RPE fetal, e iPS-RPE. Imagens de campo claro (100X) de células iPS antes de diferenciação, RPE fetal, e RPE derivado iPS. Tanto o RPE fetal e iPS-RPE exibir morfologia RPE clássica de forma hexagonal e pigmentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
MiRNA perfil de expressão Figura 2. Das iPS-RPE comparação com iPS e RPE fetal. A) mapas de calor retratam o grau relativo de expressão diferencial de miRNAs. A corescala representa os níveis de miRNA como acima (vermelho), abaixo (verde) de expressão, ou no nível médio de expressão (preto) em todas as amostras. B) Comparação de perfis de miRNA de iPS-RPE para as células iPS. C) Comparação entre perfis de miRNA de iPS-RPE a RPE fetal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. A) Análise de rede dos perfis de expressão de miRNA das células iPS dos pais em relação ao RPE iPS derivadas. Os 4 melhores redes são apresentados separadamente (à esquerda) e fundiu (centro). B) Análise de Caminho de miRNAs diferencialmente expressos. Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. A) Análise de rede dos perfis de expressão de miRNA de RPE fetal contra o RPE iPS derivadas. Os top 7 redes são apresentados separadamente (à esquerda) e fundiu (centro) análise. B) Caminho de miRNAs diferencialmente expressos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Em conclusão, este relatório descreve os métodos utilizados para a cultura de células iPS, iPS-RPE e RPE fetal. RPE derivado do iPS são morfológica e funcionalmente similares ao RPE fetal. O iPS-RPE também expressa genes RPE característicos incluindo RPE65, CRALBP, PEDF e LRAT 16. Para melhor caracterizar estas células, o RNA foi extraído e utilizado para realizar a análise de microarray para identificar diferencialmente expressos miRNA. A análise das intensidades de sinal revelou que foi detectado o maior número de miRNAs diferencialmente expressos no RPE fetal contra comparações iPS-RPE, sugerindo a iPS-RPE pode ser mais maduro. Futuros estudos são planejados para validar esses resultados com RT-PCR.

Há vários pontos críticos durante esta experiência que deve ser cuidadosamente realizados para assegurar o sucesso do ensaio e aquisição de dados precisos. O primeiro passo fundamental ocorre durante a cultura das células iPS. células iPS deve permanecer em um pluripotent estado para manter sua stemness. As células devem ser cuidadosamente inspecionados diariamente para sinais de diferenciação. Células iPS indiferenciadas crescem como colônias multicelulares compactos. As células devem ter uma elevada proporção nuclear para citoplasma e nucléolos proeminentes. As colónias iPS são caracterizados por uma fronteira distinta, com várias camadas de células no centro. Os sinais de diferenciação incluem perda de fronteiras definidas colónias, a morfologia das células não-uniforme, e o aparecimento de tipos celulares evidentes, tais como neurónios e fibroblastos. As células individuais que foram diferenciadas pode ser removido por dispase e enxaguamento, no entanto, as colónias com estas características devem ser removidos manualmente a partir da cultura de 29.

Preparação de RNA para análise microarray é o próximo passo crítico. Inconsistente qualidade RNA é uma importante fonte de variabilidade nos dados de microarranjos. Extração de RNA deve render alto peso molecular e RNA minimamente degradadas para obter melhores resultados. Bem sucedidoExtração de RNA vai render RNA total com a degradação e livre de quaisquer contaminantes RNases mínima. Após determinação da concentração de ARN por espectrofotometria a 260 nm, a pureza da amostra deve ser determinado em 230 e 280 nm, para detectar contaminação com polissacáridos ou proteínas. A razão para 230:260:280 ARN deve ser 01:02:01 para indicar RNA de alta qualidade, sem contaminação 30.

Ao planejar o experimento de microarray, o passo mais importante é a inclusão de controles negativos para garantir a hibridização das sondas é específico, e correr cada amostra em triplicado para garantir que os sinais detectados são válidos para esse conjunto de amostras. Durante a análise dos resultados de microarray, um ponto-chave é a correcção de fundo, em que o ruído de fundo é subtraído a partir do sinal observado para dar a intensidade de sinal verdadeiro para cada sonda particular. Esta etapa irá eliminar falsos positivos, destacando os verdadeiros sinais positivos. </ P>

Finalmente, durante rede e análise de caminho dos resultados de microarray, o passo mais importante é estabelecer os parâmetros e filtros corretos antes de executar a análise. Este passo irá determinar quais as bases de dados serão utilizados pelo software para gerar as redes e identificar vias celulares que são retidos pelos miRNAs mostrados para ser diferencialmente expressos nas comparações.

Após a aquisição de dados usando os métodos descritos neste relatório, é necessário considerar as limitações destes ensaios durante a interpretação dos resultados. Embora improvável, é possível ainda que a cultura RPE não é uma população homogênea de células RPE. O processo de separação anti-TRA-1-60 é um processo de selecção negativa que remove as células que ainda expressam marcadores de células estaminais; no entanto, não garante que as células restantes são células RPE puros. Embora morfologicamente as células apresentam morfologia clássico RPE de pigmentação umnd forma poligonal célula, é possível que nem todas as células são de RPE.

Experiências microarray pode produzir falsos positivos para a expressão de RNA, em particular no caso de microRNA devido às sequências muito curtos. Embora o sistema de microarray utilizado para esta experiência incluiu várias sondas ao alvo diferentes regiões de cada alvo, os resultados devem sempre ser validado por qRT-PCR.

Análise de dados de microarray pelo Engenho IPA é dependente da quantidade e da qualidade da informação na base de dados engenho. Grande parte das informações sobre a função de genes e caminhos celulares é derivada de experimentos realizados em linhas de células transformadas ou no contexto da investigação do cancro. Portanto, os resultados da via e análise de rede utilizando este programa pode nem sempre ser relevante para as células primárias ou, neste caso, as células estaminais.

Apesar destas limitações, os métodos descritos neste relatório pode ser utilizado paracultura de células iPS e RPE fetal, derivando EPR a partir de células iPS, e extração de RNA para análise microarray de miRNA. Os dados gerados por esses ensaios podem ser utilizados para identificar os miRNAs envolvidos no processo de diferenciação, bem como aqueles que regulam as funções de RPE.

Embora mais miRNAs foram encontrados para ser diferencialmente expressos no RPE fetal vs comparação iPS-RPE que nos iPS versus comparação iPS-RPE, há muitas razões possíveis para isso. Em primeiro lugar, no momento em que este ensaio foi realizado, a plataforma de microarray miARN foi capaz de detectar 1,205 144 miRNAs virais e humano. Desde aquela época, a plataforma tem sido expandida para incluir sondas para mais de 2.000 miRNAs humanos. É certamente possível que os perfis de expressão diferencial de miRNA vai mudar se forem detectados mais miRNAs. Dos 1349 miRNAs detectados por este ensaio, a maioria destes pequenos RNAs não mostrou nenhuma diferença na expressão entre os tipos de células (Figuras 2B e 2C

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

As opiniões ou afirmações contidas neste documento são os pontos de vista particulares de seus autores e não devem ser interpretadas como funcionário ou como refletindo os pontos de vista do Ministério do Exército ou do Departamento de Defesa.

Esta pesquisa foi realizada enquanto os autores Whitney A. Greene, Alberto Muniz, e Ramesh R. Kaini realizou uma Pós-Investigação Associateship Conselho Nacional de Pesquisa da USAISR.

Os ensaios foram realizados por Microarray Facility Cancer Research Institute Microarray Núcleo do Greehey Crianças e Bioinformática Departamento da UT Health Science Center San Antonio.

Este trabalho foi apoiado pelo Exército dos EUA Programa de Clínica de Reabilitação Medicina Research (CRMRP) e Militar Programa de Pesquisa em Medicina Operacional (MOMRP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5X supplement Stem Cell Technologies 5850
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-β-mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Fetal RPE media RTEGM kit Life Technologies 195406
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Trypsin Hyclone(Fisher) 25200-072
Miltenyi Biotec washing buffer StemGent 130-092-987
Miltenyi Biotec rinsing buffer StemGent 130-092-222
Anti-TRA-1-60 microbead kit StemGent 130-095-816
Miltenyi Biotec cell sorter column StemGent 130-021-101
RNeasy micro kit Qiagen 74004
QIA shredder Qiagen 79654
RNA 6000 Pico LabChip kit Agilent G2938-90046
Human miRNA microarray v16 Agilent G4471A

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References

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