בנייה ואפיון של Bioreactor פולד רומן וקאלי

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zerdoum, A. B., Tong, Z., Bachman, B., Jia, X. Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor. J. Vis. Exp. (90), e51594, doi:10.3791/51594 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

לקפל ווקאלית האנושית, מורכבת משכבת ​​האפיתל, propria lamina (LP) ושרירי vocalis, הוא ברקמות רכות מיוחדות שממירה את זרימת אוויר מהריאות לגלים אקוסטיים להפקת צליל. 1 קפלי קול להתנדנד באופן קבוע במהלך phonation הנורמלי, תערוכת זנים של עד 30% בתדרים בסיסיים החל 100-300 הרץ. LP לקפל ווקאלית 2 מבוגרים הוא צבע מבנה מורכב משטחי (SLP), ביניים (ILP) ושכבה עמוקה (DLP). קבוצות נוספות סיווג האפיתל וSLP כשכבת רירית, ומשלבים את ILP וDLP לתוך הרצועה ווקאלי. 3 שכבת SLP מכילה בעיקר מטריקס אמורפי עם סיבי collagenous מפוזרים בדלילות, ואילו הרצועה מועשרת בקולגן בוגר וסיבים האלסטין כדי לספק כוח מספיק. 4 המבנה והמכניקה של קפלי קול יילוד להשתנות באופן משמעותי מעמיתיהם בוגרים שלהם. למרות שמנגנוןשל ויסות התפתחות לקפל ווקאלית והתבגרות עדיין לא מובן לחלוטין, ראיות ניסיוניות הצביעו על תפקידי ההגדרה של לחץ מכאני המופק מניקוד.

כמה מצבים רפואיים, ובכלל זה שימוש לרעה בקול, זיהומים, חומרים מגרים כימיים וניתוחים, עלולים לגרום נזק לקפל ווקאלית. הפרעות לקפל ווקאלית להשפיע 3-9% מאוכלוסיית ארה"ב. שיטות טיפול הנוכחיות להפרעות לקפל ווקאלית מוגבלות 5 וגישה הנדסית גזע מבוסס תאי רקמה התפתחה כאסטרטגיה מבטיחה לשחזור תפקוד לקפל ווקאלית. תאי גזע mesenchymal (MSCs) הם אלטרנטיבה מתאימה לfibroblasts לקפל ווקאלית העיקרית להנדסת רקמות לקפל ווקאלית. 6-9 מפרט גורל תאי גזע ופיתוח רקמות הבא מתווכים על ידי הנישה הספציפית שהם מתגוררים, אשר מצבו המכני הוא גורם חיוני. 10 כוחות מכאניים הם רגולטורים חיוניים של המורפוגנזה רקמהnd הומאוסטזיס, במיוחד לרקמות שנחשפות באופן שיגרתי לטעינה. 11 מנקודת מבט של הנדסת רקמות, זה כבר הוכיח כי חשיפה לגירויים פיזיולוגית מכאניים רלוונטיים מקדם גזע התמיינות תאים ושיפוץ מטריצת רקמות ספציפיות. 12-15

bioreactors תרבית רקמה נועדו לדמות את הסביבה הפיזיולוגית הרצויה לצמיחת תאים או רקמות במבחנה. להנדסת רקמות לקפל ווקאלית, זה קריטי במיוחד כדי לשחזר את הסביבה מכאנית של קפלי קול phonating. Bioreactor לקפל ווקאלית אידיאלית צריך למעשה לספק רמזי רטט לתאי תרבות, המאפשר שליטה קלילה על תדר, המשרעת ומשך זמן של תנודות. Titze ועמיתים לעבודה המציאו bioreactor וקאלי לקפל (bioreactor T1) 16 שמשלב מתיחה סטטית עם תדירות גבוהה (20-200 הרץ) תנודות כדי לעורר את הייצור של חלבוני מטריצה. מנצלגרם bioreactor זה, ווב ועמיתים 17 חקרו את ההשפעות של 10 יום, תנודות 100 הרץ על fibroblasts עורי בתרבית בחומצה היאלורונית (HA) מבוסס הידרוג'ל. מבני נתונים לרעידות הציגו ביטוי גבוה של HA synthase-2, decorin, fibromodulin ומטריקס metalloproteinase-1 (MMP1), ביחס לבקרות סטטי (HAS2). השפעות גירוי נמצאו להיות תלוי בזמן. לאחרונה, הקבוצה שלנו 18 התאסף bioreactor וקאלי לקפל (bioreactor J1) באמצעות מגבר כוח, מחוללים אותות, רמקול חזק ומוקף קרום סיליקון circumferentially מעוגני המעביר את אוויר נדנוד לתאים המצורפים. fibroblasts עורלת ילודים טיפח בbioreactor J1 היו נתונים לשעה 1 של רטט ב60, 110 או 300 הרץ, עם מתח במטוס של עד 0.05%. תוצאות qPCR הציעו כי הביטוי של גנים מסוימים ECM שונו באופן מתון בתגובה לתדרי רטט המגווניםואמפליטודות.

עיצובי bioreactor אלה, בעוד מסקרן, יש כמה מגבלות. לדוגמא, מערכת T1 דורשת מספר רב של מחברים וברים לצימוד מכאני, להגביל את התדרים מקסימאלי שניתן להשיג. יתר על כן, תאים עשויים להיות חשופים להפרעות חרדה ונוזל מכאניות בלתי רצויות שתסבכנה את פרשנות הנתונים. Bioreactor J1, לעומת זאת, מציג את יעילות המרת אנרגיה נמוכה יחסית ואינו ידידותי למשתמש. בנוסף, רטט בתדירות גבוהה מנתק את מבני התא עמוס מקרום סיליקון בסיסי. Bioreactor J2 לקפל ווקאלית שדווח כאן, שתוכנן על בסיס אותו העיקרון כמו גרסת J1, מותאם במיוחד עבור עקביות ושחזור. התנודות מחקה-phonation נוצרות מבחינה אווירודינמית בתאי רטט מותאמים באופן אישי שבו פולי MSC-מאוכלסים סיביים (ε-caprolactone) פיגומים (PCL) הם effectivהשיג איליי. הלייזר דופלר vibrometry (LDV) מאפשר למשתמש לאמת את פרופיל הרטט של ההרכבה קרום / פיגום. בהפגנה שלנו, MSCs חשופים לתנודות סינוסי 200 הרץ עם דפוס 1-HR-on-1-HR-off (של) עבור סכום כולל של שעות 12 ביום למשך 7 ימים. תגובות תאיות לרמזי רטט הוטלו נחקרות באופן שיטתי. בסך הכל, לקפל ווקאלית J2 מספק את התכונות הכי ידידותי למשתמש, המאפשר לימודי תרבות תא דינמי להתנהל בתפוקה גבוהה ואופנה לשחזור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bioreactor עצרת (וידאו 1)

  1. הפוך תבנית אלומיניום (למות עגול + סיכת spacer) עם ממדים פנימיים וחיצוניים שנקבעו מראש (איור 1).
  2. שימוש בעובש משלב 1.1, לפברק קרום סיליקון (קוטר: 42 מ"מ, עובי: 1.5 מ"מ, איור 1) עם שרוול מושרש (קוטר: 12 מ"מ, עובי ~ 0.25 מ"מ, מעוצב על ידי סיכת spacer באיור 1) ב האמצע באמצעות ערכת אלסטומר סיליקון זמינה מסחרי.
  3. הפוך זוג לוקי אקרילי (איור 2 (4, 5)) עם פתח עגול (קוטר: 24 מ"מ) באמצע, לחרוט את החלק העליון (1.8 ס"מ עובי) ותחתון (0.9 ס"מ עובי) בלוקים עם רכסים וחריצים התאמה . 10
  4. כריך קרום סיליקון בין גושי אקריליק לזווג. אבטח את ההרכבה עם ארבעה ברגי פינה באמצעות מברג מומנט מיקרו להגדיר לכוח קבוע (35 CN · מ '). כתוצאה מכך,, מ '24 מים חזקקאמרי רטט עמוק מ 'רוחב ו18 מ"מ נוצר (איור 2 ג).
  5. הר 3 מיני וופר טווח ארוך "(איור 2 ד, 8 Ω/20 W) מתחת לתא הרטט דרך קבוצה נוספת של ברגי פינה בשכונה אקריליק התחתונה. בשלב זה, מודול רטט אישי מורכב.
  6. לשכפל שבעה מודולים רעידות נוספים. להדביק ארבעה מהם לאחת משני ברים נייחים אלומיניום (40 סנטימטר x 10 סנטימטר x 2.5 סנטימטר) על ידי הצבת בסיסי הרמקול בחורים במרווחים שווה עגולים (קוטר: 7 סנטימטר, עובי: 2 סנטימטר) חתוך לסורגים. לייצב את כל רמקול על ידי החדרת ברגים דרך הצד של בר האלומיניום לתוך כל חור עגול.
  7. בנפרד לשלוט ברמקולים על ידי בורר רמקולים. חבר רמקולי פרט לבורר על ידי הצמדת חוטים לכניסות החיוביות ושליליות על גוף הרמקול אז ליציאות המתאימות בבורר. בורר הרמקול מאפשר את האות מ tהוא מחולל אותות, לאחר שעברו דרך מגבר כוח, כדי להגיע לכל שמונת רמקולים בבת אחת (2E איור).
  8. הכנס את שני המערכים קאמריים, בורר הדובר והאלקטרוניקה קשורה במארז אנטי לחות. בית כולו ההרכבה בתרבית תאי חממה מסחרית.
  9. להאכיל את הכבלים הראשיים (דרך צינורות PVC כיתה רפואית) המחבר את מגבר הכוח ובורר רמקול באמצעות ההרכבה המסנן בחלק האחורי של החממה.

2. ייצור פיגום ואפיון

  1. לפזר כדורי PCL בכלורופורם בריכוז של 15% WT. טען את הפתרון לתוך מזרק 10 מיליליטר כתרים עם מחט קהה הסתיים 21 G.
  2. נעל את המזרק על משאבת מזרק לתכנות ולקבוע את קצב הזרימה ב1 מיליליטר / שעה.
  3. הנח את האספן מכוסה רדיד האלומיניום מול המחט אופקית, עם מרחק קצה מחט לאספן של ~ 18 סנטימטר.
  4. הצמד את alli החיוביקליפ תנין לאמצע של המחט, וקליפ תנין הקרקע לאספן האלומיניום, ולאחר מכן קבע את המתח באספקה ​​החשמל במתח הגבוה ב15 KV. זהירות: מתח גבוה, מרחק לשמור מהמחט.
  5. רצף להפעיל את משאבת המזרק ואספקת חשמל; מהירות נקי / להסיר את פתרון הפולימר השיורי המקיף את קצה המחט באמצעות מגבת נייר יבשה לפני שמטוסי סיבים יציבים וקונוס טיילור 19 נוצרים.
  6. לאפשר הסיבים מצטברים על אספן אל לעובי של ~ 250-300 מיקרומטר (~ 7 שעות בתנאי ספינינג הנוכחיים). אחסן את הפיגומים שנוצר בייבוש ואקום ל1-2 ימים כדי להסיר כל ממס שיורית.
  7. תמונת הפיגומים, גמגום מצופים בזהב, תוך שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני סורק כדי להראות מורפולוגיה סיבים עקבית. 10

3. עצרת Bioreactor ואפיון

  1. אגרוף דיסק גלילי (קוטר: 8 מ"מ) עם ארבע זרועות (אורך: 2מ"מ) מחוץ למזרן PCL כ- סובב (איור 2 א) על ידי השימוש ראשון ביופסיה בקוטר מ"מ 12 לחתוך את הקוטר החיצוני של הדיסק. לאחר מכן להשתמש בביופסיה שנייה, 8 מ"מ לעשות חריצים ארוכים ארבעה 2 מ"מ מחולקים באופן שווה סביב הלהב המעגלי להבקיע בי הזרועות הן להיחתך. לאחר הבקיע עם אגרוף 8 מ"מ, השתמש בלהב סכין מנתחים כדי לחתוך את הקצוות של הזרועות כלפי חוץ. הכנס את הפיגום לתוך החריץ של קרום סיליקון באמצעות זרועות המורחבות (וידאו 1). שטח את הפיגום מוחדר בעדינות על ידי הלחיצה על המשטח באמצעות פינצטה השטוחה.
  2. צרף חתיכה קטנה של רדיד אל הדק (8 מ"מ x 2 מ"מ, צורה מאונך, איור 2) לפיגום PCL כדי לסייע השתקפות לייזר.
  3. אבטח את הקרום / הפיגום התאסף סיליקון PCL (כמפורט בשלב 1.4) בחדר הרטט. הוסף 1.5 מיליליטר מים בחדר כדי ללחלח את פיגום PCL לפני הרטט.
  4. באמצעות מחולל הפונקציה, להציג את רטט סימןals (למשל, גלי סינוסי 200 הרץ עם מתח שיא לשיא, VPP, של 0.1 V) לתא אקריליק דחוק. השתמש במד מתח כדי למדוד את המתח בצורה מדויקת בכל קלט רמקול. הערה: את הודעת Vpp ממחולל הפונקציה יהיה שונה ממתח סופו של הדבר נמסר לרמקול.
  5. להרכיב את LDV הנקודה אחת ולאבטח את ראש חיישן לייזר הסיב אופטי לחצובת ראש Pan-Tilt. זווית ראש החיישן, כך שהוא מצביע בניצב לשולחן. חבר את ראש חיישן LDV למודול רכישת נתונים דרך כבל קואקסיאלי אז מודול למחשב הנייד באמצעות כבל USB.
  6. למקד את קרן הלייזר בניצב בנקודות שנקבעו מראש שונות על קרום סיליקון (איור 2 ואיור 3).
  7. שימוש בתוכנת רכישת נתונים, להקליט עקירת אמצע קרום. לחץ על "הגדרות רכישה" מתפריט "אפשרויות"; לאחר מכן לשנות את מצב המדידה ל" FFT221;. בשלב הבא, לחץ על "המדידה רציפה" בסרגל הכלים הראשיים ולאחר מכן לחץ על השיא שנוצר בתדירות שנבחרה (איור 6 ד) כדי להקליט את העקירה.
  8. עלילה העקירה הרגילה אמצע קרום (w 0) כפונקציה של המיקום היחסי על פני המצע. לבנות מפת צבעי 3D של פרופיל התנודה פני השטח באמצעות תוכנת ניתוח 8.5 נתוני מקור.

4. תרבית תאי רטט

  1. MSCs עצם אנושי תת התרבות שמקורם במח בצלוחיות תרבית רקמת T150 בצפיפות זריעה ראשונית של 4,000-5,000 תאים / 2 סנטימטר בתקשורת תחזוקת MSC.
  2. אחרי 7-8 ימים של תרבית תאים (ל~ confluency 85%), trypsinize התאים עם מגיב תא דיסוציאציה כגון Accutase, לספור באמצעות hemocytometer, צנטריפוגה (440 XG במשך 5 דקות), ומחדש להשעות את התא גלולה ב תקשורת טרי MSC תחזוקה בריכוז של 4.5 x 10 6 תאים / מיליליטר.
  3. לטבול את scaffo PCLld ב70% O / נ אתנול לאחר הממס מתאדה, חושף את שני הצדדים של הפיגום לקוטל חידקים אור UV (254 ננומטר) ל5-8 דקות.
  4. משרים את פיגום PCL בפתרון פיברונקטין 20 מיקרוגרם / מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הכנס את הפיגום מצופה פיברונקטין לתוך קרום סיליקון. להרכיב את bioreactor כמפורט בשלב 1.
  5. הפץ 40 μl של ההשעיה התא באופן שווה על פיגום PCL המאובטח. אפשר התאים לצרף ל1-1.5 שעה לפני הוספת 1.5 מיליליטר נוסף תקשורת טריות לתא הרטט.
  6. תרבות פיגום MSC העמוס PCL באופן סטטי במשך 3 ימים ולרענן את התקשורת עם השלמת תרבות סטטי.
  7. להטיל משטרי רטט שנבחרו למבנים התאיים. הערה: כדוגמא, תאים חשופים ל- HR-off 1-HR-on-1 (של) רטט ב200 הרץ עם aw 0 של ~ 40 מיקרומטר ל12 שעות ליום לתקופה של עד 7 ימים. מבני נתונים לגירויי רטט מיועדים לשמש כדגימות VIB וcultu אלהאדום באופן סטטי בתאי רטט זהים ישמש פקדים סטטיים כ( Stat).

5. הערכות ביולוגיות

  1. לאסוף 200 תקשורת תרבות תא μl מכל תא בכל יום אחר (יום 1, 3, 5, ו -7) וברכה aliquots מהמדגם זהה יחד (800 μl כל אחד).
  2. לכמת את הייצור התאי של מטריקס metalloproteinase-1 (MMP1) וHA באמצעות ערכת ELISA MMP1 פיתוח וערכת ELISA תחרותית hyaluronan, בהתאמה, בעקבות ההליך של היצרנים. בינתיים, assay הייצור של מבשר אלסטין מסיס בעקבות הליך ELISA שדווח בעבר. 8
  3. עם ההשלמה של מחזור הרטט שעבר ביום 7, להסיר במהירות את המבנים התאיים מתאי הרטט באמצעות פינצטה חדה ובקצרה לשטוף אותם עם שנאגרו מלוח פוספט הקר (PBS, 4 מעלות צלזיוס).
  4. לצביעה החי / המתה, דגירה המבנים עם יודיד propidium (1:2,000 PBS) וSyto-13 (1:1,000 ב-PBS) בו זמנית למשך 5 דקות ב RT. תמונת המבנים המוכתמים במיקרוסקופ confocal multiphoton.
  5. בנפרד, Snap-להקפיא את המבנים תאיים ושטף PBS על קרח יבש ולחלץ את RNA הסלולרי בסך הכל בעקבות פרוטוקול שדווח בעבר לניתוח גנטי. 9
  6. בדוק את הכמות והאיכות של RNA חילוץ באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. דגימות RNA עם יחס A260/A280 וA260/A230 של 1.8-2.2 משמשות לניתוח qPCR שלאחר מכן.
  7. הפוך לתמלל RNA (500 ng / מדגם) לתוך cDNA באמצעות ערכת שעתוק לאחור זמינה מסחרי.
  8. בצע את תגובת PCR על מערכת זיהוי רצף זמן אמת באמצעות תערובת הורים PCR זמינה מסחרי בעקבות ההליך שפורט קודם לכן. 8
  9. לנתח את תוצאות qPCR באמצעות תוכנת ניתוח נתונים qPCR מסחרית. כדי להבטיח את האמינות של ניתוח נתונים, גנים התייחסות מרובים (YWHAZ, TBP, PPIA) מועסקים כintפקדי ernal, והשונות של יעילות פריימר ספציפית נלקחים בחשבון. 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פיגומי PCL המפוברק על ידי electrospinning מכילים נקבוביות מיקרון בגודל ביניים וסיבים הסתבכו באופן אקראי עם קוטר ממוצע של 4.7 (איור 4 א) מיקרומטר. בהגדלה גבוהה יותר, חריצים ונקבוביים ננו גלויים על סיבים בודדים (איור 4). ציפוי של הפיגומים עם פיברונקטין משפר hydrophilicity ומקל על הידבקות התא הראשונית / מתפשט על פיגום PCL (תצפית לא פורסם).

גל סינוסי בתדירות רצויה (ו, 100-300 הרץ) ומתח (Vpp: 0-.125 V) הם הציגו את הרמקול מתחת לכל תא רטט, ואת האוויר הכלוא בין החלק התחתון של קרום סיליקון וקונוס הנייר של המיני וופר הוא מונע לתנודה. תנודת האוויר מועברת לפיגום PCL עם או בלי תאים. LDV משמש כדי לנתח את מאפייני הרטט של הפיגום בf נתון וVPP,תוך לקיחה בחשבון את מקדם השבירה של מים (1.33). 20 איור 5 מראה את העקירה הרגילה (w 0) במרכזו של פיגום PCL כפונקציה של Vpp וגם ו. תדרי הרטט נבחרו כדי לשקף את תדרי דיבור אנושיים בסיסיים. 21 יש קשר ליניארי בין w 0 ו VPP בטווח של 0-.125 V עבור כל התדרים נבדקים. בVpp נתון, w 0 ירידות כמו עליות ו 100-300 הרץ.

מצב ספציפי רטט (f = 200 הרץ, Vpp = 0.1 V) נבחר לניתוח נוסף. פרופיל המהירות כפונקציה של זמן (איור 6 א) מראה כי אות סינוסי הציגה לרמקול הוא נתפס על ידי פיגום PCL עם נאמנות גבוהה. מרכז פיגום PCL נע אורכים עם מהירות שיא של 52 מ"מ / שנייה, האצת שיא של 66 מ '/ השני 2 (~ 6.7g) ועקירה רגילה של ~ 40 מיקרומטר. האותות ההרמוניים ב100, 300, 400 ו500 הרץ הם לפחות בסדר גודל נמוך יותר מאלו בתדר הבסיסי (200 הרץ). עם זאת, אם ערך Vpp הוא גבוה מדי (0.15 V), פסגות הרמוניות מרובות של עוצמה דומה לתדר הבסיסי מזוהות (איור 7). פרופיל הרטט על פני הפיגום נוצר על ידי ניטור העקירה הרגילה מתוך סך של 73 נקודות נציג בכיוונים רדיאלי של משטח PCL (איור 3). מפת צבעי 3D (איור 8) מוכיח כי הרטט זוהה על פני השטח של הקרום הוא axisymmetrical יחסית למרכז ועמדות המנוחה שלו. העקירה הרגילה נמצאה ירידה מונוטונית מהמרכז לקצה שבו הקרום מאובטח.

MSCs תרבית על פיגומי PCL בתרבית בתנאי רטט שנבחרו. תאים נתון 7-day של גירוי לשמור על מאפייני כדאיות והתפשטות דומים כמו הפקדים סטטיים (איור 9), המאשר כי הפיגומים סיביים היו cytocompatible והרטט מיושם לא גרם לאובדן יכולת הקיום. תגובות תאיות לגירויי רטט נבחנות ברמות ה-mRNA במונחים של הביטוי של חלבונים חיוניים ווקאלית ECM לקפל, כגון אלסטין (ELN), hyaluronan synthase-1 (HAS1), Col3A1 וMMP1 (איור 10). הרטט מוביל לעלייה של פי 2.3 בביטוי ELN ביום 7, ביחס לבקרות סטטי. הגירויים התנודה גדלו גם ביטוי Col3A1 באורח בינוני. ראוי לציין כי הביטוי של אנזימים עיקריים שיפוץ ECM, HAS1 וMMP1, הוא בתוספת באופן משמעותי על ידי אותות הרטט. באופן ספציפי, הטיפול הדינמי הביא לגידול של פי ~ 1.7 ו~ 16.3 לHAS1 וMMP1 ביטוי (שניהם p <0.05), בהתאמה, על הפקדים סטטיים שלהם ביום 7. בסך הכל, ההשפעה אינדוקטיביים של התנודות בHAS1 וMMP1 הייתה משופרת מהיום 3 ליום 7.

כדי לבסס עוד יותר את תוצאות qPCR, הייצור התאי של HA, אלסטין וMMP1 המסיסים הוא לכמת ידי ELISA ברמת translational (איור 11). התאים בתרבית באופן דינמי לייצר 4.2 ± 0.1 מיקרוגרם / מ"ג (למשקל פיגום יבש) אלסטין מסיס לאחר 7 ימים של תנודות, ואילו הפקדים סטטיים לצבור אלסטין 2.7 ± 0.2 מיקרוגרם / מ"ג) בלבד. בממוצע, 7 ימים של תנודות לגרום 2.2 ועלייה 4.7 של פי HA והפרשת MMP1, יחסית לפקדים סטטיים המקבילים.

וידאו 1: סימולציה 3D המראה את ההרכבה של bioreactor J2. הווידאו נוצר על ידי Autodesk 3ds max עיצוב (באדיבות Congfei שיה).

"עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 1
. איור 1 תצלום הממחיש את הממד של עובש אל משמש לבודת קרום סיליקון עם שרוול מושרש O:. קוטר, ד: עובי / עומק, שעות:. גובה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
.. איור 2 תרשים זרימה המראה את ההרכבה bioreactor () תצלום של פיגום PCL בצורה ארבע זרוע; (ב ') תמונה בה נראה פיגום PCL מאובטח בתא הרטט ורטט הלייזר התמקד בחלק התחתון של החדר; ( ג) חתך מבט אל של חדר הרטט. 1: פיגום PCL (אדום); 2: קרום סיליקון (ציאן); 3: בר נייח אל; 4: לחסום אקריליק העליון; 5: בלוק אקריליק תחתון; 6: המיני וופר; (ד ') להציג צד של מודול הרטט; (E) תמונה בה נראה את המכלול השלם. נתון זה שונה מטונג et al. 10 זכויות יוצרים 2013, מרי אן Liebert, Inc אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. איור של קרום סיליקון מסומן רדיאלית למדידות LDV נקודה אחת. נתון זה שונה מטונג et al. 10 זכויות יוצרים 2013, מרי אן Liebert, Inc

n-page = "תמיד"> איור 4
איור 4. SEM תמונות של פיגומי PCL בהגדלות שונות. () 600x, (ב) 7,000 X. נתון זה שונה מטונג et al. 10 זכויות יוצרים 2013, מרי אן Liebert, Inc אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. עקירה הרגילה במרכזו של קרום סיליקון (w 0) כפונקציה של התדירות מיושמת (100, 200 ו300 הרץ) ומתח הנהיגה (Vpp = 0-.125 V). נתון זה כבר שונה מטונג et al. 10 זכויות יוצרים 2013, מא ר"י אן Liebert, Inc

איור 6
פרופיל Velocity איור 6. מאפייני רטט שאותרו במרכזו של קרום סיליקון עם f = הרץ 200 ופרופיל Velocity Vpp = 0.1 V. () כפונקציה של זמן. (ב ') כפונקציה של תדר. (C) תאוצה כפונקציה של תדר. (ד ') עקירה רגילה (w 0) כפונקציה של תדר. נתון זה שונה מטונג et al. 10. כל הזכויות שמורות 2013, מרי אן Liebert, Inc אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/ 51594fig7highres.jpg "/>
איור 7. עקירה רגילה שזוהתה במרכזו של הקרום (w 0) כפונקציה של תדירות כאשר גל סינוסי 200 הרץ הוא הציג את המיני וופר בVpp = 0.15 V.

איור 8
איור 8. מפת צבעי 3D נבנו על ידי gridding פני השטח תוך שימוש בנתונים העקירה הרגילים שנאספו מכל המקומות המסומנים על פיגום PCL. נתון זה שונה מטונג et al. 10 זכויות יוצרים 2013, מרי אן Liebert, Inc

איור 9
איור 9. כדאיות תא, דמיינו ידי מכתים חי / מת, לאחר 7 ימים של תנודות. נתון זה שונה מדואר טונגאל t. 10 זכויות יוצרים 2013, מרי אן Liebert, Inc אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 10
איור 10 תגובות הסלולר. לגירויי רטט במונחים של הביטוי, גנים ECM פי רלוונטי ווקאלי. ביטוי גנים היחסי (לקפל שינוי) הוא מנורמל לפקדים סטטיים בהתאמה ביום 3 ויום 7 (בסיס מקווקו). **: הבדל משמעותי (p <0.05) בין היום 3 ו -7, #: השתנה באופן משמעותי (p <0.05) ביחס לנקודת ההתחלה. הנתונים מייצג את השגיאה סטנדרטית ± ​​ממוצעת של הממוצע (SEM, n = 4). מבחן t של סטודנט שני זנב משמש לניתוח סטטיסטי, עם p <0.05 להיחשב כמשמעותי difference (אותו דבר כמו בהמשך). נתון זה שונה מטונג et al. 10 זכויות יוצרים 2013, מרי אן Liebert, Inc

איור 11
איור 11. כימות ביוכימית של HA (), מסיס ELN (B) וMMP1 (C) המיוצר על ידי MSCs תרבית על פיגום PCL בתנאי Stat וVIB למשך 7 ימים. סכום כולל של מולקולות ECM למשקל פיגום יבש (מ"ג) מיוצג כממוצע ± SEM, n = 4 ממשפט הנציג #:. המשופר באופן משמעותי (p <0.05) בהשוואה לקבוצת ביקורת Stat. נתון זה שונה מטונג et al. 10 זכויות יוצרים 2013, מרי אן Liebert, Inc

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הנדסה מוצלחת של רקמות לקפל ווקאלית פונקציונליות במבחנה דורשת הבילוי של microenvironment כמו מתקפל קולני לתווך ההתנהגויות של תאי multipotent. הדעה מקובלת היא כי מבני רקמה או איבר משקפים את הפונקציות שהם נדרשים לבצע. 22 לרקמות לקפל ווקאלית, התנודות בתדירות גבוהות המתרחשות במהלך phonation מוצעות להיות חשוב להבשלת רקמות. במחקר שלנו, פיגומי PCL משמשים כדי לספק תמיכה מבנית כמו ברצועות-אילו bioreactor לקפל ווקאלית נועד להציג אותות מכאניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לMSCs בתרבית. Bioreactor שתואר כאן (J2) יוצר רטט אלקטרומגנטים דרך רמקולים בודדים ומעביר את הבחינה אווירודינמית אנרגיה לתאים בתרבית. בהשוואה לתכנון הקודם שלנו, 18 המערכת הנוכחית מעבירה את מקור גירוי רטט ישירות מתחת לכל דגימה היטב, המאפשר עבורra המרת אנרגיה יעילה יותר. כתוצאה מכך, עקירה רגילה גדולה יותר באופן משמעותי ותאוצה גבוהה יותר מושגות באמצעות המערכת הנוכחית. העיצוב המודולרי גם ממזער וריאציות מערכת והפרעות מכאניות על פני תאי רטט שונים.

העיצוב שלנו מסתמך על קרום סיליקון, כדי לספק את אותות הרטט. לכן חשוב לשמור על שלמות הקרום והומוגניות. לאחר הפתרון המבשר הוא שפך לתוך תבנית האלומיניום, רצוי להסיר את הנוזל העודף על ידי גרירת שקופיות זכוכית על פני התבנית. קרומים עקביים ללא כל בועות אוויר לכוד יכולים להיות מיוצרים על ידי הפחתת טמפרטורת ריפוי תוך הגדלת זמן ריפוי. בנוסף, פתרון אתנול 70% יכול לשמש להתנפח באופן זמני את הקרום בממשק האלומיניום כדי לאפשר הסרה קלה של סיליקון נרפא. כדי להתאים את המבנים התאיים לתרבות הדינמית 3D, חריץ דק ממוקם במרכז is יצוק לתוך קרום סיליקון, כך שפיגומי PCL ניתן לעגן שולי בתא הרטט. הגיאומטריה של החריץ היא מתכוונן; וכך את הצורה של המבנה התאי יכולה להיות מכוונת בהתאם לחקות את הגיאומטריה של קפלי קול מקוריים טוב יותר. 23 אם פיגום PCL אינו מובטח בחוזקה בקרום סיליקון, אותות LDV זוהו בPCL ובאזור החיצוני על סיליקון קרום לא חופף בצורה מושלמת. כשהרכבת bioreactor, זה קריטי, כי כל הרכיבים מאובטחים והידקו באותה המידה כדי למנוע תנועות לא רצויות וכדי למזער את התא לווריאציות קאמריות.

כדי לאמת את התועלת של bioreactor, MSCs מעובד על פיגומי PCL וחשופים ללסירוגין (של) רעידות למשך 7 ימים. תנודות על פני תקופה של כמה שעות ביום הם מועסקים כדי לשחזר את התנאים מדברים על משתמשים בקול כבדים, למשל, לשיר מקצועי ERS ומורים. 23 ניגוד bioreactors לקפל ווקאלית שדווחה בעבר, שלנו לא גורמים לשום השפעה מזיקה או טראומה פיזיולוגית לתאים.

תנודות 200 הרץ נמצאות לווסת ייצור תאי של רכיבי ECM חשובים באופן דיפרנציאלי. אלסטין הוא חלבון מבני חיוני שנמצא בכל LP לקפל ווקאלית, ומקנה גמישות ואלסטיות. 24 רכיבי אמורפי ביניים, כגון HA, תורמים לשמירה על viscoelasticity רקמה התקין ולמניעת היווצרות צלקת. 25,26 MSCs נתון ל7 הימים של טיפול מייצר כמות גבוהה יותר באופן משמעותי של אלסטין יותר מאשר עמיתיהם באופן סטטי בתרבית. ביוסינתזה HA היא גם רגישה לתנודות, כפי שאושר על ידי תוצאות qPCR על תוצאות HAS1 וELISA על HA. ממצאים אלה מראים כי גירוי הרטט מופעל על ידי bioreactor הוא תורם לייצור של מולקולות אנטי הצטלקות.

jove_content "> מחזור ECM מאוזן מסתמך על תצהיר מטריצה ​​במקביל והשפלה. 27 סוג III קולגן הוא סיב קולגן הרשתית המרכזי שנמצא בקפלי קול, המספק את הרקמה עם מאפייני נושאות עומס. 28 תנודות 7 הימים הוחלו במסמך זה לשפר את ביטוי גנים 27 של Col3A1, אך בעצמה נמוכה בהרבה מזה של אלסטין. לכן, התנודות מיושמות באופן דיפרנציאלי לווסת את המנגנון תאי מעורב בסינתזה של קולגן ואלסטין III. מעניין, MMP1, אחד MMPs העיקרי מעורב בשפלת מטריקס ורקמת שיפוץ , הוא רגיש מאוד לרמזי רטט. תוצאות אלו מסכימים גם עם הדיווחים קודמים על גברת ביטוי MMP1-Induced רטט על ידי תאים לכודים במטריצת HA. 29 בסך הכל, הגירויים הרטט שנוצרו על ידי bioreactor לקפל ווקאלית עמוקה לתווך פונקציות MSC על ידי קידום הומאוסטזיס מטריצות כמו לקפל ווקאלית של.

יותרהכל, bioreactor לקפל ווקאלית הרומן שהוצג כאן הוא מודולרית וידידותי למשתמש, המאפשר לתרבית תאים דינמיים שיש לבצע בצורה לשחזור. עם זאת, מספר מגבלות קיימות בעיצוב הנוכחי. ראשית, משרעת התנודה, אם כי השתפר מגירסת J1, הוא עדיין קטן בהשוואה לרקמות לקפל ווקאלית. שנית, bioreactor שלנו לא לדמות את ההתנגשות בין שתי המדינות של קפלי קול במהלך phonation הנורמלי. שלישית, פיגום PCL הסיבי שלנו אינו משקף את אנאיזוטרופיה הרקמות. עבודה עתידית מוקדשת לשיפור העיצוב לחקות טוב יותר את תנאי phonation ילידים. בינתיים, משטרים אופטימליים לתרבות הדינמית 3D ייבחנו להרכבה המוצלחת הפונקציונלית ווקאלי לקפל במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין אינטרסים כלכליים מתחרים קיימים.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר ג'פרי קפלן לאימונים שלו וייעוץ על ההדמיה confocal. אנו מודים גם למעבדת קק מיקרוסקופית אלקטרונים וד"ר Chaoying Ni לקבלת סיוע SEM. עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIDCD, R01DC008965 וR01DC011377). ABZ מודה אינטגרטיבית השכלה בוגרת ותכנית (IGERT) למימון המחקר Traineeship NSF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Sylgard 184 Cure the membrane at 100 °C for 2 hr
PCL Sigma Aldrich 440744-500G Mn ~80 kDa, dissolve O/N
Chloroform Sigma Aldrich C7559-5VL
Human bone marrow-derived MSCs Lonza PT-2501 Received with passage 2
MSC maintenance media Lonza PT-3001 10% FBS in basal media supplemented
with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent Life Technologies A11105-01
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500ML
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit R&D systems DY901
HA ELISA kit Echelon Biosciences  K-1200  
PBS Life Technologies 14190-136
Propidium iodide  Life Technologies P1304MP
Syto-13  Life Technologies S7575
QuantiTect reverse transcription kit  Qiagen 205311
SYBR Green PCR master mix Life Technologies 4309155
Replacement speaker DAYTON audio
(via Parts Express)
DS90-8 Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB
Ergo Micro torque screwdriver Mountz # 020377 Torque range: 20-120 cN·m
Stereo speaker selector RadioShack 40-244 Maximum power handling 50 W
Function generator  Agilent  33220A Frequency range 1 µHz-20 MHz
Power amplifier  PYLE audio PylePro PT2400 Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker
channels
Cell culture incubator  Thermo Fisher  Steri-Cult 3307
Syringe pump  New Era Pump Systems NE-300
High voltage power supply Spellman CZE 1000R Output voltage: 0-30 kV
Scanning electron microscope  JEOL-USA JSM-7400F
Desk gold sputter coater Denton Vacuum DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer  Polytec PDV-100 Non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system  Applied Biosystems ABI7300
Multiphoton confocal microscope Zeiss Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer  NanoDrop Products
via Thermo Scientific
ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software Polytec Acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software  OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software  Biogazelle V2.3
Aluminium alloy  McMaster-Carr Alloy 6061
Acrylic blocks McMaster-Carr
Polycarbonate anti-humidity chamber McMaster-Carr Impact-Resistant Polycarbonate
screws  McMaster-Carr
Electronic cable/wire
Medical grade PVC tubing US Plastic Corp. Tygon S-50-HL Clear, biocompatible
10 ml Syringe  Becton Dickinson 309604
21 G Blunt ended needle Small Parts NE-213PL-25 1-1/2" length
Alligator clip adapters  RadioShack 270-354 Fully insulated
8 mm Biopsy punch Sklar Surgical Instruments 96-1152 Sterile, disposable
12 mm Biopsy punch Acuderm (via Fisher Scientific) NC9998681
Tissue culture flasks Corning Cell culture treated

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Titze, I. R. Mechanical-Stress in Phonation. J. Voice. 8, 99-105 (1994).
  2. Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
  3. Gray, S. D. Cellular physiology of the vocal folds. Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).
  4. Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
  5. Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
  6. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  7. Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
  8. Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
  9. Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
  10. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).
  11. Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
  12. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
  13. Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
  14. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
  15. Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
  16. Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
  17. Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
  18. Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. (2011).
  19. Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
  20. Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
  21. Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
  22. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
  23. Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
  24. Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
  25. Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
  26. Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
  27. Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
  28. Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
  29. Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics