Costruzione e caratterizzazione di un Fold bioreattore Novel Vocal

Bioengineering

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Zerdoum, A. B., Tong, Z., Bachman, B., Jia, X. Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor. J. Vis. Exp. (90), e51594, doi:10.3791/51594 (2014).

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Abstract

Introduction

La piega vocale umano, composto da uno strato epiteliale, la lamina propria (LP) e il muscolo vocalis, è un tessuto morbido specializzato che converte il flusso d'aria dai polmoni in onde acustiche per la produzione del suono. 1 corde vocali oscillano regolarmente durante la fonazione normale, esibendo ceppi fino al 30% a frequenze fondamentali che vanno 100-300 Hz. 2 Adult corde vocali LP è una struttura composta da un gradiente superficiale (SLP), intermedio (ILP) e una profondità (DLP) strato. Altri gruppi di classificazione l'epitelio e la SLP come lo strato mucosa, e combina la ILP e DLP nel legamento vocale. 3 Lo strato SLP contiene principalmente una matrice amorfa con fibre di collagene scarsamente disperse, mentre il legamento è arricchita con collagene maturo e fibre di elastina per fornire resistenza sufficiente. 4 La struttura e la meccanica di corde vocali neonato variano significativamente dai loro omologhi maturi. Anche se il meccanismos che regolano lo sviluppo delle corde vocali e la maturazione non sono ancora pienamente compresi, evidenze sperimentali ha sottolineato il ruolo di definizione di stress meccanico vocalizzazione-derivati.

Diverse condizioni mediche, tra cui l'abuso vocale, infezioni, sostanze chimiche irritanti e procedure chirurgiche, possono danneggiare la piega vocale. Patologie delle corde vocali colpiscono circa 3-9% della popolazione degli Stati Uniti. Metodi di trattamento correnti per i disturbi delle corde vocali sono limitati 5 e un tessuto approccio ingegneristico a base di cellule staminali è emerso come una strategia promettente per il ripristino della funzionalità delle corde vocali. Cellule staminali mesenchimali (MSC) sono una valida alternativa alle corde vocali fibroblasti primari per vocale ingegneria tissutale piega. 6-9 specifica destino delle cellule staminali e lo sviluppo del tessuto successivo sono mediati dalla specifica nicchia risiedono in, cui la condizione meccanica è un fattore vitale. dieci forze meccaniche sono regolatori essenziali di tessuto morfogenesi unnd omeostasi, particolarmente per tessuti che siano periodicamente sottoposti a carico. 11 Da una prospettiva ingegneria dei tessuti, è stato dimostrato che l'esposizione a fisiologicamente rilevanti stimolazioni meccaniche promuove differenziazione delle cellule staminali e tessuto-specifico rimodellamento della matrice. 12-15

Bioreattori coltura tissutale sono progettati per simulare l'ambiente fisiologico desiderato per cellula o tessuto crescita in vitro. Per vocale ingegneria dei tessuti piega, è particolarmente critico per ricreare l'ambiente meccanico delle phonating corde vocali. Una piega ideale bioreattore vocale dovrebbe effettivamente fornire spunti vibranti di cellule in coltura, permettendo il controllo facile su frequenza, ampiezza e la durata delle vibrazioni. Titze e collaboratori hanno realizzato una piega bioreattore vocale (T1 bioreattore) 16 che combina tratto statico ad alta frequenza (20-200 Hz) oscillazioni di stimolare la produzione cellulare di proteine ​​della matrice. Using questo bioreattore, Webb e colleghi 17 hanno studiato gli effetti di 10 giorni, vibrazioni 100 Hz su fibroblasti dermici in coltura in un acido ialuronico (HA) a base di idrogel. Costrutti soggetti a vibrazioni esposte un'elevata espressione di HA sintasi-2 (HAS2), decorin, fibromodulin e matrice metalloproteinasi-1 (MMP1), rispetto ai controlli statici. Gli effetti di stimolazione sono risultate essere dipendente dal tempo. Più di recente, il nostro gruppo 18 montato una piega bioreattore vocale (J1 bioreattore) utilizzando un amplificatore di potenza, un generatore di funzioni, un altoparlante chiuso e una membrana in silicone circonferenzialmente ancorato che trasferisce l'aria oscillante per le cellule attaccate. Fibroblasti prepuzio neonatali coltivate nel bioreattore J1 stati sottoposti a 1 ora di vibrazione a 60, 110 o 300 Hz, con un ceppo in piano fino al 0,05%. I risultati qPCR suggerito che l'espressione di alcuni geni ECM è stata moderatamente alterata in risposta alle varie frequenze vibratoriee ampiezze.

Questi disegni bioreattori, mentre intrigante, hanno diverse limitazioni. Ad esempio, il sistema T1 richiede un gran numero di connettori e barre per l'accoppiamento meccanico, limitando le frequenze massima raggiungibile. Inoltre, le cellule possono essere sottoposti a indesiderabile agitazione e fluido meccanica perturbazione che complicano l'interpretazione dei dati. Il bioreattore J1, invece, presenta relativamente bassa efficienza di conversione energetica e non è facile da usare. Inoltre, le vibrazioni si stacca spesso i costrutti cellulari carichi dalla membrana di silicone sottostante. Il J2 vocale piega bioreattore riportato qui, sviluppata sulla base dello stesso principio della versione J1, è ottimizzata per consistenza e riproducibilità. Le vibrazioni-fonazione mimando vengono generati aerodinamicamente in camere dotate di vibrazione individuale, laddove poli fibroso MSC-popolato (ε-caprolattone) (PCL) impalcature sono effectively assicurato. Laser Doppler Vibrometry (LDV) consente all'utente di verificare il profilo vibratorio del gruppo membrana / scaffold. Nella nostra dimostrazione, MSC sono esposti a 200 Hz vibrazioni sinusoidali con (OF) modello 1-hr-1-hr-off per un totale di 12 ore al giorno per 7 giorni. Risposte cellulari agli stimoli vibratori imposte sono indagati sistematicamente. Nel complesso, la piega vocale J2 offre le caratteristiche più user-friendly, che permette studi di coltura cellulare dinamica per essere condotti in un elevato throughput e della moda riproducibile.

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Protocol

Bioreattore Assembly 1. (Video 1)

  1. Effettuare uno stampo di alluminio (pressofusione circolare + perno distanziale) con pre-determinati dimensioni interne ed esterne (Figura 1).
  2. Utilizzando lo stampo dal punto 1.1, fabbricare una membrana di silicone (diametro: 42 mm, spessore: 1,5 mm Figura 1) con un manicotto radicata (diametro: 12 mm, spessore ~ 0,25 millimetri, forma dal perno distanziale in figura 1) mezzo utilizzando un kit disponibile in commercio elastomero siliconico.
  3. Effettuare una coppia di blocchi acrilici (Figura 2 (4, 5)) con un foro circolare (diametro: 24 mm) al centro, incidere la parte superiore (spessore 1,8 centimetri) e inferiore (spessore 0,9 centimetri) blocchi con nervature ei solchi corrispondenti . 10
  4. Panino la membrana di silicone tra i blocchi acrilici associati. Fissare il gruppo con quattro viti d'angolo con un cacciavite coppia di micro impostato su una forza costante (35 cN · m). Come risultato, una tenuta d'acqua, 24 mm di larghezza e 18 mm camera di vibrazione profonda viene creato (Figura 2C).
  5. Montare un "extended range mini-woofer 3 (Figura 2D, 8 Ω/20 W) sotto la camera di vibrazione attraverso un altro set di viti d'angolo sul blocco acrilico fondo. A questo punto, un singolo modulo vibrazione viene assemblato.
  6. Replicare sette moduli aggiuntivi vibrazioni. Applicare quattro di loro in uno dei due bar in alluminio fissi (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), ponendo le basi degli altoparlanti a fori circolari equidistanti (diametro: 7 cm, spessore: 2 cm) tagliate a barre. Stabilizzare ciascun diffusore inserendo una vite attraverso il lato della barra di alluminio in ogni foro circolare.
  7. Controllare singolarmente i diffusori da un selettore speaker. Collegare i singoli diffusori al selettore collegando fili agli ingressi positivo e negativo sul corpo diffusore poi alle uscite corrispondenti sul selettore. Il selettore altoparlante consente al segnale da tegli generatore di funzioni, dopo il passaggio attraverso un amplificatore di potenza, di raggiungere tutti otto altoparlanti contemporaneamente (Figura 2E).
  8. Posizionare i due array da camera, il selettore speaker ed elettronica associati in un recinto anti-umidità. Casa l'intero gruppo in uno spot coltura cellulare incubatore.
  9. Far passare i cavi principali (attraverso un tubo in PVC di grado medicale) che collega l'amplificatore di potenza e selettore diffusore attraverso il gruppo filtro posteriore del termostato.

2. Fabrication Scaffold e Caratterizzazione

  1. Sciogliere pellet PCL in cloroformio ad una concentrazione del 15% in peso. Caricare la soluzione in una siringa da 10 ml con tappo con un ago smussato-ended 21 G.
  2. Bloccare la siringa su una pompa a siringa programmabile e impostare la portata a 1 ml / hr.
  3. Posizionare il collettore foglio di alluminio coperto di fronte l'ago in senso orizzontale, con un ago punta a collettore distanza di ~ 18 cm.
  4. Bloccare il alli positivogator clip per mezzo dell'ago, e il coccodrillo terra al collettore di alluminio, quindi impostare la tensione dell'alimentatore ad alta tensione a 15 kV. ATTENZIONE: alta tensione, mantenere la distanza dal ago.
  5. Sequenzialmente accendere la pompa a siringa e alimentazione; rapidamente pulito / rimuovere la soluzione di polimero residuo circonda la punta dell'ago con un tovagliolo di carta asciutto prima getti fibre stabile e Taylor cono 19 sono formate.
  6. Lasciare le fibre di accumulare sul collettore Al ad uno spessore di 250-300 micron ~ (~ 7 ore sotto le condizioni di filatura correnti). Conservare i ponteggi risultanti in un essiccatore a vuoto per 1-2 giorni per rimuovere qualsiasi solvente residuo.
  7. Immagine i ponteggi, farfugliare ricoperti di oro, utilizzando un microscopio elettronico a scansione per mostrare fibra morfologia coerente. 10

3. Assemblea bioreattore e Caratterizzazione

  1. Punch un disco cilindrica (diametro 8 mm), con quattro braccia (lunghezza: 2mm) dal tappeto come filato PCL (Figura 2A), utilizzando dapprima a 12 mm di diametro biopsia per tagliare il diametro esterno del disco. Quindi utilizzare un secondo, 8 millimetri biopsia per fare quattro due millimetri lunghi tacche equidistanti attorno alla lama circolare per segnare dove le braccia sono da tagliare. Dopo aver eseguito con il punzone 8 mm utilizzare una lama di bisturi per tagliare i bordi delle braccia verso l'esterno. Inserire il scaffold nella scanalatura della membrana di silicone con le braccia tese (Video 1). Appiattire l'impalcatura inserita premendo delicatamente la superficie con una pinzetta piatta.
  2. Collegare un piccolo pezzo di sottile foglio di alluminio (8 mm x 2 mm forma ortogonale, Figura 2B) al patibolo PCL per aiutare la riflessione laser.
  3. Fissare il silicone membrana / scaffold PCL assemblato (come specificato nel punto 1.4), nella camera di vibrazione. Aggiungere 1,5 ml di acqua nella camera per idratare il scaffold PCL prima vibrazione.
  4. Utilizzando il generatore di funzioni, introdurre segno vibrazioniALS (ad esempio, 200 Hz onde sinusoidali con una tensione picco-picco, Vpp, di 0,1 V) alla camera acrilico sandwich. Utilizzare un voltmetro per misurare con precisione la tensione in ogni ingresso diffusore. Nota: la lettura Vpp dal generatore di funzione diverso dal l'eventuale tensione erogata all'altoparlante.
  5. Montare l'unico punto LDV e fissare il sensore laser testa in fibra ottica a un treppiede testa pan-tilt. Angle la testa del sensore in modo che sia rivolta perpendicolare al tavolo. Collegare la testa del sensore LDV al modulo di acquisizione dati via cavo coassiale quindi il modulo al portatile tramite USB.
  6. Focalizzare il fascio laser perpendicolarmente in vari punti predeterminati sulla membrana di silicone (Figura 2B e Figura 3).
  7. Utilizzando il software di acquisizione dati, registrare lo spostamento intermedio membrana. Fare clic su "Impostazioni di acquisizione" dal menu "Opzioni"; quindi cambiare la modalità di misura a "FFT221;. Quindi, fare clic su "Misura continua" nella barra degli strumenti principale quindi il picco che si forma alla frequenza prescelta (Figura 6D) per registrare lo spostamento.
  8. Graficamente lo spostamento intermedio membrana normale (w 0) in funzione della posizione relativa sul substrato. Costruire una mappa di colori 3D del profilo di vibratorio superficie con Origin software di analisi dei dati 8.5.

4. Cell Culture vibrante

  1. MSC derivate dal midollo osseo sub-cultura umana nei T150 fiasche di coltura tissutale ad una densità di semina iniziale di 4000-5000 cellule / cm 2 in MSC manutenzione media.
  2. Dopo 7-8 giorni di coltura cellulare (a ~ 85% di confluenza), trypsinize le cellule con un reagente di dissociazione cellulare come accutase, contare con un emocitometro, centrifuga (440 xg per 5 min), e risospendere il pellet cellulare in mezzi freschi manutenzione MSC ad una concentrazione di 4,5 x 10 6 cellule / ml.
  3. Immergere la scaffo PCLld in etanolo al 70% O / N. Dopo che il solvente viene evaporato, esporre entrambi i lati del ponteggio per germicida luce UV (254 nm) per 5-8 min.
  4. Bagnare il scaffold PCL in una soluzione fibronectina 20 ug / ml a 37 ° C per 1 ora. Inserire il scaffold fibronectina rivestite nella membrana di silicone. Montare il bioreattore come descritto al punto 1.
  5. Distribuire 40 ml di sospensione cellulare uniformemente sulla forca PCL protetto. Permettono alle cellule di attaccarsi per 1-1,5 ore prima di aggiungere un ulteriore 1,5 ml di mezzi freschi alla camera vibrazioni.
  6. Cultura patibolo PCL MSC-carico statico per 3 giorni e aggiornare il supporto dopo il completamento della cultura statica.
  7. Imporre regimi di vibrazione selezionati i costrutti cellulari. Nota: Per esempio, le cellule vengono sottoposte ad un 1-hr-1-hr-off (OF) vibrazioni a 200 Hz con aw di 0 ~ 40 pm per 12 ore al giorno per 7 giorni. Costruisce sottoposti a stimoli vibratori sono designati come campioni Vib e quelli culrosso staticamente in camere vibrazioni identiche servono controlli statici (Stat).

5. Valutazioni Biologiche

  1. Raccogliere 200 microlitri di cellule di coltura da ciascuna camera ogni altro giorno (giorno 1, 3, 5 e 7) e unire le aliquote dello stesso campione insieme (800 ml ciascuna).
  2. Quantificare la produzione cellulare di matrice metalloproteinasi-1 (MMP1) e HA utilizzando un kit ELISA MMP1 Sviluppo e acido ialuronico kit ELISA competitivo, rispettivamente seguente procedura dei costruttori. Nel frattempo, saggiare la produzione di precursore solubile elastina seguendo la procedura ELISA precedentemente riportato. 8
  3. Al termine dell'ultimo ciclo di vibrazione al giorno 7, rimuovere rapidamente i costrutti cellulari dalle camere vibrazione usando pinzette taglienti e brevemente sciacquare con fosfato freddo salina tamponata (PBS, 4 ° C).
  4. Per il live colorazione / morto, incubare i costrutti con ioduro di propidio (1:2.000 in PBS) eSyto-13 (1:1000 in PBS) per 5 minuti a temperatura ambiente. Immagine costrutti colorati con un microscopio confocale multiphoton.
  5. Separatamente, snap-congelare i costrutti cellulari PBS-sciacquati in ghiaccio secco ed estrarre l'RNA cellulare totale seguendo un protocollo riportato in precedenza per l'analisi del gene. 9
  6. Verificare la quantità e la qualità del RNA estratto utilizzando un UV-Vis. Campioni di RNA con A260/A280 e A260/A230 rapporti di 1,8-2,2 sono utilizzati per la successiva analisi qPCR.
  7. Reverse trascrivere RNA (500 ng / campione) in cDNA usando un kit disponibile in commercio trascrizione inversa.
  8. Eseguire la reazione di PCR su un sistema di rilevamento di sequenze in tempo reale usando una miscela master PCR disponibile in commercio seguendo la procedura precedentemente descritto. 8
  9. Analizzare i risultati qPCR utilizzando software commerciale di analisi dei dati qPCR. Per garantire l'affidabilità delle analisi dei dati, più geni di riferimento (YWHAZ, TBP, PPIA) sono impiegati come intcontrolli ernal, e la varianza dei rendimenti specifici di primer viene presa in considerazione. 8

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Representative Results

Le impalcature PCL fabbricati da elettrofilatura contengono pori interstiziali dimensioni micron e fibre aggrovigliate in modo casuale, con un diametro medio di 4,7 micron (Figura 4A). Con un ingrandimento maggiore, scanalature e nanoscala pori sono visibili su singole fibre (Figura 4B). Rivestimento dei ponteggi con fibronectina migliora idrofilia e facilita l'adesione iniziale delle cellule / diffusione sul patibolo PCL (osservazione inedito).

Forme d'onda sinusoidali con frequenza desiderata (f, 100-300 Hz) e tensione (Vpp: 0-,125 V) vengono introdotti al diffusore sotto ogni camera di vibrazione, e l'aria confinata tra la parte inferiore della membrana di silicone e il cono di carta di un mini-woofer è guidato in oscillazione. L'oscillazione aria viene consegnato al ponteggio PCL con o senza cellule. LDV viene utilizzato per analizzare le caratteristiche di vibrazione del ponteggio in un dato f e Vpp,tenendo in considerazione l'indice di rifrazione di acqua (1.33). 20 La Figura 5 mostra lo spostamento normale (w 0) al centro dello scaffold PCL in funzione della Vpp f. Le frequenze di vibrazione sono scelti per riflettere frequenze fondamentali lingua umani. 21 Esiste una relazione lineare tra 0 e w Vpp nell'intervallo 0-,125 V per tutte le frequenze testate. Ad un dato Vpp, w 0 diminuisce con F aumenta da 100 a 300 Hz.

Una condizione specifica vibrazione (f = 200 Hz, Vpp = 0.1 V) è selezionato per ulteriori analisi. Il profilo di velocità in funzione del tempo (Figura 6A) mostra che il segnale sinusoidale introdotto all'altoparlante viene catturato dal scaffold PCL con alta fedeltà. Il centro dello scaffold PCL oscilla longitudinalmente con un picco di velocità 52 mm / sec, un'accelerazione massima di 66 m / sec 2 (~ 6.7g) e unnormale spostamento di ~ 40 micron. I segnali armonici a 100, 300, 400 e 500 Hz sono almeno un ordine di grandezza inferiori a quelli alla frequenza fondamentale (200 Hz). Tuttavia, se il valore Vpp è troppo elevata (0,15 V), picchi multipli armoniche di intensità paragonabile alla frequenza fondamentale vengono rilevati (Figura 7). Il profilo vibrazioni attraverso l'impalcatura viene creata monitorando lo spostamento normale da un totale di 73 punti rappresentativi circa le direzioni radiali della superficie PCL (Figura 3). La mappa di colori 3D (Figura 8) dimostra che la vibrazione rilevata sulla superficie della membrana è assialsimmetrici rispetto al centro e le sue posizioni di riposo. Lo spostamento normale è risultato diminuire monotonicamente dal centro verso il bordo dove la membrana è fissata.

MSC coltivate su scaffold PCL sono coltivate in condizioni di vibrazione selezionate. Cellule sottoposte a un 7-DAY di stimolazione mantenere la vitalità e proliferazione analoghe proprietà come controlli statici (Figura 9), confermando che i ponteggi fibrosi erano cytocompatible e la vibrazione applicata comportato alcuna perdita di vitalità. Risposte cellulari a stimoli vibratori vengono esaminati i livelli di mRNA in termini di espressione di proteine ​​piega ECM vocali essenziali, come l'elastina (ELN), acido ialuronico sintasi-1 (HAS1), COL3A1 e MMP1 (Figura 10). Il DI vibrazione porta ad un aumento 2,3 volte nell'espressione ELN al giorno 7, relativa ai controlli statici. Le stimolazioni vibratorie anche aumentato espressione di COL3A1 moderatamente. È interessante notare che l'espressione di enzimi principali ECM rimodellamento, HAS1 e MMP1, è notevolmente aumentata dai segnali di vibrazione. In particolare, il trattamento dinamico comportato un aumento di di ~ 1.7 e ~ 16.3 per HAS1 e MMP1 espressione (entrambi p <0,05), rispettivamente, sui loro controlli statici al giorno 7. Complessivamente, l'effetto induttivo delle vibrazioni sul HAS1 e MMP1 è stato migliorato dal giorno 3 al giorno 7.

Per confermare ulteriormente i risultati qPCR, la produzione cellulare di HA, elastina solubili e MMP1 è quantificata mediante ELISA a livello traduzionale (Figura 11). Le cellule coltivate in modo dinamico producono 4.2 ± 0.1 mg / mg (per peso secco scaffold) elastina solubile dopo 7 giorni di vibrazioni, mentre i controlli statici accumulano solo il 2,7 ± 0,2 mcg / mg) elastina. In media, 7 giorni di vibrazioni risultato in 2.2 e l'aumento di 4,7 volte in HA e la secrezione di MMP1, rispetto ai corrispondenti controlli statici.

Video 1: Una simulazione 3D che mostra l'assemblaggio di un bioreattore J2. Il video è stato creato da Autodesk 3ds Max Design (Cortesia di Congfei Xie).

"Fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 1
. Figura 1 illustra fotografare la dimensione dello stampo Al utilizzata per la fabbricazione della membrana di silicone con guaina radicata Ø:. Diametro, d: spessore / profondità, h:. Altezza cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
.. Figura 2 Diagramma di flusso che mostra il gruppo bioreattore (a) una fotografia di un quattro bracci a forma scaffold PCL; (B) Una fotografia che mostra il scaffold PCL fissato nella camera di vibrazione e il vibrometro laser focalizzato sul fondo della camera; ( C) Una sezione trasversalevista al di sezione vibrazione. 1: scaffold PCL (rosso); 2: membrana di silicone (ciano); 3: Al bar stazionario; 4: blocco acrilico superiore; 5: blocco acrilico fondo; 6: mini-woofer, (D) vista laterale del modulo vibrazioni; (E) Una fotografia che mostra l'intero gruppo. Questa cifra è stata modificata da Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Illustrazione di membrana di silicone radialmente segnato un singolo punto di misure LDV. Questa cifra è stata modificata da Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.


Figura 4. Immagini SEM di scaffold PCL in diversi ingrandimenti. (A) 600X, (B) 7.000 X. Questa cifra è stata modificata da Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Lo spostamento normale al centro della membrana di silicone (w 0) in funzione della frequenza applicata (100, 200 e 300 Hz) e la tensione di azionamento (Vpp = 0-,125 V). Questa figura è stata modificata da Tong et al. 10 Copyright 2013, Ma ry Ann Liebert, Inc.

Figura 6
Figura 6. Caratteristiche vibrazioni rilevate al centro della membrana di silicone con f = 200 Hz e un profilo Vpp = 0,1 V. (A) velocità in funzione del tempo. (B) Profilo di velocità in funzione della frequenza. (C) accelerazione in funzione della frequenza. (D) spostamento normale (w 0) in funzione della frequenza. Questa cifra è stata modificata da Tong et al. 10. Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 7. Spostamento normale rilevata al centro della membrana (w 0) in funzione della frequenza quando un'onda sinusoidale di 200 Hz viene introdotto il mini-woofer a Vpp = 0,15 V.

Figura 8
Figura 8. Colormap 3D costruito da gridding superficie utilizzando i dati normali spostamento raccolti da tutte le località segnato sul patibolo PCL. Questa cifra è stata modificata da Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

Figura 9
Figura 9. Vitalità cellulare, visualizzato da live colorazione / morto, dopo 7 giorni di vibrazioni. Questa cifra è stata modificata da Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 10
Figura 10. Risposte cellulari agli stimoli vibratori in termini di espressione delle corde vocali rilevante, geni ECM. L'espressione del gene relativo (fold change) è normalizzata ai rispettivi controlli statici al giorno 3 e il giorno 7 (baseline tratteggiata). **: Differenza significativa (p <0,05) tra il giorno 3 e 7, #: cambiato significativamente (p <0,05) rispetto alla linea di base. I dati rappresentano media ± errore standard della media (SEM, n = 4). T-test di Student a due code viene utilizzato per l'analisi statistica, con p <0,05, considerato come significativo difference (stessi sotto). Questa cifra è stata modificata da Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

Figura 11
Figura 11. Quantificazione biochimica di HA (A), solubile ELN (B) e MMP1 (C) prodotto da MSC coltivate sul patibolo PCL sotto Stat e Vib condizioni per 7 giorni. Quantità totale di molecole di ECM per peso secco scaffold (mg) è rappresentato come media ± SEM, n = 4 dal processo rappresentativo #:. significativamente maggiore (p <0.05) rispetto ai controlli Stat. Questa cifra è stata modificata da Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

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Discussion

Ingegneria di successo di tessuti funzionali delle corde vocali in vitro richiede la ricreazione di una piega simile microambiente vocale per mediare i comportamenti di cellule multipotenti. E 'generalmente accettato che le strutture dei tessuti o organi riflettono le funzioni che sono chiamati a svolgere. 22 Per i tessuti delle corde vocali, le vibrazioni ad alta frequenza che si verificano durante la fonazione sono proposti per essere importante per la maturazione del tessuto. Nel nostro studio, ponteggi PCL sono utilizzati per fornire un supporto strutturale legamento mentre la piega bioreattore vocale è progettato per introdurre segnali meccanici fisiologicamente rilevanti ai MSC coltivate. Il bioreattore descritto qui (J2) crea la vibrazione elettromagnetico attraverso i singoli altoparlanti e trasferisce la aerodinamicamente energia alle cellule in coltura. Rispetto al nostro disegno precedente, 18 il sistema attuale sposta la sorgente di stimolazione vibrazionale direttamente sotto ciascun campione, permettendo fora conversione energetica più efficiente. Come risultato, una significativamente più grande spostamento normale e un'accelerazione maggiore si ottengono utilizzando il sistema attuale. Il design modulare minimizza anche le variazioni di sistema e le perturbazioni meccaniche tra le varie camere di vibrazione.

Il nostro design si basa su una membrana di silicone per fornire i segnali di vibrazione. È quindi importante mantenere l'integrità della membrana e omogeneità. Dopo che la soluzione precursore viene colato nello stampo di alluminio, è desiderabile rimuovere il liquido in eccesso trascinando un vetrino su tutta la superficie dello stampo. Membrane coerente, senza bolle d'aria intrappolate possono essere prodotte abbassando curare temperatura, aumentando il tempo di indurimento. Inoltre, una soluzione di etanolo al 70% può essere utilizzato per gonfiare temporaneamente la membrana all'interfaccia alluminio per permettere una facile rimozione del silicone polimerizzato. Per accogliere i costrutti cellulari per cultura dinamica in 3D, un solco sottile in posizione centrale is modellato nella membrana di silicone, in modo che i ponteggi PCL possono essere perifericamente ancorati nella camera di vibrazione. La geometria della scanalatura è regolabile; così la forma del costrutto cellulare può essere regolato di conseguenza per imitare meglio la geometria di corde vocali nativi. 23 Se il scaffold PCL non sia saldamente fissato nella membrana di silicone, i segnali rilevati LDV al PCL e nella regione esterna sul silicone membrana non si sovrappongono perfettamente. Nel montaggio del bioreattore, è fondamentale che tutti i componenti siano fissati e serrati nella stessa misura in modo da evitare movimenti indesiderati e minimizzare camera a variazioni da camera.

Per convalidare l'utilità del bioreattore, MSC sono coltivate su scaffold PCL e sono sottoposti a intermittente (OF) vibrazioni per 7 giorni. L'delle vibrazioni per un periodo di diverse ore al giorno sono impiegati per riprodurre le condizioni di lingua di utenti vocali pesanti, ad esempio, professionale cantare tori e insegnanti. differenza di 23 precedentemente segnalati bioreattori corde vocali, la nostra non causano alcun effetto negativo o trauma fisiologico alle cellule.

Le vibrazioni a 200 Hz si trovano a regolare in modo differenziato la produzione cellulare di importanti componenti della MEC. Elastina è una proteina strutturale fondamentale che si trova in tutta la piega LP vocale, e conferisce resistenza ed elasticità. 24 componenti amorfi interstiziali, come HA, contribuiscono al mantenimento di una corretta viscoelasticità tessuto e la prevenzione della formazione di cicatrici. 25,26 MSC sottoposti ai 7 giorni di trattamento produrre una quantità significativamente maggiore di elastina che le controparti staticamente in coltura. HA biosintesi è anche sensibile alle vibrazioni, come confermato dai risultati di qPCR su HAS1 e ELISA risultati in HA. Questi risultati suggeriscono che la stimolazione vibrazionale abilitato dal bioreattore favorisce la produzione di molecole anti-cicatrici.

jove_content "> Balanced fatturato ECM basa sulla deposizione di matrice concorrente e degradazione. 27 Tipo III collagene è la principale fibra collagene reticolare trovato corde vocali, fornendo il tessuto con caratteristiche di portata. 28 Le vibrazioni 7 giorni applicate Copyright migliorare l'espressione genica di COL3A1, ma ad una grandezza molto inferiore a quella di elastina. Pertanto, le vibrazioni applicate differenzialmente regolano macchinario cellulare coinvolto nella sintesi di collagene III ed elastina. interessante MMP1, uno dei principali MMPs coinvolte nella degradazione della matrice e rimodellamento tissutale 27 , è altamente sensibile ai segnali vibratori. Questi risultati concordano bene con le precedenti relazioni sulle vibrazioni indotte MMP1 upregulation da parte delle cellule intrappolate in una matrice HA 29. Complessivamente, gli stimoli vibratori generati dalla piega bioreattore vocale profondamente mediano funzioni MSC promuovendo l'omeostasi di vocali matrici fold-simili.

Oltretutto, il romanzo piega bioreattore vocale qui presentato è modulare e user-friendly, che permette di coltura cellulare dinamica deve essere eseguita in modo riproducibile. Tuttavia, esistono diverse limitazioni nel disegno corrente. In primo luogo, l'ampiezza della vibrazione, benché migliorata dalla versione J1, è ancora piccolo rispetto al tessuto delle corde vocali. Secondo, il nostro bioreattore non simula la collisione bilaterale di corde vocali durante la fonazione normale. In terzo luogo, il nostro fibroso PCL patibolo non riflette l'anisotropia del tessuto. Il lavoro futuro è dedicata a migliorare il disegno per simulare meglio le condizioni di fonazione nativi. Nel frattempo, saranno esplorati i regimi ottimali per la coltura dinamica in 3D per il montaggio piega successo funzionale vocale in vitro.

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Disclosures

Non esistono interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Jeffrey Caplan per la sua formazione e consulenza su confocale. Ringraziamo anche il Keck Electron Microscopy Lab e il Dr. Chaoying Ni per l'assistenza SEM. Questo lavoro è finanziato dal National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 e R01DC011377). ABZ riconosce NSF Integrativa Graduate Education & Research tirocinio programma (IGERT) per il finanziamento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Sylgard 184 Cure the membrane at 100 °C for 2 hr
PCL Sigma Aldrich 440744-500G Mn ~80 kDa, dissolve O/N
Chloroform Sigma Aldrich C7559-5VL
Human bone marrow-derived MSCs Lonza PT-2501 Received with passage 2
MSC maintenance media Lonza PT-3001 10% FBS in basal media supplemented
with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent Life Technologies A11105-01
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500ML
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit R&D systems DY901
HA ELISA kit Echelon Biosciences  K-1200  
PBS Life Technologies 14190-136
Propidium iodide  Life Technologies P1304MP
Syto-13  Life Technologies S7575
QuantiTect reverse transcription kit  Qiagen 205311
SYBR Green PCR master mix Life Technologies 4309155
Replacement speaker DAYTON audio
(via Parts Express)
DS90-8 Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB
Ergo Micro torque screwdriver Mountz # 020377 Torque range: 20-120 cN·m
Stereo speaker selector RadioShack 40-244 Maximum power handling 50 W
Function generator  Agilent  33220A Frequency range 1 µHz-20 MHz
Power amplifier  PYLE audio PylePro PT2400 Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker
channels
Cell culture incubator  Thermo Fisher  Steri-Cult 3307
Syringe pump  New Era Pump Systems NE-300
High voltage power supply Spellman CZE 1000R Output voltage: 0-30 kV
Scanning electron microscope  JEOL-USA JSM-7400F
Desk gold sputter coater Denton Vacuum DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer  Polytec PDV-100 Non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system  Applied Biosystems ABI7300
Multiphoton confocal microscope Zeiss Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer  NanoDrop Products
via Thermo Scientific
ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software Polytec Acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software  OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software  Biogazelle V2.3
Aluminium alloy  McMaster-Carr Alloy 6061
Acrylic blocks McMaster-Carr
Polycarbonate anti-humidity chamber McMaster-Carr Impact-Resistant Polycarbonate
screws  McMaster-Carr
Electronic cable/wire
Medical grade PVC tubing US Plastic Corp. Tygon S-50-HL Clear, biocompatible
10 ml Syringe  Becton Dickinson 309604
21 G Blunt ended needle Small Parts NE-213PL-25 1-1/2" length
Alligator clip adapters  RadioShack 270-354 Fully insulated
8 mm Biopsy punch Sklar Surgical Instruments 96-1152 Sterile, disposable
12 mm Biopsy punch Acuderm (via Fisher Scientific) NC9998681
Tissue culture flasks Corning Cell culture treated

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References

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