Dissektion og Downstream Analyse af Zebra Finch Embryoner på tidlige stadier af udvikling

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Murray, J. R., Stanciauskas, M. E., Aralere, T. S., Saha, M. S. Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development. J. Vis. Exp. (88), e51596, doi:10.3791/51596 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den zebra finke (Taeniopygia guttata) er blevet en stadig vigtigere model organisme i mange forskningsområder, herunder toksikologi 1, 2, adfærd 3 og hukommelse og indlæring 4,5,6. Som den eneste sangfugl med et genom, zebraen finke har et stort potentiale til brug i udviklingsmæssige undersøgelser; Men de tidlige stadier af zebra finke udvikling er ikke blevet godt undersøgt. Manglende forskning i zebra finke udvikling kan henføres til vanskeligheden ved at dissekere den lille æg og foster. Den følgende dissektion metode minimerer embryonale vævsskader, som giver mulighed for undersøgelse af morfologi og genekspression på alle stadier af fosterudviklingen. Dette tillader både lyse felt og fluorescens kvalitet billeddannelse af embryoner, anvendes i molekylær procedurer såsom in situ hybridisering (ISH), celleproliferationsassays, og RNA ekstraktion for kvantitative assays, såsom kvantitativ real-time PCR (qtRT-PCR). Denne teknik gør det muligt for efterforskerne at studere tidlige stadier af udvikling, der tidligere var vanskeligt at få adgang.

Introduction

Det overordnede mål med denne teknik er at få zebra finke (Taeniopygia guttata) embryoner fra de tidligste stadier af embryogenese til brug i en bred vifte af udviklingsmæssige undersøgelser. Zebra finke er blevet den fremherskende sangfugl model organisme og er blevet brugt i udstrakt grad i en række forskellige områder, herunder toksikologi 1,2, adfærd 3, hukommelse og indlæring 4,5,6 sammenlignende neuroanatomi 7,8 og sproglig udvikling 9,10 . Som den eneste sangfugl med et genom, zebraen finke tillader molekylær og genetisk undersøgelse af Passeriformes rækkefølge, som udgør over 50% af de kendte fuglearter 11, 12,13.

Trods brug af voksne og unge zebra finke i en bred vifte af områder, har kun få undersøgelser er blevet udført på zebra finke embryoner, især i de tidlige stadier af udvikling. Dette kan henføres til den lille størrelse af deres æg ennd embryoner, og deres nyere status som en model organisme 14,15,16 for undersøgelser, hvor kyllingen (Gallus gallus domesticus), der tidligere blev brugt som en fremherskende model-system 17,18,19,20,21. Men som ikke-vokale elever, kyllinger er ikke en passende model for at studere det genetiske grundlag for vokal læring, udvikling af vokal læring, arvelighed, adfærd og kortikale-basalganglierne kredsløb involveret i motorisk læring 10..

Det er vigtigt at bemærke, at zebra finke embryoner er langt mere delikat og lettere beskadiget end kyllingeembryoer under dissektion og molekylære procedurer. Især er større omhu, der kræves, når der udføres permeabilisering trin på zebra finke embryoner. Stærke rengøringsmidler og enzymer, som ikke ville skade en kyllingeembryo kan skade zebra finke embryoner. Med hensyn til pleje, er det nødvendigt at sætte zebra finke æg i små kopper før placering i en inkubatorat forhindre dem i at bryde, når rullende under inkubation.

Zebra finke er modtagelig for adfærdsmæssige undersøgelser, nemt og frodigst avle året rundt i fangenskab, og er vokal lærende. Disse egenskaber tillader brug af zebra finke at imødekomme behovet for en model organisme, der integrerer udvikling, genetik og adfærdsmæssige aspekter af sproget. De dissektioner metoder er nærmere beskrevet nedenfor, kombineret med et nyudviklet iscenesættelse guide specifikt til zebra finke 22, gør zebra finke en stadig nyttigt standardiseret udviklingsmæssige model organisme. Dog kan opnå embryoner i de tidlige stadier være skræmmende. Protokollen giver efterforskerne at nemt få embryoer tidligt. Studier, der undersøger den tidlige udvikling og den molekylære udviklingsmæssige basis af komplekse adfærd i zebra finke, eller de toksikologiske virkninger på udviklingen i andre lille, vil spurvefugle finde denne dissektion metode nyttig.

Protocol

Etik Statement: De metoder blev udført med tamme zebrafinker fra ynglekoloni på College of William and Mary. Alle procedurer følges RSPCA retningslinjer 23 og blev godkendt af College of William og Marys OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Dyrevelfærd Assurance (# A3713-01) og havde Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) godkendelse (# 2013-06 -02-8721-dacris).

1.. Egg Indsamling og Inkubation

  1. Etablere zebra finke parvis på en 14:10 lys: mørke cyklus. Fødevareforsyning, vand, hø, og en redekasse ad libitum. Bemærk: Regelmæssig vedligeholdelse og avl for zebrafinker er blevet godt beskrevet 23.
  2. Forbered en standard chick inkubator med vippe hylder. Bemærk: Oprethold kunstig inkubator ved 37,5 (+ / - 1) ° C og 80 - 95% fugtighed ved tilsætning af vand til bunden af ​​inkubatoren på daglig basis. Tillad inkubatoren at ækvilibrere i to dagefør brug.
    1. Vælge små foder kopper (5 x 7,6 cm) på mindst 2,5 cm dybe til at holde æg i inkubatoren. Line bunden og nedre kanter af kop med to lag køkkenrulle, således at koppen er polstret, mens det stadig tillader æggene nemt rulle. Placer disse kopper på tiltbevægelse hylderne i inkubatoren. Note: Alt for meget polstring kan hæmme rullende, som vil forhindre en vellykket inkubation grund embryonale vedhæftning til skallen interiør.
  3. Indsamle æg til to timer efter indtræden af ​​lyscyklussen. Bemærk: Dette minimerer afvigelser i udviklingsstadiet for en given inkubationstid på grund af forældrenes inkubation.
    1. Saml æg forsigtigt med tommel-og pegefinger på spidsen og base langs længden af ​​ægget. Brug en kedelig, blød 4B grafit blyant til at mærke lagt dato og tid indsamlet fra reden. Bemærk: Den blødere 4B blyant reducerer risikoen for blyanten bryde den skrøbelige æggeskal.
    2. 1.3.2) Placer 1 - 5 mærkede æg i hver cop i inkubatoren, så æg frit kan rulle for at forhindre embryonale vedhæftning til det indre af skallen. Bemærk: at lægge mere end 5 æg i en kop kan forhindre rulning af de enkelte æg og nedsætte levedygtigheden af ​​embryoner.

2.. Fjernelse af Embryo fra Egg

  1. For at forberede dissektion, samle de følgende materialer: en ren skalpel fine tippet pincet og to ekstra fine tippet pincet. Placer 10 x 10 cm vejer papir på bunden af ​​dissekere omfang at give en ren, ikke-absorberende overflade til dissektion. Bemærk: Den vejer papir er afgørende, fordi det giver mulighed for let manipulation af æggeblomme og er den bedste overflade til at skære de sarte membraner med en skalpel.
  2. Klargør en prøve af phosphatpuffersaltopløsning (1X PBS) i et 50 ml polypropylenrør og erhverve mindst tre overførselspipetter og en lille affaldsspand. Hvis fastsættelse af embryoner, forberede en portion af 4% paraformaldehyd (PFA) Forsigtig:. PFA dampe er giftige, end alle trin, der involverer PFA bør ske inde i en emhætte for at minimere eksponering. Hvis flash frysning af embryoner opnå flydende nitrogen og holde det tæt på dissekere omfang. Sterilitet er ikke et problem for denne dissektion protokollen, men sikre, at alle materialer er rene.
  3. Fjern æg fra inkubatoren ved tidspunkt behov for den ønskede fase som beskrevet i zebra finke mellemstation guide 22. Bemærk: Fjern æg efter 36 timers inkubation at dissekere fase 6 embryoner (figur 4A) 22 og fjerne æg efter 56 timers inkubation at dissekere fase 12 embryoner (figur 3A) 22.
  4. Ved hjælp af en fiberoptisk illuminator lampe, stearinlys ægget ved at holde den langs dens lodrette akse og glans lys gennem ægget til at belyse det indre. Placér spidsen af ​​lyset bag æg og find æggeblomme og embryo under udvikling.
    1. Placer skalpel på den modsatte side af blomme og skæres langs ægget fra spids tilbase med svag tryk.
  5. Fjern indholdet af ægget ved forsigtigt at lægge pres på spidsen og bunden af ​​ægget med tommel-og pegefinger, eller ved forsigtigt nysgerrige hinanden æggeskallen sammen snittet med en pincet. Åbn ægget direkte over vejer papiret, så blommen forsigtigt ruller ud.
  6. Undersøg blommen for den hvide zone af krydset, som ses som en svag hvid ring omkranser embryonale udvikling og orientere blommen hjælp ekstra fin spids pincet, så fosteret er placeret i midten.
    Bemærk: Hvis en svag hvid cirkel på overfladen af ​​blommen ikke overholdes, tage fin pincet og forsigtigt rulle blommen over, indtil fosteret er på toppen af ​​blommen. Bemærk: trin 1 - 9 22 embryonale disk er mindre end 6 mm i diameter og er synlig som et svagt, svagt uigennemsigtig skive på overfladen af blommen - se figur 1 for reference. For trin 10 og ældre 22, blod pools tillade forbedret visibility af embryonet, men sørge for at undgå at punktere blommesækken, da dette gør lokalisering embryoet vanskelig.

3.. Adskillelse af Embryo fra Ekstra fostervæv

  1. Punktere kanterne af blommen at aflaste trykket (figur 1B), og foretage en enkelt går på tværs af længden af blommen diameter langs embryonale disken. Gentag gøre disse diagonale linjer, indtil den del af blommen indeholdende foster er blevet skilt (fig. 1B). Bemærk: Dette trin tillader blommen massen at forblive intakt, men reduceret tryk på overfladen af ​​blommen giver mulighed for mere præcist, hvornår skærer omkring embryonet, forebygge skader embryonale strukturer.
  2. Fjern kanterne af æggeblomme med en overførsel pipette. Bemærk: Fjern så meget æggeblomme som muligt, men efterlade en lille mængde, så kimen ikke overholder den tørre overflade vejer papir og ælde.
  3. Vask embryonale disken ved dispensning 1X PBS ved en vinkel på 45 ° mod bunden af ​​embryoet. Placér spidsen af ​​overførselspipetten siden-ikke over-embryonale disk. Hvis ekstra æggeblomme skal fjernes, adskille en eventuel æggeblomme med skalpel på veje papiret, før du overfører embryonet til petriskålen. Bemærk: Denne metode fjerner embryonet fra overfladen af ​​indvejningen papir.
  4. Overfør foster ved hjælp af en overførselspipette sammen med et minimalt volumen af ​​1X PBS til en lille plastik petriskål. Vask embryonet ved at tilsætte mere 1X PBS i petriskålen og dryp 1X PBS nær, men ikke direkte på embryonet. Swirl petriskålen at vaske og fjerne resterende æggeblomme, vippe petriskål og fjerne affald 1X PBS med overførselspipetten.
    BEMÆRK: Når 1X PBS fjernes embryonet typisk ikke klæbe til bunden af ​​petriskålen, fordi plast er glat med resterende 1X PBS. Der kan imidlertid 1X PBS tilsættes, hvis fosteret klæber til skålen.
    Hvis fastsættelse than embryo Følg trin 3.5 og 3.6. Hvis flash frysning embryonet, gå til trin 3.8 med det samme.
  5. Hvis fastsættelse af embryo til in situ hybridisering, straks tilføje 4% PFA til petriskålen at oversvømme embryoet. Dryp 4% PFA direkte på toppen af ​​foster for at glatte det; dette forhindrer embryo fra curling. Fastgør foster i 4% PFA ved 4 ° C i 12 timer.
    1. Efter fiksering, dehydrere embryoner i gradueret methanol (MeOH) løsninger og opbevares ved -20 ° C i 100% MeOH.
  6. Hvis fosteret er mellem trin 1 - 8 22, fjerne vitellinmembranen levet op til embryoet. Bemærk: Dette trin kan udføres under eller efter fiksering. Embryoner yngre end trin 8 22 ikke let visualiseres, fordi de overholder vitellinmembranen, tilslører vigtige strukturer, som det ses i figur 2A.
    1. Tag fat i kanten af ​​membranen, der strækker sig ud over den zone af krydset med ekstra fine pincet. Carefully flip embryo over flere gange for at vaske væk resterende æggeblomme granulat og at løsne vedhæftning af embryonale disk til vitellinmembranen. Bemærk: Rør ikke ved midten af ​​embryonet, da det vil beskadige embryonale strukturer.
    2. Hvis et hul ikke vises mellem zone krydset og vitellinmembranen forsigtigt ridse zone af krydset med ekstra fin spids pincet til at løsne det fra vitellinmembranen. Grip vitellinmembranen med ekstra fin spids pincet og træk det forsigtigt væk fra embryoet. Hvis det er nødvendigt, træk forsigtigt embryo væk fra vitellinmembranen ved at gribe den perifere kant af den embryonale disken på den zone af krydset.
    3. Kassér vitellinmembranen i biohazard 1 affald (biosikkerhed niveau 1) efter fjernelse.
  7. Ved udførelse af en ISH assay på unge fosterstadiet, skal du følge standard hele mount ISH-protokoller for kyllingeembryoer 24, 25, men overveje følgende forslag. For at mindske skader på fostre under ISH procedure, bruge en enkelt 5 ml hætteglas med skruelåg for hver foster. Kun fylde hætteglas med 2 - 3 ml opløsning, der sikrer, at embryonerne fuldt neddykket. Nutate hætteglas lodret ved at placere 5 ml hætteglas i en styrofoam rack (eller enhver rack, der vil holde hætteglassene sikkert), der er fastgjort til en nutator. Bemærk: Denne forholdsregel forhindrer embryo fra at blive revet, som kan opstå, når det kommer i kontakt med låget af hætteglasset under vandret nutationen.
  8. For embryoner fase 0 - 6, 22, behandles med 5 ug / ml proteinase K i 1X PTW i 5 minutter ved stuetemperatur. Treat embryoner trinvis 7-12 22 med 10 ug / ml proteinase K i 1X PTW i 10 minutter ved 37 ° C for at reducere baggrundsfarvning.
  9. At producere en tilstrækkelig farvereaktion at påvise lave niveauer af genekspression i etaper: 1 - 10 22, inkuberes med 10 pg / ml probekoncentration i 12 timer. For ældre etaper, inkuberes med 1 & #956; probekoncentration g / ml ved 60 ° C.
  • Hvis flash-frysning embryonet, hurtigt tilføje 2 - 3 ml 1X PBS til petriskålen efter dissektion og vip petriskålen at adskille embryo fra æggeblomme granulat. Fjern væske og gentag 2 - 3 gange for at fjerne alle æggeblomme. Brug fine tippes pincet, overførsel af embryoner til en præ-mærket mikrocentrifugerør og flash fryse i flydende nitrogen før opbevaring ved -80 ° C.
  • 4.. Edu celleproliferationsassay. Stiftelse og påvisning af Edu Zebra Finch embryoner.

    1. Stearinlys ægget ved hjælp af et fiberoptisk illuminator lampe til at lokalisere embryo eller æggeblomme.
    2. Markere siden af ​​ægget modsat placeringen af ​​embryo eller blommen i ægget at sikre, at fosteret ikke beskadiges under mikroinjektion processen.
    3. Linje en 60 mm plastik skål med modellervoks og skimmel det i form af en skål til at holde æg i den ønskede orientering. Den markante stedet bør væreorienteret for at tillade indføring af mikroinjektion nål med mikromanipulator. Bemærk: Leret vil stabilisere ægget under mikroinjektion og i hele inkubering i trin 4.11.
    4. Træk to glaskapillar mikroinjektion nåle. Blunt en nål til at stikke et hul i ægget på det markerede sted. Forbered den anden mikroinjektion nål til injektion ved udsætter det med mineralsk olie og sætter den ind i mikroinjektor.
    5. Indstil lydstyrken for løsning frigivet per injektion til 59,8 nl på mikroinjektor.
    6. Indlæse mikroinjektion nål med 10 mM lager Edu løsning.
    7. Opret et hul i skallen på det markerede stedet med den afstumpede glaskapillar, idet man ikke knuse skallen eller drop stykker af skallen ind i ægget hulrum. Vend ægget, således at hullet er i en 45 ° vinkel, så mikroinjektion nålen indsættes direkte gennem hulrummet til æggeblomme eller embryoet.
    8. Ved hjælp af mikromanipulator, indsætteindlæst nål ca 1,0 cm ind i hulrummet.
    9. Injicere den ønskede mængde af Edu løsningen direkte på embryo under udvikling eller æggeblomme. Bemærk: Højst 478 nl uddan kan injiceres uden at det resulterer i fosterdød.
    10. Umiddelbart wrap æg og ler holder med flere lag af plastic wrap til at dække æg og skålen for at forhindre udtørring af embryo under inkubation. Tape kanterne af plastikfolie til bunden af ​​skålen for at forhindre plast fra udpakning under inkubation. Bemærk: Den plastikfolie må kun fjernes straks før dissektion.
    11. Lad de nyligt prolifererende celler til at optage edu ved at inkubere ægget ved 37 ° C, indtil den ønskede fase opnås. Efter injektion, ikke vender tilbage æg til vippe hylder i kuvøse. Placer plastik-indpakket ler foret parabol på stabilt underlag inde i inkubatoren.
    12. Fjern plastfolie og dissekere fosteret efter den ovennævnte protokol.Lave embryo i 4% PFA og inkuberes i 12 timer ved 4 ° C som beskrevet ovenfor. Efter fiksering vaskes med 100% ethanol (EtOH) i 5 minutter og opbevares i friske 100% EtOH ved -20 ° C indtil yderligere analyse.

    5.. Edu "Klik" Reaktion Protocol

    De følgende trin udføres alle i hætteglas.

    1. Rehydrere embryoner med successive 5 minutters vaske af følgende:
    2. EtOH, 75% EtOH og 25% sterilt deioniseret destilleret (SDD) vand, 50% EtOH og 50% SDD vand, 25% EtOH og 75% 1X PTW, 100% 1X PTW
    3. Vask tre gange i 100% 1X PTW 10 minutter hver.
    4. Fortynd reaktionsbuffer additiv (Kit Komponent F) ved at kombinere en del af 10X stock pufferopløsning (10 ul) til 9 dele sdd vand (90 ul).
    5. Forbered reaktionsblandingen i et separat rør ved at blande følgende: 875 pi 1X PBS, 20 pi CuSO 4, 5 pi azid, 100 ul fortyndet reaktion buffer additiv.Bemærk: Volumen af ​​reaktionsblandingen kan skaleres ned. Reaktionen vil fungere, hvis fosteret er helt dækket i reaktionsblandingen. Tilsæt fortyndet reaktionsbuffer additiv (trin 5.3) umiddelbart før brug. Alle efterfølgende trin udføres i mørke. Dæk fostre med folie for at beskytte mod lys.
    6. Dæk hætteglas med aluminiumfolie og inkuberes dem lodret ved stuetemperatur i to timer ved at placere dem i en styrofoam rack fastgjort til en nutator.
    7. Vask embryoner 3 gange i frisk 1X PBS i 10 minutter hver.
    8. Inkubér embryoner i frisk 4% PFA natten over ved 4 ° C.
    9. Vask 3 gange i 1X PBS i 10 minutter hver og opbevares i frisk 1X PBS ved 4 ° C. Dæk fostre med folie indtil yderligere analyse.

    Representative Results

    De trin afbildet i figur 1 indikerer forekomsten af embryonet mens det sidder i vitellinmembranen (A) og vise den korrekte metode til at adskille embryonet fra blommen (B). Embryo kan identificeres ved den zone af krydset, hvilket er meget lettere end vitellinmembranen. Fosteret selv er ofte vanskeligt at skelne indtil blommen er skåret væk. Når fosteret dissekeres fra ægget, kan det være fast eller lynfrosset til fremtidig brug. Hvis en in situ-hybridisering er planlagt til dissekeret embryon, er det nødvendigt at fjerne vitellinmembranen, der er klæbet til fosteret via zone krydset. Figur 2 illustrerer den forbedrede synlighed af embryonet, når denne membran er fjernet (C), og den korrekte måde at skrælle vitellinmembranen (A, B). Efter dissektion og fiksering, hele mount in situ hybridisering blev udført som vist i figur 3 (A, A ', B, B«) Og figur 4 (A, A ', B, B'), og figur 5 (A, B, C) ​​for at detektere forskelle i orthodenticle homeobox 2 (Otx2) ekspression i embryoner udviklingsmæssigt udsat for lave doser af methylkviksølv. Figur 5 viser senseprobe resultater demonstrerer manglende baggrund. I figur 4, til trods for at dissekeret fra ægget på samme tidspunkt, embryonet udviklingsmæssigt udsat for methylkviksølv (MeHg) skred frem til trin 5 22 (B, B '), mens kontrolgruppen embryo udvikles til trin 6 22 (A, A "). Gruppen af embryoner dissekeret og vist i figur 4 blev indsamlet fra reden og taget fra inkubatoren på de samme tidspunkter. Selv om nogle naturlige variation er til stede i udvikling, baseret på tidligere dissektion data, er det usandsynligt, at temperatursvingninger i inkubatoren vil medføre kun 2,4 ppm methylkviksølv embryoner at være udvikpmentally forsinket. Forskellene i etaper indikerer ændringer i celledelingen i embryoner udviklingshæmmede udsættes for methylkviksølv.

    Før dissektion blev edu injiceret i en dag 2 æg og fik lov at inkubere natten over. Efter dissektion og fiksering af fase 16 22 embryo blev edu visualiseret under anvendelse af "klik" kemi, hvilket tillader påvisning af prolifererende celler, som det ses i figur 6 (A, B, C). Det er vigtigt nøje at overvåge tidspunkter, når du placerer æg i rugemaskinen, og i løbet af dissektioner, som udsættelse for methylkviksølv eller udførelse af Edu analysen kan forstyrre udviklingsmæssige progression. De tidligste injektion blev udført på dag 0, hvilket var dagen for indsamling som angivet i trin 1.3. Denne foster blev dissekeret ca 38 timer senere (trin 7 22). Overlevelsesraten fandtes at være omkring 90% (samme hastighed som kontrol embryoner), så længe injektionen beløbet var under 478 nl.

    22 embryoner blev et RNA-ekstraktion udføres i henhold til producentens protokol med ingen optimering påkrævet, som det ses i fig. 7. Fjernelsen af vitellinmembranen var unødvendig for RNA-ekstraktion og senere QRT-PCR-applikationer.

    Bemærk: Alle embryo tal er orienteret således, at de forreste og bageste regioner er på toppen og bunden af billederne, hhv.

    Figur 1
    Figur 1.. Procedure for at lokalisere og dissekere zebra finke embryoner, iscenesætter 1-10 22. Find foster ved forsigtigt at rulle blommen indtil den svage hvide disk er tilsyneladende (A). Nårembryo er placeret i midten af blommen, er blommesækken dissekeret i en trinvis måde (B), hvor den første cut aflaster af vitellinmembranen (1) og senere nedskæringer (2) grænser op til zonen af krydset (ZJ), som er klæbet til vitellinmembranen. Skala søjler repræsenterer 1 mm.

    Figur 2
    Figur 2. Fjernelse af vitellinmembranen og synlighed af embryonale strukturer. Efter fjernelse af embryonet fra blommen, sted embryo i en petriskål indeholdende 4% PFA. Hvis en in situ-hybridisering skal udføres, er afgørende synlighed embryonale strukturer og kan opnås ved at fjerne vitellinmembranen (A). Grip vitellinmembranen med ekstra fin spids pincet og forsigtigt flå det væk fra foster ved at håndtere embryoet direkte på den yderste kant, hvis det er nødvendigt(B). Vitelline fjernelse membran øger klarhed af embryonale strukturer og giver embryoner skal afbildes eller behandlet med in situ hybridisering (C). Skala søjler repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3.. Hele mount in situ hybridisering udført på zebra finke embryoner udviklingshæmmede udsættes for methylkviksølv. Expression mønstre af orthodenticle homeobox 2 (Otx2) blev karakteriseret i embryoner udsat for 0,0 ppm methylkviksølv (A, A ') og 2,4 ppm methylkviksølv (B, B «) via forældrenes kost. DORsaI (A) og ventrale (A ') ekspression af Otx2 er synlig i hele midthjernen og optiske vesikler under trin 12 22. behandlingsgruppen embryoner blev dissekeret på samme tidspunkt, men blev udviklingsmæssigt forsinket som set i den dorsale (B) og ventrale (B ') visning af hoved-strukturer, som er karakteristiske for fase 11 22 Forkortelser:. mb, midthjernen; op, optisk vesikel. Skala søjler repræsenterer 1 mm.

    Figur 4
    Figur 4.. Hele mount   in situ   hybridisering udført på zebra finke embryoner udviklingshæmmede udsættes for methylkviksølv. Expression mønstre af orthodenticle homeobox 2 (Otx2) blev karakteriseret i trin 6 22 Embry os udsat for 0,0 ppm methylkviksølv (A, A ') og fase 5 22 embryoner udsat for 2,4 ppm methylkviksølv (B, B') via forældrenes kost. Forkortelser: am, forreste margin på mesoderm; nej, notochord, notochord mesoderm; po, proamnion, forreste blastopore; ps, primitivstriberne 22.. Skala søjler repræsenterer 1 mm.

    Figur 5
    Fig. 5. Hele mount in situ   hybridisering udført på zebra finke embryoner ved hjælp af fornuft sonde. (A) Etape 5 22 foster. (B) Tidligt stadium 6 22 foster. (C) Etape 11 22 foster. Skala søjler repræsenterer 1 mm.

    6 "src =" / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg "/>
    Figur 6. Edu inkorporering og de ​​beskyttelse i Zebrafinker embryoner. Edu "klik" kemi blev anvendt til at detektere prolifererende celler i en fase 16 22 embryo (A, B, C). Edu inkorporeres i DNA'et i stedet for thymidin 26, 27 og detekteres ved hjælp af klik kemi 27. Proliferation er klart synlig i de laterale kanter af somitter, og tailbud. Panel A viser proliferation udelukkende forekommer i den bageste af embryo og viser individuelle proliferative celler også. Panel B viser de proliferative steder i hele embryoet. Panel C viser den forreste område, og viser meget proliferativ telencephalon (te) i større detalje. Forkortelser: AF, fosterhinde fold; FLB, forben opløbet; HLB, bagben opløbet; le, linse vesikel; ms, mesencephalon; mt, Metencephalon; OPC, optisk kop; pa, buen; sm, somite mesoderm; tb, tailbud; te, telencephalon. Skala søjler repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 7
    Figur 7. Kvaliteten af RNA ekstraheret fra dissekerede zebra finke embryoner. Kontrol (0,0 ppm) og 1,2 ppm methylkviksølv embryoer blev dissekeret og lynfrosset som beskrevet i trin 3.8. Hver bane viser RNA ekstraheret fra to homogeniserede embryoner fra hver behandlingsgruppe.

    Discussion

    Seneste udvikling af en embryologiske iscenesættelse guide 22 og genom annotation gør zebra finke en ønskelig model organisme til udviklingsmæssige undersøgelser. Den lille størrelse og skrøbelighed af zebra finke embryoner, der spænder fra 3 til 7 mm i etaper 1, men - 10 22, kan gøre dissektioner vanskelig 11, 14. Lokalisering og rent fjerne embryoner fra overfladen af ​​blommen kan være udfordrende. Denne protokol giver tilstrækkelige detaljer til at udføre proceduren med lethed. Denne protokol viser de vigtige skridt, der ikke er typisk kendt, men er nødvendige for at sikre en vellykket dissektion. For eksempel er det vigtigt at efterlade et lille lag af æggeblomme mellem embryonet og ark vejes papir til hinder stikning.

    Både identifikation og fjernelse af fosteret kan være svært. Til fejlfinding identificere embryonet på overfladen af ​​blommen skinne lys direkte over blommesækken, efter at den harblevet fjernet fra ægget, og se på blommen ved en 45 ° vinkel for at finde embryoet. Når fosteret er placeret, skære blommen på veje papir idet man ikke rive embryoet.

    Hvis yderligere ansøgninger omfatter billeddannelse til anatomiske forskelle, in situ hybridisering, eller celleproliferationsassays, er det vigtigt at fjerne vitellinmembranen i trin 1 - 8 22 for bedre visualisering af strukturer. Hvis oplever problemer, når du fjerner æggeblomme eller vitellinmembranen i tidlige stadier, fastsætte fosteret i 4% PFA før vask det i 1X PBS for at reducere embryonale skrøbelighed. Ved først at fjerne vitellinmembranen under dissektion som beskrevet strukturer er klart synlig og intakt i zebra finke embryoner efter udførelse af en in situ-hybridisering.

    En begrænsning af Edu er, at administrationen af ​​dosering mængder gennem 478 nl fører til embryonale dødelighed. Men det store dosisskala tillader varying niveauer af proliferativ celle tagging.

    "Klik" reaktion, der anvendes i dette sæt, er kobber (I)-katalyseret-Alkyn-azid-Cycloaddition (Cu (I) AAC). I denne konkrete reaktion er en alkyn-holdigt thymidinanalogen molekyle (EDU) inkorporeret ved aktivt delende celler. Den alkyngruppe i edu rager frem fra den spiralformede struktur af DNA, og detekteres ved udsættelse for et azid molekyle konjugeret til et grønt, fluorescerende molekyle, som binder til den frie alkyngruppe. Den grønne fluorescens viser de nyligt prolifererende celler i embryonet. Bio-ortogonalitet af azidet og alkyn grupper forhindrer uspecifik farvning, fordi disse reaktive arter, der ikke er naturligt til stede i organismer. Også, fordi DNA ikke behøver at blive denatureret, for at reaktionen forekommer, kan yderligere DNA-afhængig analyse være let udføres 27.

    En iboende begrænsning ved denne metode er den lille størrelse og fragility af zebra finke embryoner. Fjernelse vitellinmembranen af embryoner stages 1 - 15 22 kan resultere i skadelige embryonale strukturer, hvis ikke udført med forsigtighed. Men denne protokol forenkler dissektionsmetode, så efterforskerne at benytte tidlige embryonale stadier at undersøge strukturelle anomalier og genekspression, der ikke tidligere er blevet undersøgt i dybden. Denne protokol åbner for et væld af cellulære-molekylære analyser, der vil give efterforskerne til at bestemme de udviklingsmæssige oprindelse voksne fænotyper. For eksempel vil det være muligt at undersøge genekspression impliceret i vokal læring under forskellige miljøforhold eller efter farmakologiske behandlinger på de tidligste stadier af udvikling 28, 29,30,31. Selvom det ikke er påvist i dette papir, denne metode potentielt giver mulighed for andre procedurer såsom radioaktiv in situ hybridisering på zebra finke vævssnit og elektroporation / i ovo kirurgi 32, 33,34. I betragtning af at zebra finke er blevet etableret som en vigtig model organisme i en stor mængde litteratur, sådanne undersøgelser giver uudnyttede muligheder for at linke udviklingsmæssige mekanismer med voksen fysiologi og adfærd, især udvikling af sproget 7, 9.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at afsløre.

    Acknowledgments

    Forfatterne takker deres finansieringskilder, Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Science Education Program til College of William og Mary; Grant sponsor: NIH (MSS); Grant nummer: R15NS067566. De anerkender også støtte fra College of William og Mary, Biologisk Institut og College of Arts and Sciences for assistance med pasning af dyr.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chicken egg incubator We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model   
    Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    Dissection microscope  We use Olympus SZ61
    7'' Drummond capillary for Nanoject II injector Drummond 3-00-203-G/X
    Drummond Nanoject II microinjector Drummond
    Dumont Tweezers #55 World Precision Instruments 14099
    Ethanol (EtOH)
    50 ml Falcon tube (polypropylene) Fisher Scientific 06-443-18 
    FastPrep Lysis Matrix H tubes MP biomedicals 6917-100 Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) Dolan-Jenner Industries  Fiber-Lite MI-150 
    Glass vials with screw cap (DEPC treated) Fisher Scientific 03-338A
    Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) Fisher Scientific 05-408-129
    Mineral oil Sigma-Aldrich M-8410
    Modeling Clay Any brand
    Narshige PB-7 needle puller Narshige
    Omni Bead Ruptor Homogenizer OMNI International 19-010 Used for RNA extraction
    4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. 
    Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4
    Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5
    Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20
    35 ml Plastic Petri dish  Fisher Scientific 08-757-100A
    plastic wrap Any brand
    Prepease RNA Spin Kit PrepEase, Affymetrix 78766 1 KT Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    sdd H2O
    Seed cup  We use it as a container when incubating eggs
    Stainless steel scalpel 
    Standard nest box We use Abba Plastic Finch Nestboxes
    4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials Fisher Scientific 02-912-352
    Transfer pipettes (polyethylene) Fisher Scientific 13-711-7M 
    4 x 4 weigh paper Fisher Scientific 09-898-12B

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches. Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).
    2. Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata). Chemosphere. 90, 125-131 (2013).
    3. Maney, D. L., Goodson, J. L. Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds. Adv Genet. 75, 83-119 (2011).
    4. Kirn, J. R. The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning. Brain and Language. 115, 29-44 (2010).
    5. Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).
    6. Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning. PLoS One. 6, (2011).
    7. Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language. Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).
    8. Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch. Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).
    9. Jarvis, E. D., et al. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).
    10. Brainard, M. S., Doupe, A. J. Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research. Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).
    11. Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches. J Physiol Paris. (2012).
    12. Warren, W. C., et al. The genome of a songbird. Nature. 464, 757-762 (2010).
    13. Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).
    14. Birkhead, T. R., et al. Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).
    15. Haesler, S., et al. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
    16. Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival. Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).
    17. Stern, C. D. The chick; a great model system becomes even greater. Dev Cell. 8, 9-17 (2005).
    18. Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins. Brain Research. 1424, 67-101 (2011).
    19. Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).
    20. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Development. 7, (2012).
    21. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).
    22. Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata. J Morphol. (2013).
    23. Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. (2001).
    24. Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue. Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).
    25. Pizard, A., et al. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).
    26. Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling. Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).
    27. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).
    28. Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata). Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).
    29. Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch. Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).
    30. Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus. Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).
    31. Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites. The Auk. 127, 156-161 (2010).
    32. Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. Journal of Visualized Experiments. (2012).
    33. Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes. PLoS One. 7, (2012).
    34. Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities. The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics