Etablering og optimalisering av en høy gjennomstrømning Oppsett for å studere * These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

Summary

Denne videoen artikkelen beskriver high throughput rørledningen som har blitt etablert for å infisere og analysere store mengder sebrafisk embryo gir et nytt kraftig verktøy for sammensatte testing og medisiner ved hjelp av en hel dyr virveldyr organisme.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Veneman, W. J., Marín-Juez, R., de Sonneville, J., Ordas, A., Jong-Raadsen, S., Meijer, A. H., Spaink, H. P. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), e51649, doi:10.3791/51649 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sebrafisk er blitt et verdifullt verktøy i preklinisk fase av medisiner screenings som helhet dyremodell med høy gjennomstrømming screening muligheter. De kan brukes til å bygge bro mellom cellebaserte analyser på tidligere stadier og in vivo validering i pattedyrmodeller, noe som reduserer på denne måte, antallet forbindelser som passerer gjennom til testing på de mye dyrere gnager-modeller. I lys av dette, i den nåværende manuskriptet er beskrevet en ny høy gjennomstrømning rørledningen ved hjelp av sebrafisk som in vivo modellsystem for studier av Staphylococcus epidermidis og Mycobacterium marinum infeksjon. Dette oppsettet gjør at produksjon og analyse av store antall synkrone embryoer homogent smittet. Videre fleksibilitet av rørledningen lar brukeren enkelt implementere andre plattformer for å forbedre oppløsningen av analysen når det trengs. Kombinasjonen av sebrafisk sammen med innovative high throughput technologies åpnes innen legemiddeltesting og oppdagelse av nye muligheter, ikke bare på grunn av styrken ved bruk av en hel dyremodell, men også på grunn av det store antallet av transgene linjer som er tilgjengelige som kan brukes til å dechiffrere måten av nye forbindelser.

Introduction

Hittil sebrafisk (Danio rerio) har blitt etablert som en effektiv modell for å studere en rekke smittsomme sykdommer en. Sebrafisk embryo tilbyr unik in vivo bildemuligheter på grunn av sin åpenhet og det store antall eksisterende transgene reporter linjer uttrykker fluorescerende proteiner. Denne kraftige kombinasjonen gjør det mulig å spore ulike immuncelletyper i tid mens samspill med patogener som Mycobacterium marinum, nærmeste slektning av M. tuberkulose 2 eller Staphylococcus epidermidis, den viktigste forårsakende av biomateriale assosiert infeksjon 3-5. Forskjellige ruter av infeksjon kan brukes i sebrafisk embryoer, avhengig av formålene med studien 6..

En av disse infeksjonsveier er eggeplomme injeksjon av bakterier. Den største fordelen med denne metoden i forhold til de andre er at eggeplomme infectiden kan utføres automatisk via robot-injeksjon, noe som reduserer innsprøytningstid og tillater høy reproduserbarhet av infeksjonen 7, 8.

Tidligere arbeid, ved hjelp av sebrafisk som en høy gjennomstrømning in vivo modellsystem for studier av S. epidermidis og M. marinum infeksjon viste seg å være vellykket 7, 8. Dette systemet er i stand til å screene for sykdomsprogresjon via robot plomme injeksjon av tidlige embryoer og med fluoresens avlesning som et mål for den bakteriemengde. I overensstemmelse med dette begrepet, og dette oppsettet er optimalisert og etablert en svært effektiv med høy gjennomstrømning rørledning med mulighet for å generere store mengder av homogent infiserte embryoer og spore progresjon av infeksjon i løpet av tiden etter behandling med et antall forbindelser. Med den etablerte oppsettet er det mulig å generere opptil 8000 synkrone embryoer til skjermenfor sykdomsutvikling, behandling på denne måten opp til 2500 embryoer per time. Embryoet er sortert basert på deres bakteriemengde ved hjelp av et automatisk system, som sikrer homogene grupper av infiserte larver. Videre, for å validere oppsett, effekter av referansen kjent for å forhindre tuberkulose progresjon hos pattedyr har blitt testet på befruktede egg infisert med M. marinum E11 belastning eller mer virulente M belastning ni.

Denne studie beskriver nærmere høy gjennomstrømning rørledningen som har blitt etablert for å være i stand til å generere et stort antall infiserte embryoer og den etterfølgende analyse av den bakterielle progresjon i løpet av utvikling og etter at forbindelsen behandling.

Protocol

En. Bakteriestammer og vekstvilkår

  1. Forbered S. epidermidis Inokulum
    1. Ta flere individuelle kolonier fra S. epidermidis stamme O-47, som inneholder en pWVW189 avledet mCherry ekspresjonsvektor (De Boer L. upublisert) fra en Luria Bertani (LB) agar plate supplert med 10 ug / ml kloramfenikol, og kulturen over natten ved 37 ° C i 25 ml LB-medium supplert med 10 mikrogram / ml kloramfenikol å MIDlog scenen.
    2. Sentrifuger 1 ml av kulturen ved 12 000 x g i 1 minutt og senere vaskes 3 ganger med 1 ml sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) med 0,3% (v / v) Tween-80.
    3. Måle den optiske tettheten ved 600 nm (OD 600), og fortynne den bakterielle suspensjonen til en OD 600 på 0,3 i 2% (w / v) polyvinylpyrrolidon 40 (PVP 40) i PBS. Merk: en OD 600 på 0,3 tilsvarer 1,0 x 10 8 koloni-dannende enheter / ml (CFU / ml).
    4. Forbered M. marinum Inokulum
      1. Ta flere individuelle kolonier fra M. marinum stamme M eller E11 inneholder pSMT3-mCherry vektor stabilt uttrykker mCherry 10 fra en Middlebrook 7H10 agar-plate med 10% (v / v) Middle OADC anrikning supplert med 50 ug / ml hygromycin og kultur over natten ved 28 ° C i 10 ml Middle 7H9 buljong med 10% (v / v) Middle ADC berikelse supplert med 50 mikrogram / ml hygromycin.
      2. Sentrifuger 1 ml av kulturen ved 12 000 x g i 1 minutt og senere vaskes 3 ganger med 1 ml steril PBS med 0,3% (v / v) Tween-80.
      3. Måle OD 600, og fortynne den bakterielle suspensjonen til en OD 600 på 0,3 i 2% (w / v) PVP 40 i PBS. Merk: En OD 600 av 1 tilsvarer 1,0 x 10 8 cfu / ml.

    To. Forbered Sebrafisk Eggs

    1. Plasser maksimalt 70 mannlige og 50 kvinnelige vill type sebrafisk hver for seg i den store avl fartøy. Merk: Plasser hunnfisk i den nedre del av den store avl fartøyet.
    2. Fjern separatoren neste dag i morgen, for å la sebrafisk starte oppdrett.
    3. Samle eggene ved bunnen av den store avl karet gjennom egget kollektoren i en 50 ml rør fylt med egg vann (60 ug / ml øyeblikkelig hav havsalt).

    Tre. Kanyler

    1. Innhent kommersielt tilgjengelige skreddersydde glasskapillærer nåler med en indre diameter på 10 mikrometer.

    4. Eksperimentell Outline of Injection

    1. Kok 100 ml av 1% (w / v) agarose i egg vann og avkjøles til rundt 40 ° C. Hell agarose inn i automatiserte microinjectors plate og plasser 1024-vel stempel inn i agarose. Merk: Platen er klar til bruk når avkjølt.
    2. På den automatiserte microinjector driftsprogramvare klikker du på "Kalibrer scenen ',klikk deretter på '1024 'godt rutenett og plasser agarose plate i microinjector og kalibrere platen ved å klikke på skjermen i midtstilling av brønnen.
    3. Gå til 'nål menyen' og klikk på 'kalibrere nål holder'.
    4. Fyll kanylen ved hjelp av en microloader tips med enten 10 mL pvp 40 inneholder 100 cfu / nl S. epidermidis eller 30 cfu / nl M. marinum, eller bruk pvp 40 som mock injeksjon.
    5. Plasser nålen i den automatiserte mikro injektoren og kalibrere x, y-posisjon ved å senke eller å bevege nålen opp og klikke på skjermen ved posisjonen til nålen. Deretter kalibrere z posisjonen til nålen ved å trykke på skjermen ved posisjonen av spissen av nålen.
    6. Fordel egg over agarose nettet ved hjelp av en plast overføring pipette, og fjern overflødig egg vann. Plasser agarose nettet i den automatiserte microinjector.
    7. Gå til "injection menyen "og justere" Injection press 'innstilling til 200 hPa,' Injection tid '0,2 sek og "Kompensasjon press' 15 hPa, som korrelerer med en nl, på Femtojet innstillingsmenyen.
    8. Klikk på 'Injiser alt "for å injisere hele platen.
    9. Samle eggene etter injeksjon ved å vaske dem inn i en petriskål (92 x 16 mm), med et maksimum på 70 embryoer per petriskål, og inkuberes ved 28 ° C.

    5. Flow-cytometer Analysis

    1. Klargjør stor partikkel flowcytometer i henhold til produsentens instruksjoner og fyll prøvekoppen og slire væskebeholderen med egg vann.
    2. På driftsprogramvaren, gå til "PMT"-menyen og bruke følgende innstillinger: 650 V for 'Red' kanal og 0 V for "grønne" og "Yellow" kanaler. Deretter går du til "Terskler"-menyen og bruke følgende innstillinger: 'Optical tetthet 'terskel signal: 975 mV (Copas XL verdi: 50) og "Time Of Flight' (TOF) minimum til 320 usekunder (Copas XL verdi: 800) for å redusere påvirkning av rusk.
    3. For analyse uten sortering embryoene gå til trinn 5.4, for analyse og sortering av embryoene i en petriskål gå til trinn 5.5 eller for analyse og sortering av embryoene i en 96-brønns plate gå til trinn 5.6.
    4. Plasser embryoene i prøvekoppen og klikk på "Start" for å starte analysen. Når alle embryoer blir analysert stoppe analysen ved å klikke på "stopp". Lagre dataene ved å klikke på 'Lagre alle'. Merk: Alle data er lagret som TXT, LMD, DAT, CSV og BSRT filer. Følg protokollen ved trinn 5.7.
    5. Plasser embryoene i prøvekoppen og definere maksimum 70 embryoer per plate skal sorteres ved å skrive inn 70 i 'Sorter' menyen. Sett en tom petriskål under sorter og klikk på 'Manuell Sorter'. Når Petri di sh er fylt, lagre data ved å klikke på 'Lagre alle'. Merk: All data lagres som TXT, LMD, DAT, CSV og BSRT filer. Følg protokollen ved trinn 5.7.
    6. Plasser embryoene i prøvekoppen og definere maksimum 1 embryo per brønn skal sorteres ved å legge inn en i "Sortering"-menyen. Sett en tom 96-brønns plate i venstre plate holderen og klikk på 'Fyll tallerkenen'. Når 96-brønns plate blir fylt, lagre data ved å klikke på 'Lagre alle'. Merk: All data lagres som TXT, LMD, DAT, CSV og BSRT filer. Følg protokollen ved trinn 5.7.
    7. Få på TXT-filen til å behandle rådata, bruk følgende innstillinger data filter: 'Status velger': 40, og hvis du bruker den slags modul 'Status slags':. Seks Deretter bruker tallene fra den totale fluorescens signal fra "Red 'kanal for å beregne gjennomsnitt og standardfeil for gjennomsnittet. Plott disse datasettene i bar eller scatter grafer.
    ve_title "> 6. Drug Treatment

    1. Analyser og sortere på tre dager etter injeksjon (dpi), M. marinum infisert embryoer i to like grupper ved hjelp av den store partikkel strømningscytometer (trinn 5.5). Behandles en gruppe med en forbindelse av interesse med bæreroppløsningsmiddel, og andre med bæreroppløsningsmiddel alene (kontroll). Påfør lignende behandlinger for å spotte injisert kontroll til test for antibiotika bivirkninger.
    2. Gjenta på fire og fem dpi analysen (trinn 5,5) og oppdatere egg vann eller egg vann som inneholder det sammensatte.

    7. Høy Resolution Imaging

    1. Anesthetize embryoene med 0,02% (w / v) bufret 3-aminobenzosyre-etylester (Tricaine) i egg vann i 10 minutter før analyse.
    2. Forbered Vertebrate Automated Screening Technology system og stor partikkel Sampler i henhold til produsentens instruksjoner.
    3. Velg referansebilder som tilsvarer en alder av embryoene fra "Imaging - Objekt211; Detection Setup "-menyen.
    4. Velg antall bilder og orientering skal gjøres av Vertebrate Automated Screening Technology system fra "Imaging - Auto lagre bilder"-menyen.
    5. Plasser en 96-brønns plate fylt med embryoer (fra trinn 5,6) i den venstre plate innehaver av stor partikkel Sampler, og klikk på "Kjør plate '.
    6. Når et embryo blir oppdaget og riktig plassert; image hodet og halen separat med CLSM ved hjelp av en 10X vanlig tørr objektiv og sette sammen bildene etterpå ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare.

Representative Results

De foreliggende resultater viser at den høye gjennomstrømningen rørledningen for å studere S. epidermidis og M. marinum infeksjon har blitt etablert og som kan utvides til andre smittemodeller. For det første, ved bruk av den store avl fartøyet (figur 1A), basert på den publiserte systemet ved Adatto et al. (2011) 11, gjør det mulig å generere store mengder av synkron egg i enkle arrangementer som gir et høyt kontroll av gyteprosessen. Ved siden av å være i stand til å injisere store antallet embryoer i en kort tidsperiode, en forbedret versjon av det tidligere utviklet automatiserte mikroinjeksjonssystemet 7 ble anvendt (figur 1A). Å asses som er den beste utviklingsstadiet for plomme infeksjon, injeksjoner med S. epidermidis og M. marinum ble utført på alle de forskjellige faser mellom 1 og 512 cellestadiet, i henhold til beskrivelsen gjort av Kimmel et al. (1995) 12

Injeksjoner med 100 cfu S. epidermidis mellom 16 og 128 cellestadiet gitt best infeksjon mønster (figur 2). Bakteriene proliferated inne i plomme for tre dager og spredte seg inn i kroppen fra tre dpi og utover. Utføre injeksjoner før 16 cellestadiet ført til høy dødelighet fra 4 dpi, og injeksjon etter 256 cellestadiet viste hovedsakelig bakterievekst inne i plomme med knapt noen bakterier sprer seg inne i kroppen til embryoet. Kvantifisering av bakteriemengden ble utført ved fluorescensintensitet analyse ved hjelp av den store partikkel flowcytometer som beskrevet av Veneman et al. (2013) 8 (figur 3).

Observasjoner viste at den optimale utviklingsstadiet for injeksjon av 30 cfu M. marinum injeksjon er mellom 16-128 celle scenen for E11 stamme (Figur 4A) og mellom 16-64 celle scenen med mer virulente M Strain (figur 4B). Embryoer som injiseres i disse fasene viser bakterievekst på innsiden av plommen og spredning av bakterier gjennom embryo (figur 7). Infeksjon med begge stammer på tidligere stadier present uspesifikke generalisert bakterievekst fører embryoene til å dø etter fire dpi. På den annen side, i embryoer injisert på senere stadier bakteriemengden var begrenset til eggeplomme.

Deretter presorting med stor partikkel flowcytometer (Figur 1B) generert store homogene grupper av infisert fisk eksklusive engangs eller sterkt infiserte embryoer (Tall 5A og 6A). Etter presorting, M. Marinum infiserte embryoene ble behandlet med rifampicin, en første linje antituberculosis narkotika. Tidligere studier viste at behandling med Rifampicin i en dose på 200 uM effektivt reduserer M. marinum infeksjon hos sebrafisk 7, 13. Tar advantage av det store antall av homogent infiserte embryoer generert med høy gjennomstrømning oppsett, behandling med forskjellige doser ble utført. Embryoet smittet med M. marinum M belastning og behandlet i 48 timer med 12, 24 og 200 uM Rifampicin viste å redusere effektivt mykobakteriell infeksjon i en doseavhengig måte (figur 5B). I lys av den effektive reduksjonen av infeksjonen ved hjelp Rifampicin i en dose på 200 uM denne konsentrasjon ble anvendt for fremtidige eksperimenter. I tråd med det foregående resultatet, studere bakteriemengden progresjon ved hjelp av M. marinum E11 belastning en vesentlig reduksjon 24 timer og videre etter behandling med 200 uM Rifampicin ble observert (figur 6B).

Videre, dersom høy forstørrelse avbildning som kreves av disse embryoer, de kan fremvises automatisk i 96-brønners plater (figur 1C), hvor prøvene kan analyseres ved hjelpVertebrate Automated Screening Technology system med stor partikkel Sampler montert på en CLSM.

Virveldyr Automated Screening Technology system med stor partikkel Sampler er et system som enten kan monteres på en CLSM eller stereo mikroskop. Denne enheten gjør at lasting av levende eller faste embryoer fra en 96-brønns plate eller bulk container automatisk gjennom et glass kapillær, og orienterer den foran kameraet i ønsket vinkel (f.eks rygg eller lateral). Bilder av embryoet i alle retninger er mulig med den ombord-kamera eller med en ekstern CLSM (figur 7). Embryoet vil senere bli overført i samlingen eller avfallsbeholder.

Figur 1
Figur 1. Mainstream eksperimentell outline. A) voksen fisk blir satt sammen for å mate, egg er samlet, innrettet i en agarose-plate og injiseres. B) Den injiserte egg inkuberes ved 28 ° C, og vil være forhåndssorteres for mulige behandling. C) Etterfølgende analyse av store partikkel flowcytometer og / eller stor partikkel Sampler / Vertebrate Automated Screening Technology med CLSM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2
Figur 2. Etablering av beste mobil scenen for S. epidermidis plomme injeksjon. sebrafisk embryo ble injisert i eggeplomme på ulike utviklingsstadier 1-512 cellestadiet med 100 cfu av S. epidermidis. Embryoet injisert mellom en ennd 8 cellers stadiet viste bakterievekst i eggeplomme og høy dødelighet fra 4 dpi. Embryoet injisert mellom 16 og 128 cellestadiet viste bakterievekst i eggeplomme og inne i kroppen starter på tre dpi. Embryoet injisert mellom 256 og 512 cellestadiet viste mange bakterievekst inne i eggeplomme. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3.. Kvantifisering av bakteriemengden ved hjelp av store partikkel flowcytometer. 100 cfu S. epidermidis ble injisert inn i eggeplomme av sebrafisk embryo. A) Opp til 5 ppt, hver dag, grupper av ti embryoer var homogenisert og belagt direkte, som viser den gjennomsnittlige eksponentiell vekst basert på to biologiske kopier (feilfelt= SEM). B) Store partikkel strømningscytometer Analysen viser den gjennomsnittlige fluorescens-signal fra ikke-injiserte og S. epidermidis injisert embryoer. 30-160 embryoer per tilstand ble analysert (feilfelt = SEM), forskjellige bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller etter én måte ANOVA etterfulgt av Tukey post-hoc test (P <0,001), ns:. Ikke signifikante forskjeller C) Sammenheng mellom cfu og gjennomsnittlig fluorescens-signal på grupper av 10 S. epidermidis smittet embryoer (feilfelt = SEM). Dette tallet har blitt forandret fra Veneman et al. (2013) 8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Etahment av den beste mobil scenen for M. marinum plomme injeksjon. sebrafisk embryo ble injisert på alle de forskjellige utviklingsstadier 1-512 cellestadiet med 30 cfu av M. marinum E11 og M belastning. A, B) Embryoet injisert 1-8 cellestadiet viste lignende spredning og dødelighet med begge stammer. A) Embryoet injisert mellom 16-128 celle scenen med E11 stammen viste dannelsen av granulomer og systemisk infeksjon mens de injiserte 256-512 cellestadiet holdt bakteriemengden inn i eggeplomme. B) Embryoet injisert mellom 16-64 celle scenen med M stammen viste dannelsen av granulomer lignende strukturer og systemisk infeksjon mens de injisert 128-512 cellestadiet holdt bakteriemengden inn i eggeplomme . Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 Figur 5. Behandling av M. marinum akutt infeksjon med en første-linje anti-tuberkulose narkotika. Embryoet injisert mellom 16-64 cellestadiet med 30 cfu av M. marinum M belastningen ble kjørt gjennom den store partikkel flowcytometer på tre dpi skal sorteres i to grupper etter forkaste de ikke-og / eller høyt infiserte embryoer. A) Fluorescens av individuelle embryoer i begge gruppene. B) Embryoet behandles med rifampicin (RIF ) i 48 timer ved doser på 12, 24 og 200 uM ble analysert ved 4 ppt; deres bakteriemengde er betydelig redusert. C) Representative Copas profiler av embryoer behandlet med DMSO og Rifampicin i doser på 12, 24 og 200 uM i 24 timer. Bakteriemengde og fordeling er angitt med de røde toppene. Blå linje representerer profilen av elementet sorteres (4 dpf sebrafisk embryo) av empleo. 60-90 embryoer per tilstand ble analysert. Hvert datapunkt representerer en enkelt embryo. Verdier er angitt som gjennomsnitt ± SEM. ns: ikke signifikante forskjeller. Analyse av statistisk signifikans av forskjeller ble utført av én måte ANOVA etterfulgt av Tukey sin posthoc test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Behandling av M. marinum kronisk infeksjon med en første linje antituberculosis narkotika. Embryoet injisert mellom 16-64 cellestadiet med 30 cfu av M. marinum E11 stamme ble kjørt gjennom den store partikkel flowcytometer ved 3 dpi for å bli sortert i to grupper etter fjerning av de ikke-og / eller sterkt infisert embryoer. A) Fluorescens enkelte embryoer i begge grupper. B) Embryoer ble behandlet med Rifampicin (RIF) ved 200 uM i løpet av 4 dager, ble analysert som viser en signifikant reduksjon av den bakterielle belastningen etter en dags behandling. 90 embryoer per tilstand ble analysert. Verdier er angitt som gjennomsnitt ± SEM. Ulike bokstaver angir signifikante forskjeller mellom tidspunkter for samme behandling. * Indikerer signifikante forskjeller med kontrollgruppen. ns: ikke signifikante forskjeller. Analyse av statistisk signifikans av forskjeller ble utført av én måte ANOVA etterfulgt av Tukey sin posthoc test. (P <0,05). Figur B) har blitt forandret fra Spaink et al. (2013) 13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/>
Figur 7. Resultat av M. marinum E11 plomme injeksjon avbildes med Vertebrate Automated Screening Technology og CLSM. Confocal Z stack (sydd 3 bilder) av en fem dpi fli1-EGFP 14 embryo. A) Levende embryo viser spredning av M. marinum E11 bakterier (røde) i hele kroppen. B) Fast 5 dpi fli-EGFP embryo viser M. marinum E11 bakterier (røde) i hele kroppen co-lokaliser med leukocytter (lys blå) oppdaget av L-plastin farging 15.

Discussion

Den high throughput metoden beskrevet i denne artikkelen gir en rask og kostnadseffektiv rørledning til skjermen høyt antall fisk embryoer og larver med ulike typer infeksjoner. Ved hjelp av den store avl fartøy i stedet for tradisjonelle enkle eller familie avl tanker tilrettelagt kontroll av gyteprosessen og generering av større antall synkrone egg. Med en forbedret versjon av den automatiserte mikroinjeksjonssystemet 7, er det mulig å injisere opp til 2500 egg nesten alle i samme cellestadiet løpet av 1 time. Med disse oppdateringene og forbedret programvare er det mulig å injisere flere egg enn tidligere var mulig som kan brukes til å utføre store narkotika-skjermer med bakteriell spredning som en lese ut. Men denne fremgangsmåte er fortsatt begrenset til plomme injeksjon, andre injeksjonsruter for eksempel beskrevet av Benard et al. (2012) 6, vil forhåpentligvis innarbeides i den automatiserte mikroinjeksjonssystemet i nær fremtid.

<p class = "jove_content"> Selv om disse metodene er testet for screening sebrafisk, ville det være nyttig for applikasjoner med andre fiskearter også. For eksempel har den vanlig karpe blitt indikert å ha fordeler for narkotika-skjermer. Som sebrafisk, egg og tidlige embryoer fra karpe er gjennomsiktig, men med den viktigste fordelen med sin store gyte størrelsen på hundre tusenvis av egg og tilgjengeligheten av innavlede linjer som tilbyr en mer konstant genetisk bakgrunn 16.

Analysen av store mengder av infiserte embryoer er gjort med høy gjennomstrømning stor partikkel strømningscytometer. Denne enheten kan liksom analysert embryoer i multibrønnplater eller en petriskål som gjør det spesielt egnet for testing av et stort antall forbindelser. Dersom en høyere avbildningsoppløsning som er nødvendig, enn konfigurasjonen er tilpasset på en slik måte at den store partikkel flowcytometer teknologi kan benyttes for å pre-filtrering, og deretter analysere prøvene i et mediumsatt på en høyere oppløsning. Dette kan gjøres ved hjelp av Vertebrate Automated Screening Technology 17, 18. Denne enheten kan automatisk samle inn levende eller faste embryoer mellom 2 og 7 dager etter befruktning fra en multi brønn plate eller bulk container, image 360 ​​° gjennom et kapillær hjelp CLSM eller stereomikroskopi og kast igjen i to bulkcontainere tillater manuell sortering av embryoene basert på de mikroskopiske bilder. Fremtidige forbedringer vil tillate sortering av embryoet etter avbildning i flerbrønnsplate, og derfor gjør det mulig å screene automatisk stort antall enkelt embryoer over tid med CLSM. Forutsatt at det i fremtidige søknader Vertebrate Automated Screening Technology Systemet kan også kobles til den store partikkel flowcytometer teknologi uten behov for før utlevering larver i multi brønners plater, vil føre til en mer avansert sortering.

Dette notatet beskriver etablering end optimalisering av en høy gjennomstrømning oppsett for å studere S. epidermidis og M. marinum infeksjon som modell for legemiddelforskning. Det viser at resultatet av disse bakteriene injisert i plomme avhengig av utviklingsstadiet av eggene ved tidspunktet for injeksjonen. Injisering M. marinum E11 på 16-128 cellestadiet eller M belastning på 16-64 cellestadiet fører til samme smittemønster som halevenen injeksjon 2, 6. Men dette oppsettet er ikke begrenset til spredning av bare bakterielle patogener. Det er vist tidligere at det er mulig å robotically injisere oppløsninger som inneholder DNA, RNA eller Morpholinos for transgenesis har over-ekspresjon og gene knock-down-studier, henholdsvis 13.. Videre ble det vist at dette oppsettet er også anvendelige for studium av cancer celleproliferasjon og migrasjon. Derfor er denne rørledningen presenterer en allsidig fremgangsmåte for høy gjennomstrømning skjermer av en rekke signal-mekanismer i sammenhengav medfødt immunitet, anvendt på smittsomme sykdommer, og til utvikling av kreft. Disse skjermene kan kombineres med andre for medisin-funnet, men også med analyse av mulige toksiske effekter av identifiserte aktuelle medikamenter.

Disclosures

JS er eier av Life Science Metoder BV som produserer instrumenter som brukes i denne artikkelen.

Acknowledgements

Vi er takknemlige til Leonie de Boer og Bas Zaat (Academic Medical Centre) for å gi oss med S. epidermidis O-47 belastning. Vi takker Rico Bongaarts, Francis Smet og Angela Comas (Union Biometrica) for å få hjelp og råd med Copas XL og VAST BioImager analyse. Vi takker Davy de Witt, Ulrike Nehrdich, og Laura van Hulst for fisk omsorgsrelasjoner, og andre kolleger fra Leiden University for nyttige diskusjoner. Denne forskningen er en del av prosjektet P5.03 IBIZA av forskningsprogrammet av biomedisinsk Materials instituttet, co-finansiert av det nederlandske Ministry of Economic Affairs, og av Smart Mix Program (NWOA_6QY9BM) av Nederland Ministry of Economic Affairs og av Den nederlandske departementet for utdanning, kultur og vitenskap. Ekstra støtte ble innhentet fra EU-prosjektet ZF-helse (FP7-Helse-2009-242048), og RMJ ble støttet av Marie Curie Fellowship som erfaren forsker i EU Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289209). SJR fått støtte fra Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking henhold tilskuddsavtalen n ° 115337, ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA selskaper ytelser contribution.The forfatterne videre innforstått økonomisk støtte fra Leiden University fondet (LUF) for robotikk og fra Cyttron, i Besluit Subsidier Investeringen Kennisinfrastructuur program, som igjen er støttet av den nederlandske organisasjonen for Scientific Research for bildebehandling fasiliteter. Den Copas system oppkjøpet ble delvis støttet av Divisjon for Jorden og biovitenskap (ALW) med økonomisk støtte fra den nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO, 834.10.004).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Middlebrook 7H10 agar BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 262710
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 271310
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211886
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211887
LB agar Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L5542 Multiple suppliers
LB broth Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L3022 Multiple suppliers
Chloramphenicol Bio-connect, Huissen, the Netherlands 16785.03 Multiple suppliers
Hygromycin Bio-connect, Huissen, the Netherlands 25966.01 Multiple suppliers
Tween-80 Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA P1754 Multiple suppliers
Polyvinylpyrrolidone40 Calbiochem, San Diego, California, USA 529504 Multiple suppliers
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA A5040
Agarose Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands S103 Multiple suppliers
Instant ocean sea salt Sera Marin, Heinsberg, Germany 5460
iSPAWN Techniplast, Buguggiate, Italy iSPAWN
Automated microinjection system Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands Automated microinjection system
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA COPAS XL
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA VAST BioImager
LP Sampler Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA LP Sampler
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SL
Injection needle 10 µm inner diameter Qvotek, Mississauga, Canada

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
  3. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
  4. Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
  5. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
  6. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (2012).
  7. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  8. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  9. Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
  10. Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
  11. Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
  12. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  13. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  14. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
  15. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  16. Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
  17. Chang, T. -Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
  18. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics