Upprättande och optimering av en hög genomströmning Setup för att studera
1Institute of Biology, Leiden University, 2ZF-screens BV, 3Life Science Methods BV
* These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

Summary

Denna video artikeln beskrivs hög genomströmning pipeline som har upprättats för att infektera och analysera stora mängder zebrafisk embryon som ger ett nytt kraftfullt verktyg för förening testning och läkemedelsutveckling med hjälp av en hel djur ryggradsdjur organism.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Veneman, W. J., Marín-Juez, R., de Sonneville, J., Ordas, A., Jong-Raadsen, S., Meijer, A. H., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), e51649, doi:10.3791/51649 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Zebrafish blir ett värdefullt verktyg i den prekliniska fasen av läkemedelsutveckling filmvisningar som helhet djurmodell med hög kapacitet möjligheter. De kan användas för att överbrygga gapet mellan cellbaserade analyser på tidigare stadier och in vivo validering i däggdjursmodeller, minska, på detta sätt, att antalet föreningar som passerar genom att testa på de mycket dyrare gnagarmodeller. I ljuset av detta, i detta manuskript beskrivs en ny hög genomströmning rörledning med hjälp av zebrafisk som in vivo modellsystem för studier av Staphylococcus epidermidis och Mycobacterium marinum infektion. Denna inställning gör det möjligt för generering och analys av ett stort antal synkrona embryon homogent smittade. Dessutom flexibiliteten hos rörledningen tillåter användaren att enkelt implementera andra plattformar för att förbättra upplösningen av analysen när det behövs. Kombinationen av zebrafisk tillsammans med innovativa hög genomströmning technologies öppnas området för drogtestning och upptäckter till nya möjligheter inte bara på grund av styrkan av att använda en hel djurmodell, utan också på grund av det stora antalet transgena linjer tillgängliga som kan användas för att dechiffrera den verkningsmekanismen för nya föreningar.

Introduction

Hittills zebrafisk (Danio rerio) har upprättats som en effektiv modell för att studera en mängd olika infektionssjukdomar 1. Den zebrafisk embryot erbjuder unik in vivo imaging möjligheter på grund av sin öppenhet och det stora antalet befintliga transgena reporter linjer som uttrycker fluorescerande proteiner. Denna kraftfulla kombination gör det möjligt att spåra olika immuncelltyper i tid samtidigt interagera med patogener som Mycobacterium marinum, närmaste släkting M. tuberkulos 2, eller Staphylococcus epidermidis, den viktigaste orsakande av biomaterial tillhörande infektion 3-5. Olika smittvägar kan användas i zebrafisk embryon beroende på syftet med studien 6.

En av dessa smittvägar är äggula injektion av bakterierna. Den största fördelen med denna metod jämfört med de andra är att äggula Infectiden kan utföras automatiskt via robot injektion, vilket avsevärt minskar insprutningstiden och möjliggör hög reproducerbarhet av infektionen 7, 8.

Tidigare arbete med användning av zebrafisk som en hög genomströmning in vivo modellsystem för studier av S. epidermidis och M. marinum infektion visade sig vara framgångsrik 7, 8. Detta system har möjlighet att screena för sjukdomsprogression via robot äggula injektion av tidiga embryon och använda fluorescens avläsning som ett mått för bakteriehalten. I överenskommelse med detta begrepp, har denna inställning optimerats och etablerat en mycket effektiv hög genomströmning pipeline med potential att generera ett stort antal homogent infekterade embryon och spåra utvecklingen av infektionen under den tid efter behandling med ett antal föreningar. Med den etablerade inställningen är det möjligt att generera upp till 8.000 synkrona embryon till skärmenför sjukdomsprogression, behandling på detta sätt upp till 2.500 embryon per timme. Embryon är sorterade utifrån deras bakteriehalten med hjälp av ett automatiserat system, se till homogena grupper av infekterade larver. Dessutom, för att validera setup, effekter av referens kända för att förhindra progression tuberkulos hos däggdjur har testats på embryon infekterade med M. marinum E11 stam eller mer virulent M stam 9.

Denna studie beskriver i detalj hög genomströmning pipeline som har inrättats för att kunna generera ett stort antal infekterade embryon och den efterföljande analysen av den bakteriella progression under utveckling och efter förening behandling.

Protocol

1. Bakteriestammar och tillväxtbetingelser

  1. Förbered S. epidermidis Inoculum
    1. Ta flera enskilda kolonier från S. epidermidis stam O-47, som innehåller en pWVW189 härledd mCherry expressionsvektor (De Boer L. opublicerad) från en Luria-Bertani (LB)-agarplatta supplementerat med 10 pg / ml kloramfenikol och kultur över natt vid 37 ° C i 25 ml LB-medium kompletterat med 10 pg / ml kloramfenikol till midlog skede.
    2. Centrifugera 1 ml av kulturen vid 12000 x g under 1 min och därefter tvätta dem 3 gånger med 1 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,3% (v / v) Tween-80.
    3. Mät den optiska tätheten vid 600 nm (OD 600) och späda bakteriesuspensionen till en OD 600 av 0,3 i 2% (vikt / vol) polyvinylpyrrolidon 40 (PVP 40) i PBS. Notera: Ett OD 600 på 0,3 motsvarar 1,0 x 10 8 kolonibildande enheter / ml (cfu / ml).
    4. Förbered M. marinum Inokulat
      1. Ta flera enskilda kolonier från M. marinum-stam M eller E11 innehållande pSMT3-mCherry vektorn stabilt uttrycker mCherry 10 från en Middlebrook 7H10-agarplatta med 10% (vol / vol) Middle OADC anrikning kompletterat med 50 | ig / ml hygromycin och kultur över natt vid 28 ° C i 10 ml Middlebrook 7H9 buljong med 10% (v / v) Middlebrook ADC anrikning kompletteras med 50 mikrogram / ml hygromycin.
      2. Centrifugera 1 ml av kulturen vid 12000 x g under 1 min och därefter tvätta 3x med 1 ml steril PBS med 0,3% (v / v) Tween-80.
      3. Mät OD 600 och späd bakteriesuspensionen till en OD 600 av 0,3 i 2% (vikt / volym) PVP 40 i PBS. Anmärkning: En OD 600 av en motsvarar 1,0 x 10 8 cfu / ml.

    2. Förbered Zebrafish Ägg

    1. Placera högst 70 manliga och 50 kvinnliga vilda type zebrafisk separat in i stora odlingskassen. Anmärkning: Placera honan i den nedre delen av tjocktodlingskassen.
    2. Ta bort separerings nästa dag på morgonen, för att låta zebrafisk starta uppfödning.
    3. Samla äggen vid botten av den stora odlingskassen genom ägget kollektorn i ett 50 ml rör fyllt med ägg vatten (60 | ig / ml omedelbar havet salt).

    3. Injektionsnålar

    1. Erhåll kommersiellt tillgängliga skräddarsydda glaskapillärer nålar med en innerdiameter av 10 | im.

    4. Experimentell Disposition av injektion

    1. Koka 100 ml 1% (w / v) agaros i ägg vatten och svalna tills ca 40 º C. Häll agaros i den automatiserade microinjectors plattan och placera 1.024 brunnar stämpel i agaros. Anm: Plattan är klar att användas när den kyls ner.
    2. På automatiserade microinjector operativsystem klicka på "Kalibrera scen",klicka sedan på '1024 'väl galler och placera agarosplatta i microinjector och kalibrera plattan genom att klicka på skärmen i mitten position väl.
    3. Gå till "nål-menyn" och klicka på "kalibrerings nål".
    4. Fyll injektionsnålen med hjälp av en microloader spets med antingen 10 fil pvp 40 innehåller 100 cfu / nl S. epidermidis eller 30 cfu / nl M. marinum, eller användning pvp 40 som mock injektion.
    5. Placera nålen i den automatiserade mikro-injektor och kalibrera x, y-position genom att sänka eller flytta nålen upp och klicka på skärmen i läget för nålen. Sedan kalibrera Z-position av nålen genom att klicka på skärmen i läget för nålspetsen.
    6. Fördela äggen över agaros gallret med hjälp av en plast överföring pipett, och ta bort överflödigt ägg vatten. Placera agaros nätet i automatiserade microinjector.
    7. Gå till "injection meny "och justera" Insprutningstrycket "inställningen till 200 hPa, 'Insprutningstid" 0,2 sek och "kompensationstrycket" 15 hPa, som korrelerar med 1 nl, vid Femtojet inställningsmenyn.
    8. Klicka på "Injicera alla" för att injicera hela plattan.
    9. Samla äggen efter injektion genom att tvätta dem i en petriskål (92 x 16 mm), med ett maximum av 70 embryon per petriskål, och inkubera vid 28 ° C.

    5. Flow-cytometer analys

    1. Förbered stor partikel flödescytometer enligt tillverkarens anvisningar och fyll provkoppen och omslutande vätska behållare med ägg vatten.
    2. På operativsystem, gå till "PMT"-menyn och använd följande inställningar: 650 V för den "röda" kanal och 0 V för den "gröna" och "gula" kanaler. Gå sedan till "Trösklar"-menyn och använd följande inställningar: "Optical täthet "tröskelsignal: 975 mV (Copas XL värde: 50) och" Time Of Flight "(TOF) minimum till 320 ^ sek (Copas XL värde: 800) i syfte att minska påverkan av skräp.
    3. För analys utan att sortera embryon gå till steg 5,4, för analys och sortering av embryon i en petriskål gå till steg 5,5 eller för analys och sortering embryona in i en 96-brunnars platta gå till steg 5,6.
    4. Placera embryon i provkoppen och klicka på "Start" för att starta analysen. När alla embryon analyseras stoppar analysen genom att klicka på "stopp". Spara informationen genom att klicka på "Store alla". Anm: Alla data lagras som TXT, LMD, DAT, CSV och BSRT filer. Följ protokollet i steg 5.7.
    5. Placera embryon i provkoppen och definiera högst 70 embryon per platta som ska sorteras genom att skriva in 70 i menyn "Sortera". Placera en tom petriskål under sorterare och klicka på "Manuell Sortera". När petri di sh är fylld, spara data genom att klicka på "Store alla". Anm: Alla data lagras som TXT, LMD, DAT, CSV och BSRT filer. Följ protokollet i steg 5.7.
    6. Placera embryon i provkoppen och definiera högst 1 embryo per brunn ska sorteras genom att skriva 1 i menyn "Sortera". Placera en tom 96-brunnar i vänster hållare och klicka på "Fyll tallrik". När den 96-brunnar fylls, spara data genom att klicka på "Store alla". Anm: Alla data lagras som TXT, LMD, DAT, CSV och BSRT filer. Följ protokollet i steg 5.7.
    7. Få TXT-fil för att bearbeta rådata, använd följande data filterinställningar: "Status välj ': 40, och om du använder sorteringsmodulen' Status sort ':. 6 Använd sedan siffrorna från den totala fluorescenssignalen från den" röda "kanal för att beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för medelvärdet. Rita dessa datamängder i bar eller punktdiagram.
    ve_title "> 6. läkemedelsbehandling

    1. Analysera och sortera på 3 dagar efter injektionen (dpi), M. marinum infekterade embryon i två lika stora grupper med hjälp av den stora partikel flödescytometer (steg 5,5). Behandla en grupp med en förening av intresse för dess bärare lösningsmedel och andra med bärarlösningsmedel enbart (kontroll). Applicera liknande behandlingar att håna injicerade kontrollen till test för antibiotika biverkningar.
    2. Upprepa vid 4 och 5 dpi analysen (steg 5,5) och uppdatera ägget vatten eller ägg vatten som innehåller föreningen.

    7. Högupplöst bildbehandling

    1. Bedöva embryona med 0,02% (vikt / volym) buffrad 3-aminobensoesyra-etylester (Tricaine) i ägg vatten 10 minuter före analys.
    2. Förbered ryggradsdjur Automated Screening Technology systemet och den stora partikel Sampler enligt tillverkarens anvisningar.
    3. Markera referensbilder som motsvarar en ålder av embryon från "Imaging - Object211; Detection Setup "-menyn.
    4. Välj hur bilder och orientering som ska göras av ryggradsdjur Automated Screening Technology systemet från "Imaging - Auto lagra bilder meny.
    5. Placera en 96-hålsplatta fylld med embryon (från steg 5,6) i den vänstra hållare av den stora partikel Sampler, och klicka på "Kör tallrik".
    6. När ett embryo upptäcks och korrekt placerade; image huvudet och svansen separat med CLSM använda en 10X vanlig torr mål och sy bilderna i efterhand med hjälp av bildbehandlingsprogram.

Representative Results

Våra resultat visar att hög genomströmning pipeline för att studera S. epidermidis och M. marinum infektion har upprättats och som kan utökas till andra infektionsmodeller. För det första, användningen av den stora odlingskassen (figur 1 A), baserat på den publicerade systemet genom Adatto et al. (2011) 11, gör det möjligt att generera ett stort antal synkrona ägg i form av enstaka händelser som säkerställer en hög kontroll över den lekande processen. Utöver att kunna injicera stort antal embryon i en kort period av tid, en förbättrad version av den tidigare utvecklade automatiserade mikroinjektionssystem 7 användes (Figur 1A). För att bedöma vilken är den bästa utvecklingsstadiet för äggula infektion, injektioner med S. epidermidis och M. marinum utfördes vid alla de olika steg mellan 1 och 512 cellstadiet, enligt den beskrivning som gjorts av Kimmel et al. (1995) 12

Injektioner med 100 cfu S. epidermidis mellan 16 och 128 cellstadiet som den bästa infektionsmönster (Figur 2). Bakterierna frodats inne äggulan i 3 dagar och sprids i kroppen från 3 dpi framåt. Utföra injektioner innan 16 cellstadiet ledde till hög dödlighet från 4 dpi, och injektion efter 256 cellstadiet uppvisade främst bakterietillväxt inne i äggulan med knappt några bakterier spridas i kroppen av embryot. Kvantifiering av bakteriell belastning utfördes genom fluorescensintensitet analys med användning av den stora partikel flödescytometer såsom beskrivits av Veneman et al. (2013) 8 (Figur 3).

Observationer visade att den optimala utvecklingsstadiet för injektion av 30 cfu M. marinum injektion är mellan 16-128 cellstadiet för E11-stammen (figur 4A) och mellan 16-64 cellstadiet med mer virulent M strain (figur 4B). Embryon injiceras vid dessa stadier uppvisade bakterietillväxt inne i gulan och spridning av bakterierna genom embryot (Figur 7). Infektion med båda stammarna i tidigare skeden presenterade ospecifik generaliserad bakterietillväxt som leder de embryon som dör efter 4 dpi. Å andra sidan, i embryon injiceras i senare skeden bakteriell börda begränsades till äggulan.

Därefter försortering med stor partikel flödescytometer (Figur 1B) genererade stora homogena grupper av smittad fisk exklusive eller starkt infekterade embryon (figur 5A och 6A). Efter försortering, M. marinum infekterade embryon behandlades med Rifampicin, en första rad antituberkulos läkemedel. Tidigare studier har visat att behandling med rifampicin i en dos av 200 | aM minskar M. effektivt marinum infektion i zebrafisk 7, 13. Intag advantage av det stora antalet homogent infekterade embryon genereras med hög genomströmning setup, behandling med olika doser utfördes. Embryon som infekterats med M. marinum M-stam och behandlades under 48 timmar med 12, 24, och 200 ^ iM Rifampicin visade att reducera effektivt mykobakteriell infektion på ett dosberoende sätt (Figur 5B). Med tanke på en effektiv reduktion av infektion med användning Rifampicin vid en dos av 200 | iM denna koncentration användes för framtida experiment. I linje med tidigare resultat, studera bakteriell börda progression med hjälp av M. marinum E11 stam en betydande minskning 24 timmar och framåt efter behandling med 200 ^ M Rifampicin observerades (figur 6B).

Vidare, om hög förstoring avbildning krävs av dessa embryon, de kan visas automatiskt i 96-brunnsplattor (figur 1C), varifrån prover kan analyseras med användning avryggradsdjur Automatiserad Screening Technology-system med den stora partikel Sampler monteras på en CLSM.

Den ryggradsdjur Automated Screening Technology systemet med den stora partikel Sampler är ett system som antingen kan monteras på en CLSM eller stereomikroskop. Denna enhet möjliggör lastning av levande eller fasta embryon från en 96-brunnar eller bulkcontainer automatiskt genom ett glas kapillär, och orienterar den framför kameran i önskad vinkel (t.ex. rygg-eller sidled). Bilder av embryot i alla orienteringar kan göras med den ombord kamera eller med en extern CLSM (Figur 7). Embryon kommer senare att överföras i samlingen eller avfallsbehållare.

Figur 1
Figur 1. Mainstream experimentell outline. A) Vuxen fisk sätts samman för att para sig, ägg samlas, i linje in i en agarosplatta och injiceras. B) De injicerade ägg inkuberas vid 28 ° C och ska källsorteras för eventuell läkemedelsbehandling. C) Efterföljande analys av stora partikel flödescytometer och / eller stor partikel Sampler / Vertebrate Automatisk Screening Technology med CLSM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Fastställande av bästa cellstadiet för S. epidermidis äggula injektion. zebrafiskembryon injicerades i äggulan vid olika utvecklingsstadier 1-512 cellstadiet med 100 cfu av S. epidermidis. Embryon injiceras mellan 1 and 8 cellstadiet uppvisade bakterietillväxt i äggulan och hög dödlighet från 4 dpi. Embryon injiceras mellan 16 och 128 cellstadiet uppvisade bakterietillväxt i äggulan och inuti kroppen börjar vid 3 dpi. Embryon injiceras mellan 256 och 512 cellstadiet uppvisade många bakterietillväxt inne i äggulan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Kvantifiering av bakteriell belastning med användning av stor partikel flödescytometer. 100 cfu av S. epidermidis injicerades i äggulan i zebrafisk embryon. A) Upp till 5 dpi, varje dag, grupper om 10 embryon var homogeniserad och guldpläterade direkt, som visar den genomsnittliga exponentiell tillväxt baserad på två biologiska repliker (felstaplar= SEM). B) Stor partikel flödescytometer analys visar den genomsnittliga fluorescenssignalen från icke-injicerade och S. epidermidis injicerade embryon. 30-160 embryon per tillstånd analyserades (felstaplar = SEM), olika bokstäver indikerar statistiska signifikanta skillnader genom en envägs ANOVA följt av Tukey post-hoc-test (P <0,001), ns:. Ej signifikanta skillnader C) Korrelation mellan cfu och genomsnittliga fluorescenssignal av grupper om 10 S. epidermidis infekterade embryon (felstaplar = SEM). Denna siffra har modifierats Veneman et al. (2013) 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Establishment av de bästa cellstadiet för M. marinum äggula injektion. Zebrafish embryon injicerades på alla de olika utvecklingsstadier 1-512 cellstadiet med 30 cfu av M. marinum E11 och M-stammen. A, B) Embryon injiceras 1-8 cellstadiet uppvisade liknande spridning och dödlighet med båda stammarna. A) Embryon injiceras mellan 16-128 cellstadiet med E11-stammen visade bildandet av granulom och systemisk infektion medan de injicerade 256-512 cellstadiet hålls bakterie börda i äggulan. B) Embryon injiceras mellan 16-64 cellstadiet med M-stammen visade bildandet av granulom liknande strukturer och systemisk infektion medan de injiceras 128-512 cellstadiet hålls bakterie börda i äggulan . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 Figur 5. Behandling av M. marinum akut infektion med en första linjens läkemedel mot tuberkulos. Embryon injiceras mellan 16-64 cellstadiet med 30 cfu av M. marinum M stammen kördes genom den stora partikel flödescytometer vid 3 dpi ska sorteras i två grupper Kassera de icke-och / eller mycket infekterade embryon. A) Fluorescens enskilda embryon i båda grupperna. B) Embryon behandlas med rifampicin (RIF ) under 48 h vid doser på 12, 24 och 200 uM analyserades vid 4 dpi; deras bakteriehalten har minskat avsevärt. C) Representativa copas profiler av embryon som behandlades med DMSO och Rifampicin vid doser på 12, 24 och 200 | iM under 24 timmar. Bakteriell belastning och fördelning indikeras av de röda topparna. Blå linjen representerar profilen för det element sorteras (4 dpf zebrafisk embryo) av copas. 60-90 embryon per tillstånd analyserades. Varje datapunkt representerar ett enskilt embryo. Värden anges som medelvärde ± SEM. ns: inte betydande skillnader. Analys av statistisk signifikans för skillnader utfördes av en envägs ANOVA följt av Tukeys posthoc test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Behandling av M. marinum kronisk infektion med en första rad antituberkulos läkemedel. Embryon injiceras mellan 16-64 cellstadiet med 30 cfu av M. marinum E11 stammen kördes genom den stora partikel flödescytometer vid 3 dpi ska sorteras i två grupper Kassera de icke-och / eller mycket infekterade embryon. A) Fluorescens enskilda embryon i båda grupperna. B) Embryon som behandlas med rifampicin (RIF) vid 200 ^ M under 4 dagar analyserades som visar en betydande minskning av bakteriehalten efter 1 dags behandling. 90 embryon per tillstånd analyserades. Värden anges som medelvärde ± SEM. Olika bokstäver indikerar signifikanta skillnader mellan tidpunkter för samma behandling. * Anger signifikanta skillnader med kontrollgrupp. ns: inte betydande skillnader. Analys av statistisk signifikans av skillnader utfördes genom en envägs ANOVA följt av Tukeys posthoc test. (P <0,05). Figur B) har modifierats Spaink et al. (2013) 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/>
Figur 7. Resultat av M. marinum E11 äggula injektion avbildas med Vertebrate Automatiserad Screening Technology och CLSM. Confocal Z stacken (sytt 3 bilder) av en 5 dpi FLI1-egfp 14 embryo. A) Live embryo visar spridning av M. marinum E11 bakterier (röd) i hela kroppen. B) Fast 5 dpi fli-egfp embryo visar M. marinum E11 bakterier (röd) i hela kroppen co-lokalisering med leukocyter (ljusblå) upptäcks av L-plastin immunfärgning 15.

Discussion

Den hög genomströmning metod som beskrivs i detta dokument ger en snabb och kostnadseffektiv pipeline för att avskärma stort antal fisk embryon och larver med olika typer av infektioner. Med hjälp av stora odlingskassen istället för traditionella enkla eller familj avelstankar lättade kontrollen av lekande processen och generering av större antal synkrona ägg. Med en förbättrad version av den automatiserade mikroinjektionssystem 7, är det möjligt att injicera upp till 2500 ägg nästan alla i samma cellstadiet inom en timme. Med dessa uppdateringar och förbättrad programvara är det möjligt att injicera fler ägg än vad som tidigare var möjligt, som kan användas för att utföra stora läkemedels skärmar med bakteriespridning som läste upp. Denna metod är emellertid fortfarande begränsad till äggula injektion, andra injektionsvägar beskrivs exempelvis av Benard et al. (2012) 6, kommer förhoppningsvis att införlivas i den automatiserade mikroinjektionssystem i en nära framtid.

<p class = "jove_content"> Även om dessa metoder är riktmärke för screening av zebrafisk, skulle det vara användbart för applikationer med andra fiskarter också. Till exempel har den karp indikerats att ha fördelar för drogskärmar. Liksom zebrafisk, ägg och scenembryon tidigt från karp är transparenta men med den största fördelen med dess stora spawn storlek hundra tusen ägg och tillgängligheten av inavlade linjer som ger en mer konstant genetisk bakgrund 16.

Analysen av stora mängder infekterade embryon sker med hög genomströmning stor partikel flödescytometer. Den här enheten kan sortera analyserade embryon i flera brunnar eller en petriskål vilket gör den speciellt lämplig för att testa ett stort antal föreningar. Om det krävs ett högre imaging upplösning, än installationen är anpassad så att den stora partikel flödescytometerns teknik kan användas för pre-screening och därefter analysera proverna på ett medium genomsätta på en högre upplösning. Detta kan göras med hjälp av ryggradsdjur Automated Screening Technology 17, 18. Den här enheten kan automatiskt samla in levande eller fasta embryon mellan 2 och 7 dagar efter befruktningen från en flerbrunnsplatta eller bulk container, bild 360 ° genom en kapillär med hjälp CLSM eller stereomikroskop och avyttra igen i 2 bulkcontainrar som möjliggör manuell sortering av embryon baserade på de mikroskopiska bilderna. Framtida förbättringar kommer att möjliggöra sortering av embryot efter avbildning i flera brunnar, vilket gjorde det möjligt att skärmen automatiskt stort antal enskilda embryon över tiden med CLSM. Om man antar att i framtida tillämpningar ryggradsdjur Automated Screening Technology-systemet kan också kopplas till den stora partikel flödescytometer teknik utan behov av föregående dispense larver i flera brunnar, kommer att leda till en mer avancerad sortering.

Detta dokument beskriver etableringen ettd optimering av en hög genomströmning setup för att studera S. epidermidis och M. marinum infektion som en modell för läkemedelsforskning. Det visar att resultatet av dessa bakterier injiceras i gulan beror på utvecklingsstadiet av äggen vid tiden för injektion. Injektion av M. marinum E11 vid 16-128 cellstadiet eller M töjningen vid 16-64 cellstadiet leder till samma infektion mönster som kaudalvenen injektion 2, 6. Denna inställning är dock inte begränsad till spridningen av endast bakteriella patogener. Det visades tidigare att det är möjligt att robot injicera lösningar som innehåller DNA, RNA eller morpholinos för genmodifiering, över-uttryck och gen knock-down studier, respektive 13. Vidare visade det sig att denna installation är också användbara för studier av cancercellproliferation och migration. Därför denna rörledning uppvisar en mångsidig metod för hög genomströmning skärmar av en variation av signalmekanismer inom ramenav medfödd immunitet, appliceras på infektionssjukdomar och utvecklingen av cancer. Dessa skärmar kan kombineras med andra för medicin upptäckt men också med analys av eventuella toxiska effekter av identifierade gällande droger.

Disclosures

JS är ägare av Life Science Methods BV som tillverkar instrument som används i den här artikeln.

Acknowledgements

Vi är tacksamma för Leonie de Boer och Bas Zaat (Academic Medical Centre) för att förse oss med S. epidermidis O-47-stammen. Vi tackar Rico Bongaarts, Francis Smet och Angela Comas (Union Biometrica) för att få hjälp och råd med Copas XL och VAST BioImager analys. Vi tackar Davy de Witt, Ulrike Nehrdich, och Laura van Hulst för fisk fastighetsskötsel, och andra kollegor från Leiden University för bra diskussioner. Denna forskning är en del av projektet P5.03 IBIZA av forskningsprogrammet för biomedicinska material institutet, som delvis finansieras av det nederländska ekonomiministeriet, och Smart Mix Program (NWOA_6QY9BM) i Nederländerna ekonomiministeriet och av Nederländerna Ministeriet för utbildning, kultur och vetenskap. Ytterligare stöd erhölls från EU-projektet ZF-Hälsa (FP7-hälsa-2009 till 242.048), och RMJ stöddes av Marie Curie-stipendium som erfaren forskare i EU-nätverket för grundutbildning FishForPharma (PITN-GA-2011-289209). SJR fått finansiering från Innovative gemensamma företaget för initiativet enligt bidragsavtal nr 115337, av vilka resurser som består av ekonomiska bidrag från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) och EFPIA företag i natura contribution.The författare ytterligare bekräftar ekonomiskt stöd från Leiden University fonden (LUF) för robotteknik och från Cyttron, i Besluit Subventioner Investeringen Kennisinfrastructuur program, som i sin tur stöds ekonomiskt av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning för avbildning anläggningar. De Copas systemet Förvärvet har delvis stöd av avdelningen för jord-och biovetenskap (ALW) med ekonomiskt stöd från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO, 834.10.004).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Middlebrook 7H10 agar BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 262710
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 271310
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211886
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211887
LB agar Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L5542 Multiple suppliers
LB broth Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L3022 Multiple suppliers
Chloramphenicol Bio-connect, Huissen, the Netherlands 16785.03 Multiple suppliers
Hygromycin Bio-connect, Huissen, the Netherlands 25966.01 Multiple suppliers
Tween-80 Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA P1754 Multiple suppliers
Polyvinylpyrrolidone40 Calbiochem, San Diego, California, USA 529504 Multiple suppliers
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA A5040
Agarose Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands S103 Multiple suppliers
Instant ocean sea salt Sera Marin, Heinsberg, Germany 5460
iSPAWN Techniplast, Buguggiate, Italy iSPAWN
Automated microinjection system Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands Automated microinjection system
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA COPAS XL
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA VAST BioImager
LP Sampler Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA LP Sampler
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SL
Injection needle 10 µm inner diameter Qvotek, Mississauga, Canada

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
  3. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
  4. Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
  5. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
  6. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (2012).
  7. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  8. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  9. Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
  10. Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
  11. Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
  12. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  13. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  14. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
  15. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  16. Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
  17. Chang, T. -Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
  18. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics