La glutammina Flux Imaging Utilizzando sensori geneticamente codificato

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

In questo articolo verrà illustrato come monitorare le dinamiche di glutammina in cellule vive usando FRET. I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi per i sensori di glutammina geneticamente codificati.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Besnard, J., Okumoto, S. Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors. J. Vis. Exp. (89), e51657, doi:10.3791/51657 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Una enorme varietà di tali sensori per molecole biologiche si sono resi disponibili negli ultimi 15 anni, alcuni dei quali divenne strumenti indispensabili che vengono utilizzati di routine in molti laboratori.

Una delle interessanti applicazioni di sensori geneticamente codificati è l'uso di questi sensori nelle indagini processi di trasporto cellulari. Proprietà dei trasportatori come cinetica e specificità di substrato possono essere studiati a livello cellulare, fornendo possibilità di cellula di tipo analisi specifiche delle attività di trasporto. In questo articolo, vedremo dimostrare come la dinamica dei trasportatori possono essere osservate con sensore di glutammina geneticamente codificato come un esempio. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi.

Introduction

A causa di notevoli progressi nelle tecnologie che consente l'esame del trascrittoma e proteoma a livello cellulare, ora è diventato chiaro che la biochimica e la conseguente flusso di metaboliti e ioni sono altamente tipo cellulare specifico. Ad esempio, nel fegato di mammiferi, degradazione glutammina sequenziale e sintesi vengono effettuate simultaneamente dalle cellule periportale e cellule perivenose rispettivamente, alimentando ammonio al ciclo dell'urea nel primo tipo di cellula consumando eccesso di ammoniaca in quest'ultimo 1-3. In alcuni casi, una significativa eterogeneità biochimica viene rilevato anche in un unico "tipo cellulare" 4, 5. Oltre a questa particolarità spaziale, i livelli cellulari di metaboliti e ioni sono altamente dinamici (per esempio, molecole di segnalazione come Ca 2 + e nucleotidi ciclici). I modelli spazio-temporali dei metaboliti e ioni giocano spesso un ruolo critico nella trasduzione del segnale. MONITORAGGIO dinamiche cellulari di metaboliti e ioni, tuttavia, pongono sfida unica. In molti casi la variazione delle concentrazioni sono rapido e transitorio, esemplificato dal caso di molecole di segnalazione come Ca 2 +, che decade entro ~ 20 msec in spine dendritiche 6. Inoltre, compartimentazione di vie biochimiche all'interno e tra le cellule rende difficile quantificare le dinamiche di metaboliti e ioni con estrazione e cromatografia su colonna / tecniche di spettrometria di massa.

Sensori geneticamente codificate molecole biologiche sono ora ampiamente utilizzati a causa della alta risoluzione spazio-temporale che permette lo sperimentatore di studiare dinamica molecolare di breve durata e / o compartimenti (recensiti 7, 8). Questi sensori geneticamente codificati possono grossolanamente essere suddivisi in due categorie; sensori basati sull'intensità e sensori ratiometic. Sensori basati intensità, in genere costituiti da un dominio di legame e l'influenzaproteina orescent (PQ), e il legame al dominio di legame soluto cambia l'intensità fluorescente. Sensori Ratiometic, d'altra parte, spesso sfruttano Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tra due PQ che fungono da coppia FRET. Questi sensori sono costituiti da un dominio di legame e due PQ, e il legame soluto induce la variazione di efficienza FRET tra i due PQ. Un gran numero di sensori per biologicamente importanti metaboliti e ioni sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni 8, 9.

Una delle eccitante possibilità offerta da tali sensori geneticamente codificati è il loro uso nell'analisi ad alta risoluzione di processi di trasporto di membrana, che in precedenza non era facile individuare a livello cellulare. Sensori geneticamente codificati facilitano l'analisi dei meccanismi di trasporto come specificità di substrato e pH dipendenza 10, 11. Inoltre, in combinazione con i res geneticheONTI come la biblioteca di RNAi costruisce per organismi modello, è ora possibile effettuare ricerche genome-wide per i processi di trasporto innovativi che utilizzano sensori geneticamente codificati. Infatti, l'uso di organismi geneticamente codificato cavo del sensore alla scoperta dei trasportatori in precedenza non caratterizzate in più casi 12, 13.

Recentemente, il nostro laboratorio ha sviluppato una serie di sensori basati su FRET per la glutammina. Abbiamo dimostrato che i livelli di glutammina cellulare può essere osservata con tali sensori FRET glutammina 10. Questi sensori sono costituiti da un donatore FRET (mTFP1) inserito in un batterica proteina legante glutammina glnH, e un accettore FRET (venus) al C-terminali di glnH (Figura 1). FRET efficienza di questi sensori diminuire in seguito al legame di glutammina, con conseguente diminuzione del rapporto di intensità accettore / donatore. Belle regolazione dei processi di trasporto glutammina è importante nei processi biologici quali neurotransmissione 14, 15 e la manutenzione di ciclo dell'urea nel fegato 1, 16, 17.

Qui vi mostriamo la metodologia di analisi delle attività di trasporto con sensori FRET per la glutammina, con un ampio campo di microscopio a fluorescenza set-up. Lo scopo degli esperimenti mostrato qui di rilevare attività trasportatore in una singola cella ed esaminare specificità di substrato di un trasportatore transitoriamente espressa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparazione del campione

Nota: In molti casi gli esperimenti di perfusione lavare via una porzione significativa di cellule, che può diventare un problema frustrante. Sebbene non necessario per tutte le linee cellulari, superfici di vetro coperchio rivestimento con poli-L-lisina (aggiungere 1,0 ml/25 cm 2 di soluzione 0,01% in superficie, incubare> 5 min, lavare due volte con acqua di grado coltura cellulare, e secco l'armadio biosicurezza) migliora l'adesione cellulare. Inoltre, essere consapevoli del livello di biosicurezza (BSL) della linea cellulare utilizzata, e seguire la procedura operativa standard approvato dall'ufficio di salute e sicurezza ambientale locale. In questo esperimento, le cellule COS7 stati usati a causa della bassa attività di trasporto glutammina endogena (vedi Figura 4).

  1. Seme cellule COS7 a ~ 70-80% di confluenza in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + siero di vitello cosmica 10% e 100 U / ml di penicillina / streptomicina, sia su sterili 25 millimetri vetrini coprioggetto posti in coltura da 6 pozzettipiatto o 8 pozzetti vetrini con fondo di vetro. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità per 24 ore.
  2. Scambiare il mezzo di crescita per DMEM siero di vitello cosmici +10% (antibiotici), secondo il protocollo del produttore. Grow O / N a 37 ° C, 5% CO 2 al 100% di umidità.
  3. Aggiungere 0,4 mg ciascuna di DNA plasmidico codificante il sensore glutammina (pcDNA3.1, portando sensore FLIPQTV3.0 sotto promotore CMV 10) e il ASCT2 mCherry-tag 10 a 50 ml terreni privi di siero (OPTI-MEM) e mescolare delicatamente.
  4. Aggiungere 1 ml di reagente di trasfezione a 50 ml terreni privi di siero. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  5. Mescolare le due soluzioni contenenti DNA (fase 1.3) e reagente di trasfezione (passo 1.4) e incubare per 20 min.
  6. Aggiungere delicatamente il reagente di trasfezione sulla parte superiore delle cellule e mescolare delicatamente a dondolo camera. Incubare per 24 ore a 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità.
  7. Dopo 24 ore, scambiare il mezzo di DMEM + 10% Cosmic Calf Serum(CCS) + 100 unità di penicillina / streptomicina.
  8. Le cellule vengono esposte 48-72 ore dopo la trasfezione.

2. Esperimento perfusione

Nota: Per le cellule COS7 utilizzati in questo esperimento, i media di perfusione e la camera sono stati mantenuti a temperatura ambiente e la concentrazione di CO 2. Tuttavia, se le cellule in uso richiedono una temperatura più alta e CO 2 di controllo della concentrazione per la sopravvivenza, palco microscopio riscaldamento e / o una camera ambientale dovrebbe essere usato.

  1. Preparare perfusione tampone AF (Vedere elenco dei materiali). Fissare rubinetti a 50 ml siringhe, chiudere i rubinetti poi riempirli con le soluzioni di perfusione. Aprire il rubinetto per un breve periodo ad occupare lo spazio di testa del rubinetto con il tampone.
  2. Accendere il 8 canali, sistema di perfusione a gravità con una matita perfusione, e quindi selezionare "Modalità manuale" sotto Selezionare l'opzione Function. Posizionare un contenitore di rifiuti sotto la matita perfusione.
  3. Manualmenteattivare le porte premendo i numeri corrispondenti e riempire i tubi con siringa da 10 ml contenente acqua, e poi chiudere la porta. Una volta che le porte sono riempite con acqua, impostare le siringhe contenenti tamponi AF sulla porta 1-6 del sistema di perfusione, e quindi aprire i rubinetti. Aprire nuovamente le porte per sostituire l'acqua nel tubo con gli ammortizzatori. La portata deve essere di circa 0,8 ml / min.
  4. Premere annullare una volta sul controller perfusione per tornare al menu "Select Function". Alterna l'opzione "Modifica Programmi", quindi digitare nel protocollo di perfusione indicato nella Tabella 1. Salvare il programma di perfusione.
  5. Prendete le cellule fuori dell'incubatore. Lavare due volte con il buffer di perfusione, e quindi impostare le celle sul palco. Collegare il sistema di perfusione alla camera. Se viene utilizzata una camera aperta, impostare un'altra pompa che rimuove la soluzione di perfusione dalla camera.
  6. Aprire il software Slidebook. Inizia una nuova diapositiva.
    Nota: L'seguente procedura è specifica per software Slidebook, ma altri software come MetaFluor e Nis-elemento può essere utilizzato anche per il tipo di rappresentazione qui descritto. Teoricamente esperimenti possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi software che permette l'imaging time-course, e le sequenze di immagini possono essere analizzati post-sperimentale utilizzando software come ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) o Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Tuttavia, il software che consente il monitoraggio in tempo reale di rapporto accettore / donatore è molto utile.
  7. Montare il vetrino sul palco microscopio a fluorescenza. Trova le cellule co-esprimono il sensore e ASCT-mCherry utilizzando appositi set di filtri (vedi elenco dei materiali) con la funzione "FOCUS". Regolare il guadagno facendo clic sulla scheda "Camera" e facendo scorrere la barra di scorrimento sotto "guadagno". Inoltre, regolare l'impostazione filtro a densità neutra dal menu a discesa filtro a densità neutra. Nota: Se il cubo del filtro non include un filtro occhio, non usare i pezzi oculari da Short-lunghezza d'onda di luce di eccitazione è dannoso per gli occhi. Usare lo schermo del computer per individuare le celle invece.
  8. Acquisire immagini di cellule with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (I filtri sono specificati nell'Elenco dei materiali). Fare clic su "Acquisizione Immagine", quindi nella finestra di acquisizione, specificare i filtri che stanno per essere utilizzati. Fare clic sul pulsante "TEST" per regolare il tempo di esposizione digitando il tempo di esposizione desiderato nella casella accanto alle impostazioni del filtro. Nota: Tutti e tre i canali devono essere esposti per la stessa lunghezza. Quando si regolano i parametri di imaging, prendere il cambiamento efficienza FRET previsto e piega aumentare in considerazione: per esempio, se l'efficienza FRET si prevede di salire due volte durante l'esperimento, i parametri di imaging devono essere regolatiin modo che l'intensità di donatori ex Acceptor em Allo stato di riposo deve essere <50% del valore massimo che può essere registrato dallo strumento, in modo che il canale non si saturi durante l'esperimento. Segnale dalle cellule marcate dovrebbe essere almeno tre volte superiore a quello della regione di sfondo.
  9. Prelievo di una regione di interesse utilizzando lo strumento regioni del software. In alternativa, una funzione software per selezionare i pixel sopra certa intensità può essere utilizzato, e quindi convertito in regioni. Per effettuare questa operazione, fare clic su Maschera - Segment, quindi spostare la barra di scorrimento per evidenziare le aree desiderate.
  10. Selezionare "time lapse" nella casella Tipo di acquisizione, quindi specificare l'intervallo (10 sec in questo esperimento) e punti di tempo per l'esperimento.
  11. Disegnare una regione in uno spazio senza alcuna cellule fluorescenti. Questa area è utilizzata per la sottrazione del fondo. Fare clic destro regione disegnata, e quindi impostare come sfondo. Nota: Idealmente, le cellule che non sonot esprimendo i sensori deve essere utilizzata come area di sfondo in considerazione sia la autofluorescenza e la fioritura sfondo rilevato dalla fotocamera. Se le suddette cellule sono disponibili nel campo visivo, almeno una regione senza le celle deve essere utilizzato per spiegare la fluorescenza di fondo.
  12. Selezionare il programma desiderato sotto "Select Function - Eseguire programmi" l'opzione. Alternare al programma memorizzato (vedere la fase 2.3), e poi ha colpito INVIO sul controller perfusione. Ora il programma viene caricato, e premendo un tasto qualsiasi inizierà la perfusione.
  13. Garantire perfusione e l'esperimento di imaging avviare Allo stesso tempo facendo clic sul pulsante "Start" nella finestra di acquisizione al tempo stesso come la pressione di un tasto sul controller perfusione.
    Nota: Si consiglia di registrare il tempo di valutazione in cui sono state scambiate le soluzioni (questo può essere fatto utilizzando funzione "Note", che si trova all'interno della scheda di acquisizione).
  14. Eseguire la stessa perfusione protocollo USIng cellule esprimenti un sensore che dovrebbe essere saturi o non associati a condizione sperimentale.
    Nota: Qui, FLIPQTV3.0_1.5μ, che è saturo condizione sperimentale, viene usato come controllo, Figura 6 Tali esperimenti di controllo sono necessari per confermare che il cambiamento efficienza FRET è dovuta alla variazione effettiva del substrato e non. a causa del cambiamento di altri parametri quali pH cellulare.

3. Post-esperimento di analisi

  1. Esaminare se si è verificato deriva campione durante l'esperimento. Disegnare regioni di interesse (ROI) s sull'immagine scattata a timepoint 0, quindi spostare la barra di scorrimento nella parte superiore della finestra di imaging e verificare se le cellule cadono le ROI nelle immagini scattate nel corso della sperimentazione.
  2. Se sì, allora utilizzare la funzione di tracking per correggere la deriva in primo luogo, la creazione di maschere intorno alle cellule selezionando Mask - Segment, quindi far scorrere la linea che specifica il taglio di HIGhlight le regioni contenente cellule. Traccia le regioni cliccando Mask - tracciamento di particelle - il monitoraggio di base delle particelle.
  3. Ri-disegnare il ROI e lo sfondo regione quando necessario.
  4. Esportare l'intensità media dei ROI nel corso dell'esperimento. Fare clic su Statistiche - Esporta - Dati Rapporto / timelapse.
  5. Quando l'efficienza FRET e la quantificazione della concentrazione del substrato non è necessario, tracciare l'andamento temporale del rapporto di intensità (Donor ex Acceptor em, / donatori ex donatori em) come proxy della dinamica del substrato. Per determinare la concentrazione citosolica, calcolare il massimo e minimo cambiamento rapporto (ossia alla saturazione e assenza del substrato, rispettivamente), Ar max - Ar min, mediante regressione non lineare di Δratio (Ar) con la seguente equazione:
    Ar = [S] / (K d + [S]) x (Ar min Ar) + Ar min
    dove [S] è la concentrazione del substrato nel citosol. Utilizzando i Ar max - min valori Ar ottenuti, la saturazione (S) del sensore in un dato Ar è calcolato come
    S = (Ar - Ar min) / (Ar max - min Ar)
    S può inoltre essere convertito in concentrazione del substrato [S] con la seguente equazione:
    S = [S] / (K d + [S])
    Nota: l'intensità del canale em Acceptor ex Acceptor dovrebbe essere anche tracciato di esaminare se la condizione sperimentale influenzato la fluorescenza del accettore direttamente.
  6. Quando si osserva una deriva della linea di base a causa di fotometabolismo, eseguire una correzione al basale. Per fare questo, tracciare le intensità di donatore e accettore nel tempo (Figura 5A). Poi identificare i punti temporali utilizzati per ªe basale, secondo il ritardo nel sistema di perfusione e l'attività di trasporto del particolare cellula (Figura 5B).
  7. Calcolare un raccordo polinomio che meglio descrive la linea di base. Poi, normalizzare l'intensità grezzo da ogni tempo di valutazione al basale (Figura 5C). Calcolare il rapporto di intensità (Donor ex Acceptor em, / donatori ex donatori em) dalle intensità donatore e accettore normalizzati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tipici esperimenti time-corso sono rappresentati in Figura 2. In questi esperimenti, FRET sensori di glutammina con affinità di 8 mm (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A e 2B) e 100 micron (μ FlipQTV3.0_100 C e D) sono stati co-espressi con un obbligatorio scambiatore amminoacido ASCT2 18 in cellule COS7 10. Afflusso di glutammina viene rilevato come variazione rapporti di intensità di fluorescenza tra il donatore (mTFP1) e l'accettore (venus) (Figura 2A e 2C). Efflusso di glutammina in presenza di un altro substrato (Ala) è chiaramente dimostrato anche in questi esperimenti. Con entrambi i sensori, intensità di fluorescenza normalizzate cambiano reciprocamente (cioè, l'intensità donatore sale come l'intensità accettore scende, Figura 2B e 2D) in presenza di substrato, che suggeriscono che il cambiamento rapporto osservato sono infatti dovuti to la variazione di efficienza FRET. Questi esperimenti mostrano che le concentrazioni di glutammina in queste cellule oscillano molto dinamicamente condizione sperimentale; dalla gamma di rilevamento di 100 micron sensore alla concentrazione di quasi saturazione del sensore mm 8.

Specificità di substrato di trasportatori possono essere esaminati usando sensori, mostrato nella Figura 3. In questi esperimenti le cellule sono state pre-caricati con glutammina, e poi vari amminoacidi sono stati aggiunti al perfusato extracellulare esaminare se tali amminoacidi possono indurre glutammina efflusso. Come previsto, i substrati ASCT2 (Ala, Ser, Cys, Thr, D-serina) indotta efflusso glutammina (Fig. 3A), mentre gli amminoacidi non-substrato (Pro, Sua, Lys) non ha (Fig. 3B), corroborando con Studi precedenti 18. Solitamente, specificità di substrato viene misurata mediante saggi di competizione utilizzando un substrato marcati con isotopi Radio mescolato con substrato concorrenti, Che è piuttosto laborioso e richiede una popolazione di cellule che sono uniformemente esprimendo il trasportatore da studiare. Imaging ottico esemplificato qui offre un approccio alternativo.

Quando non FRET efficienza modifiche sono osservate dopo l'aggiunta del substrato, diverse ragioni potrebbero essere considerati. Una possibile ragione è la capacità di assorbimento basso per il substrato in prova e / o alte attività di enzimi che mantengono la concentrazione nelle cellule. Ad esempio, glutammina variazione di concentrazione era minimo in cellule COS7 che non esprimono ASCT2 trasportatore sotto la condizione verificata, anche se questa linea cellulare può chiaramente crescere nel mezzo in cui glutammina nella fonte principale di azoto (Figura 4). Inoltre, se l'affinità del sensore è troppo alta o troppo bassa rispetto alla concentrazione intracellulare, la maggior parte delle proteine ​​sensore resterà costitutivamente associato o non associato rispettivamente; quindi nessun cambiamento FRET efficienza sarà detected.

Figura 1
Figura 1. Configurazione di un sensore FRET glutammina. (A) Open (ciano) e chiuso (giallo) conformazione della glnH, glutammina legame con le proteine ​​da E.coli. La posizione in cui è inserito mTFP1 è segnato in magenta. (B) rappresentazione schematica di sensori FLIPQTV_3.0.

Figura 2
Figura 2. In vivo misurazioni glutammina utilizzando FLIPQ-TV3.0_8m e sensori 100μ. (A) Il rapporto venus/mTFP1 di cellule COS7 co-esprimono sensore FLIPQ-TV3.0_8m e ASCT2-mCherry. mCherry tag è stato usato per identificare le cellule che esprimono il trasportoer senza interferire i canali di emissione mTFP1 o Venere. Le cellule sono state perfusi con tampone HEPES tamponata di Hank (pH 7,35). Timepoints quando glutammina extracellulare (rosso) e alanina (blu) è stato aggiunto al supporto perfusione sono indicati come scatole sopra il grafico. Linee continue e tratteggiate rappresentano due singole celle misurati nello stesso esperimento. (B) Le intensità di donatore (mTFP1) e accettore (Venere) canali nell'esperimento in (A). I valori sono stati corretti per photobleaching e normalizzato al basale. (C) e (D) Un esperimento simile come in (A) e (B), eseguita con cellule COS7 esprimenti il sensore FLIPQ-TV3.0_100μ. (Figura modificata da 10).

Figura 3
Figura 3. Eliminazione di glutammina cellulare tttraverso il trasportatore ASCT2 in presenza di aminoacidi esterni, è visualizzato mediante il sensore FLIPQ-TV3.0_8m. (A) citosolico glutammina viene esportata dall'aggiunta di extracellulare Ala, Ser, Cys, Thr, e D-ser. Gli intervalli quando glutammina extracellulare (caselle rosse) o di altri aminoacidi (scatole blu) sono stati aggiunti ai mezzi di perfusione vengono indicate come caselle sopra il grafico. (B) aggiunta di Pro, Lys, Sue (scatole nere) non altera la concentrazione di glutammina citosolica , mentre l'aggiunta di Ala (scatole blu) promuove l'esportazione di glutammina. Linee continue e tratteggiate rappresentano due singole celle misurati nello stesso esperimento. Tutti gli aminoacidi sono stati aggiunti a 5 mM concentrazioni esterne. (Figura è stato originariamente pubblicato in 10).

Figura 4
Figura 4. Il rapporto venus/mTFP1 di cellule COS7 expressing sensore FLIPQ-TV3.0_8m (A) e sensore 100μ (B). Le cellule sono stati perfusi con tampone di Hank HEPES-buffered. Timepoints quando glutammina extracellulare (5 mM) è stato aggiunto al supporto perfusione sono indicati come scatole rossi sopra il grafico. Linee continue e tratteggiate rappresentano due singole celle misurati nello stesso esperimento.

Figura 5
Figura 5. Correzione per photobleaching. (A) intensità prime provenienti da due celle rappresentate in Figura 2A e 2C. (B) Datapoints che sono stati selezionati per il calcolo delle linee di base. Adattamento delle curve polinomio sono mostrati in figura. (C) intensità dei canali visualizzati in A, normalizzato contro la base calcolata in B. Il set di dati utilizzato in questa figura è identical a quella mostrata nella Figura 2A e 2C.

Figura 6
Figura 6. Misurazioni in vivo di glutammina con sensore FLIPQ-TV3.0_1.5m. (A) Il rapporto venus/mTFP1 di cellule COS7 co-esprimono sensore FLIPQ-TV3.0_1.5m e ASCT2-mCherry. tag mCherry è stato utilizzato per identificare le cellule che esprimono il trasportatore senza interferire i canali di emissione mTFP1 o Venere. Le cellule sono state perfusi con tampone HEPES tamponata di Hank (pH 7,35). Timepoints quando glutammina extracellulare (rosso) e alanina (blu) è stato aggiunto al supporto perfusione sono indicati come scatole sopra il grafico. Linee continue e tratteggiate rappresentano due celle singole misurati nello stesso esperimento. (B) Le intensità di donatore (mTFP1) e accettatore (venus) canalinell'esperimento in (A). I valori sono stati corretti per photobleaching e normalizzato alla linea di base.

Tempo (min) Soluzione A Soluzione B Soluzione C Soluzione D Soluzione E Soluzione F
0 valvola ON
2 valvola off valvola ON
4 valvola ON valvola off
6 valvola off valvola ON
8 valvola ON valvola off 10 valvola off valvola ON
12 valvola ON valvola off
14 valvola off valvola ON
16 valvola ON valvola off
18 valvola off valvola ON
20 valvola ON valvola off
22 valvola off valvola ON
24 valvola ON valvola off 26 valvola off valvola ON
28 valvola ON valvola off
30 valvola off valvola ON
32 valvola ON valvola off
34 valvola off

. Tabella 1 Esempio di protocollo perfusione utilizzato in questo esperimento Soluzione A:. 9.7 g di sale HANK (H1387), 0,35 g NaHCO3, 5,96 g HEPES a 1 L pH regolato a 7,35 con NaOH Soluzione B:. Soluzione A + 0,04 mM Gln Soluzione C:.. Soluzione A + 0,2 Gln mM Solution D:. Soluzione A + 1 Gln mM Soluzione E:. Soluzione A + 5 Gln mM Soluzione F: Soluzione A + Ala 5 mM

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il successo di esperimenti di imaging dipende da alcuni fattori critici. Uno di questi fattori è l'affinità di sensori utilizzati, come discusso sopra. Concentrazione assoluta del substrato nel compartimento subcellulare di interesse, tuttavia, è spesso sconosciuta. Pertanto si consiglia di provare diversi sensori con affinità sfalsati per trovare quello che funziona meglio sotto la condizione sperimentale desiderato. Ad esempio, nel nostro caso abbiamo trasfettato cellule COS7 con sensori di glutammina con 1.5μ, 100μ, 2m e 8m (Figura 3 e dati non mostrati).

Un altro fattore importante è il livello di espressione di proteine ​​sensori. Il livello di espressione richiesto per il rilevamento varia, esperimenti, ad esempio, quando un breve evento (ad esempio, potenziale d'azione singola) bisogna osservare un livello di espressione superiore potrebbe diventare necessario 19. Pertanto, nella maggior parte dei casi, il livello richiesto deve essere empirically determinato. Se il bersaglio esiste in concentrazione molto bassa nella cella, perturbazione dei processi endogeni causa dell'esaurimento bersaglio può diventare un problema 20. Un test indipendente per valutare tale possibilità, se disponibile, è quindi desiderabile. Negli esperimenti mostrati in questo articolo, l'espressione della proteina guidato dal promotore CMV è risultato sufficiente. In situazioni in cui devono essere utilizzati promotori con attività molto più deboli, adeguamenti per aumentare l'intensità del segnale potrebbero rendersi necessari. Ad esempio, compromesso tra l'intensità del segnale e fotometabolismo durante l'esposizione deve essere raggiunto. Oltre al tempo di esposizione, fattori come ad esempio la luminosità dei fluorofori, cambiamento intensità massima del sensore, binning, e la sensibilità di telecamera CCD possono essere modificate per aumentare l'intensità del segnale.

Quando nessuna variazione di rapporto si osserva nella condizione sperimentale anche se i suddetti due criteri sono suscettibili diessere soddisfatte, è possibile che l'omeostasi cellulare per il metabolita o ione dato è sufficiente a mascherare la forte attività di trasporto (vedere la sezione risultato). In tali casi, linee cellulari con differenti attività biochimiche potrebbero essere necessari come sfondo per rilevare le attività del trasportatore 10, 21.

Mentre questi sensori permettono di monitorare le dinamiche di concentrazione del substrato a risoluzione spazio-temporale molto superiore rispetto ai metodi basati estrazione-, determinazione della concentrazione assoluta richiede ulteriori misure sperimentali e considerazioni. Solitamente, concentrazione del substrato è calcolata sul presupposto che l'affinità del sensore, di solito calcolata per titolazione proteina purificata sensore, è invariata quando espresso nella cellula. La concentrazione è calcolata utilizzando la seguente singolo isoterma di legame,

[S] = K d x (r - r min) / (r </ Em> max - r)

[S] è la concentrazione del substrato, K d è la costante di dissociazione determinato in vitro, r è il rapporto accettore / donatore osservata in un dato tempo di valutazione, r min è il rapporto accettore / donatore quando i sensori sono in forma apo, e r max è il rapporto accettore / donatore quando tutti i sensori sono legati al substrato. R min e r max sono influenzati da parametri quali la concentrazione di sensori, impostazioni di imaging utilizzate e la composizione del Milleu cellulare, e quindi necessitano di essere misurati in situ . Per determinare r valori massimi r min e, condizioni sperimentali che consente la modifica della concentrazione intracellulare substrato diventa necessario. Ad esempio, ionofori selettivi (ad esempio, ionomicina per Ca 2 +) 22 o un reagente perforante come digitonin 23 può essere utilizzato per equilibrare concentrazione del substrato intracellulare con la concentrazione esterna.

Una delle limitazioni nel tipo di esperimenti hanno dimostrato in questo protocollo è la bassa produttività; l'analisi si limita ad analizzare un metabolita in un'area relativamente piccola (<10) il numero di cellule. I progressi tecnologici sono stati fatti, tuttavia, superare tali limitazioni. Ad esempio, con l'anticipo in automatico, screening ad alto contenuto, è ora possibile utilizzare sensori geneticamente codificati in combinazioni con piccola molecola o biblioteca RNAi; cellule esprimenti un biosensore possono essere coltivate in un formato ad alta velocità (ad esempio, 96 - o 384 pozzetti), poi singoli pozzetti possono essere trattati con siRNA o prodotti chimici e ripreso. Tali esperimenti permettono l'identificazione dei costrutti siRNA o sostanze chimiche che inficiano il processo biologico che può essere osservato dal biosensore 24 25. Un'altra emozionante recente inclusione anticipodes lo sviluppo di un flusso microfluidica risolta nel tempo citometro, che consente di localizzare alto-capacità di FRET cambiamento efficienza a livello cellulare 26. Tali progressi tecnici aiuteranno scoperte di nuovi farmaci candidati e nuovi componenti in processi biologici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Non c'è nulla da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere 1R21NS064412, concessione NSF 1.052.048 e Jeffress Memorial Trust concessione J-908.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted fluorescent microscope Olympus IX81F-3-5 An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.
Excitation filter (mTFP1) Omega Optical 3RD450-460 Band width 450-460 nm
Excitation filter (Venus) Chroma ET500/20 Band width 490-510 nm
Emission filter (mTFP1) Chroma HQ495/30m Band width 475-505 nm
Emission filter (Venus) Chroma ET535/30m Band width 520-550 nm
Dichroic mirror (FRET channels) Chroma 470dcxr Long pass, 470 nm cut off
Dichroic mirror (YFP channel) Chroma 89002bs Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm
mCherry filter set Chroma 49008 Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm
Light source Olympus U-LH100L-3-5 LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended
CCD camera Qimaging Rolera-MGi EMCCD
Apochromatic fluorescence objective Olympus
Perfusion system, ValveBank II AutoMate Scientific [01-08] Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work
Laminar-flow chambers C&L Instruments VC-MPC-TW Other larminar-flow chambers would also work.
Chambered slide Lab-Tek 154534 For open-chamber experiments
Perfusion pump Thermo Scientific 74-046-12131 For open-chamber experiments
Software supporting ratiometric measurements Intellegenent Imaging Innovation Slidebook 5.5
Laminar flow biosafety cabinet ESCO LA-3A2
Isotemp CO2 Incubator Thermo Scientific 13-255-25
Dulbecco's MEM (DMEM) Hyclone SH30243.01
Cosmic calf serum Hyclone SH3008703
Penicillin/streptomycin Hyclone SV30010
Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) Invitrogen 31985 Used with Lipofectamine 2000
Poly-L-Lysine solution Sigma P4707
25 mm circular glass cover slips Thermo Scientific 12-545-102 In case VC-MPC-TW is used
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027 Other transfection reagents can also be used.
Solution A (Hank's buffer) 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH
Solution B Solution A + 0.04 mM Gln
Solution C Solution A + 0.2 mM Gln
Solution D Solution A + 1 mM Gln
Solution E Solution A + 5 mM Gln
Solution F Solution A + 5 mM Ala

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
  2. Haussinger, D. Hepatic glutamine metabolism. Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).
  3. Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. Hepatic glutamine metabolism. Nutrition. 18, 301-303 (2002).
  4. Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
  5. Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
  6. Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
  7. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
  8. Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. 111-3666 (2011).
  9. Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
  10. Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
  11. Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
  12. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  13. Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. 326-147 (2009).
  14. Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
  15. Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
  16. Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
  17. Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
  18. Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
  19. Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
  20. Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
  21. San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
  22. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
  23. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
  24. Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
  25. Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
  26. Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics