Vurdere antisvampeaktivitet Isoleret alveolære makrofager ved konfokal mikroskopi

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En metode til at evaluere evnen hos isolerede mus alveolære makrofager til at styre væksten af fagocyterede Aspergillus sporer ved konfokal mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Grimm, M. J., D'Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lungerne er en grænseflade, hvor værtsceller er rutinemæssigt udsættes for mikrober og mikrobielle produkter. Makrofager er de første-line fagocytceller der støder inhalerede svampe og andre mikrober. Makrofager og andre immunceller genkende Aspergillus motiver af patogene anerkendelse receptorer og indlede nedstrøms inflammatoriske reaktioner. Fagocytten NADPH oxidase genererer reaktive ilt mellemprodukter (ROIs) og er afgørende for vært forsvar. Selv NADPH-oxidase er kritisk for den neutrofil-medierede værtsforsvar 1 - 3 betydningen af NADPH-oxidase i makrofager er ikke veldefineret. Målet med denne undersøgelse var at afgrænse specifikke rolle NADPH oxidase i makrofager i formidlingen vært forsvar mod A. fumigatus. Vi fandt, at NADPH-oxidase i alveolære makrofager kontrollerer væksten af fagocyterede A. fumigatus sporer 4.. Her beskriver vi en metode til at vurdere muligheden for mus enlveolar makrofager (AMS) til at styre væksten af fagocyteret Aspergillus sporer (konidier). Alveolære makrofager farves in vivo og ti dage senere isoleres fra mus ved bronchoalveolær lavage (BAL). Makrofager udpladet på dækglas og derefter podet med grønt fluorescerende protein (GFP)-udtrykkende A. fumigatus sporer. På bestemte tidspunkter, cellerne fikseret og antallet af intakte makrofager med fagocyterede sporer vurderes af konfokal mikroskopi.

Introduction

Makrofager er de første-line fagocytceller der støder inhalerede mikrober. Makrofager genkende Aspergillus motiver af patogene anerkendelse receptorer indtage og begrænse væksten af inhalerede sporer (konidier), og indlede inflammatoriske reaktioner. Fagocytten NADPH-oxidase konverterer molekylært oxygen til superoxid anion og nedstrøms reaktive oxygenmellemprodukter (ROIs). Kronisk granulomatøs sygdom (CGD) er en arvelig lidelse i NADPH oxidase præget af alvorlige bakterie-og svampeinfektioner og ved overdrevne inflammatoriske reaktioner.

Selv NADPH-oxidase er kritisk for den neutrofil-medierede værtsforsvar 1 - 3 betydningen af NADPH-oxidase i makrofager er ikke veldefineret. Tidligere undersøgelser har vist, at alveolære makrofager indtager og dræbe Aspergillus sporer, mens neutrofile hovedsagelig målrette hyfe fase 5.. Imidlertid har der været modstridende results med hensyn til den rolle, NADPH-oxidase i makrofag i at kontrollere væksten af A. fumigatus sporer 6, 7.

Målet med denne metode var at afgrænse specifikke rolle NADPH oxidase i makrofager i formidlingen vært forsvar mod A. fumigatus sporer. Vi fandt, at NADPH-oxidase i alveolære makrofager kontrollerer væksten af fagocyterede A. fumigatus sporer 4.. For de fleste nøje modellere værtens respons på inhalerede svampe, brugte vi alveolære makrofager høstes af bronchoalveolar udskylning fra stimulerede mus umiddelbart efter aflivningen. Brugen af isolerede alveolære makrofager muligt for os at fokusere på deres svampedræbende aktivitet i fravær af andre immunceller (f.eks rekrutterede neutrofiler), der forsvarer over for Aspergillus in vivo. I denne fremgangsmåde blev alveolære makrofager farvet in vivo før høst for således at minimere mængden af post harvest manipulation. </ P>

En anden fordel ved denne protokol er anvendelsen af en GFP-udtrykkende A. fumigatus stamme. Denne svamp udtrykker GFP fra konidie scene gennem hyfe scenen og har ikke behov for yderligere farvning. For at opnå billeder med mere detaljeret, valgte vi konfokal mikroskopi, der gør det muligt at genopbygningen af ​​tredimensionale strukturer fra de opnåede billeder. Tredimensional rekonstruktion giver evnen til at differentiere mellem hyfer voksende omkring snarere end i eller gennem en makrofag. Konidier kan også være præcis skelnes som intracellulær versus ekstracellulære.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer udføres på dyr i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg på Roswell Park Cancer Institute og overholdt alle statslige, føderale og National Institutes of Health regler.

1. In vivo makrofag Mærkning

Bemærk: PHK26 er en lipofil farvestof, der vil blive taget op af fagocytiske celler både i cirkulation og i væv, når de indgives intravenøst ​​(iv). PKH26 blev anvendt til in vivo-mærkning for at minimere mængden af post-høst manipulation af makrofag. PKH-26 har den fordel af stabilt akkumulere i alveolære makrofager i længere perioder. Vente 10 dage efter administration giver mulighed for clearance af alle mærkede celler fra cirkulation forlader kun alveolære makrofager stabilt mærket med PKH26 8, 9. PKH26 er en rød fluorokrom der har excitation (551 nm) og emission (567 nm) egenskaber kompatiblemed rhodamin eller phycoerythrin detektionssystemer. Enhver procedure mærkning kan introducere artefakt, herunder tab af levedygtighed. Men da vi bruger den samme fremgangsmåde til mærkning af makrofager i forskellige mus genotyper (f.eks WT vs NADPH oxidase-mangel), virkningerne af disse artefakter vil være ensartet.

  1. Stamopløsning af PKH26 (1 x 10 -3 M i ethanol) 1:5 fortynder C leveres af producenten Fortynd.
  2. Load 100 pi fortyndet PKH26 i en 1/2 ml insulinsprøjte (29 G x 1/2 ") for hver mus.
  3. Administreres til mus ved iv injektion (enten hale vene eller retro orbital) mindst 10 dage før høst.

2. Høst alveolære makrofager efter bronchoalveolær lavage (BAL)

Antallet af mus, der skal bruges til et eksperiment, kan variere. Et typisk udbytte fra en ikke-stimuleret mus er i området 3-5 x 10 5 alveolære makrofager, men dette antal kan variere meget based af faktorer såsom størrelsen af ​​musen, oplevelse af den person der udfører udskylning, og antallet af instillationer af skyllevæske og mængden trukket tilbage fra lungerne. I denne protokol udføres lungeudskylning med en lukket brysthulen som sammen med gentagne 1 ml udskylninger bidrager til at øge celle udbytte.

  1. Aflive mus ved indgivelse af en dødelig dosis af Avertin bedøvelsesmiddel (12,5 mg) intraperitonealt (ip) ved hjælp af aseptiske forhold, at opløsningen opbevares sterilt.
  2. Spray mus grundigt med 70% ethanol.
  3. Fjern skindet fra kraniale ende af animalske udsætte thorax (figur 1A).
    1. Lav et lille snit i huden lige under mellemgulvet.
    2. Sæt finger i snit og trække huden bort fra den kraniale ende af dyret (figur 1A).
    3. Skub lidt op på hovedet, udvidelse den ventrale side af halsen (Figur 1A).
  4. Skær et lille hul gennem brystkasseni højre side af brystkassen at deflatere lungerne og også tillade visualisering af lungerne under de følgende trin.
  5. Find luftrøret, og omhyggeligt dissekere væk omgivende væv.
    1. Fjern spytkirtlerne, sternohyoid muskler og strubehovedet, osv. med buede pincet.
    2. Løft forsigtigt med en buet pincet og skåret væk med en saks den tynde væv, der dækker luftrøret (adventitia) afslører den underliggende ringmærket brusk struktur.
  6. Indsæt kateter i trachea.
    1. Ved hjælp af buede pincet, placere en sutur bag (dorsale til) luftrøret og trække en længde på 10 cm gennem åbningen.
    2. Start over cricoid (den fortykket ring af brusk) omhyggeligt guide en 22 G kateter ned luftrøret stopper hvor luftrøret forsvinder bag brystbenet.
    3. Fast binde sutur omkring luftrøret og kateter for en pasform. Fjern kanylen fra kateteret.
  7. Saml 4-vejs stophane.
    1. Fylden 6 ml sprøjte med DPBS, 1% FBS og tillægger 4-vejs stophane som vist i figur 1B.
    2. Vedhæft en tom 6 ml sprøjte på den angivne position på 4-vejs stophane (figur 1B).
    3. Vedhæft åben port på 4-vejs stophane til kateter (figur 1B). Vær omhyggelig med ikke at fjerne kateter fra luftrøret.
  8. Saml lavagevæske fra lungerne.
    Bemærk: Efterforskere kan vælge at bruge mindre mængder lavagevæske at minimere muligheden for skade på vævet. Det er vigtigt, at den samme fremgangsmåde konsekvent anvendes i alle mus grupper.
    1. Drej håndtaget på vandhanen, så den tomme sprøjte er lukket og langsomt injicere ~ 1 ml DPBS, 1% FBS at puste lungerne. Overhold lunge inflation gennem hullet skæres i trin 2.4.
    2. Vær omhyggelig med ikke at overinflate lungerne.
    3. Drej håndtaget på stophanen, så den fulde sprøjte er lukket, og omhyggeligt trække influenza id fra lungerne.
    4. Overhold lungerne punktere gennem hullet skæres i trin 1.4. Kateteret kan være nødvendigt at blive flyttet lidt frem eller tilbage for at få en god lodtrækning. Tag særlige forholdsregler for at holde kateteret i luftrøret.
    5. Gentag trin 2.8.1-2.8.4 5-6x indtil alle DPBS, 1% FBS er blevet indsprøjtet og trukket tilbage fra lungerne. Bemærk: inddrivelse af lunge væske vil ikke være 100% af injiceret væske.
  9. Tomme sprøjte med skyllevæske i et 50 ml konisk rør. At holde cellerne ved stuetemperatur.
  10. Pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur og hæld supernatant. Dette kan gemmes for cytokin analyse, hvis det ønskes.
  11. Resuspendér celler i 1-5 ml RPMI 1640 med 10% FBS og regne på et hæmocytometer. I ustimulerede mus er> 95% af cellerne høstes af BAL forventes at være makrofager, som kan bekræftes af cytologi.

3.. Dyrkning og høst Svamp

"> Aspergillus fumigatus anvendt i denne protokol udtrykker GFP i alle faser af dets livscyklus:. Sporer, germlings og hyfer Denne svampestamme blev leveret af Dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada.

  1. Plate konidier af Aspergillus fumigatus stamme, der udtrykker GFP på Sabouraud hjerne-hjerte-infusion (BHI)-agar slants med chloramphenicol (0,05 g / L) og gentamycin (0,5 g / L).
  2. Der inkuberes i mørke løst på glassene for 7 til 10 dage ved stuetemperatur.
  3. Harvest konidier ved vask skrå med 10 ml 0,01% Tween 20 i DPBS. Let skrabe svampen med stripette at løsne. Skyl skrå flere gange for at øge udbyttet.
  4. Pass konidiesuspension gennem en 100 um cellefilter i et 50 ml konisk.
  5. Pellet konidier ved centrifugering ved 400 xg i 10 min.
  6. Resuspender konidier i 50 ml DPBS og tælle ved hjælp af et hæmocytometer.
  7. Vask to gange med DPBS og fortyndes til ønskede koncentration.

4.. Fungal Challenge og konfokal mikroskopi

For at undersøge den rolle, makrofag-NADPH-oxidase i værtsforsvar evnen hos isolerede alveolære makrofager fra mus af tre genotyper at kontrollere væksten af fagocyteres Aspergillus sporer evalueret. De genotyper, der anvendes i denne undersøgelse omfatter; 1) vildtypemus, 2) Ncf1 * / * Mn-mus med et naturligt forekommende Ncf1 mutation (Ncf1 koder for p47 phox en nødvendig komponent fagocyttens NADPH oxidase) forlader dem NADPH-oxidase mangelfuld, og 3) Ncf1 * / * Mn + transgene mus (MN betegner transgen huser vildtype Ncf1 under kontrol af den humane CD68-promotor), hvor NADPH-oxidase-aktivitet er blevet rekonstitueret i monocyt / makrofag befolkning 10, 11.

Konfokal mikroskopi er bedst egnet til dette assay på grund af tilstedeværelsenog vækst af ikke-fagocyteret konidier på dias. Konfokal mikroskop vil give mulighed for visualisering af enkelte planer i Z-aksen og gøre det muligt at skelne mellem svampe vokser omkring snarere end inde makrofag. Alle konfokal billeder er erhvervet ved hjælp af en 63X olie nedsænkning linse. Z-stakke er erhvervet med en elektronisk zoom faktor på 2,5. Tykkelsen af ​​en Z-stakken bestemmes ved hjælp af DAPI og lyse felt billeder at lokalisere toppen og bunden af ​​feltet. Z-stacks varierede fra 14 til 24 um med individuelle skiver ~ 1 um tyk. Til kvantificering af makrofager blev enkelt scanninger af 1X elektronisk zoom på 10 felter pr genotype. Intakte makrofager blev identificeret baseret på PKH26 og DAPI farvning af membran og kernen hhv. Conidier blev identificeret baseret på FITC udtryk og lyse felt image.

  1. Forbered sterile dækglas og plader
    1. Under et biologisk sikkerhedsskab, sættetid 22 x 22 mm dækglas i 70% ethanol for 5-10 min.
    2. Skyl dækglas i sterilt PBS.
    3. Anvendelse af steril pincet, forsigtigt placere et enkelt dækglas i bunden af ​​hver brønd i en steril enkeltvis pakket 6-brønds plade.
  2. Frø ~ 1 x 10 6 høstet PKH26 mærket alveolære makrofager suspenderet i 300 ul RPMI 1640, 10% FBS på hver dækglas. Det nøjagtige antal kan variere afhængigt af høstudbyttet.
  3. Tillad makrofager til at klæbe ved inkubering ved 37 ° C med 5% CO2 natten over.
  4. Den følgende morgen tilsættes ~ 1 x 10 7 GFP-udtrykkende A. fumigatus konidier suspenderet i 100 pi forvarmet (37 ° C) RPMI 1640, 10% FBS.
  5. Retur pladen til 37 ° C inkubator med 5% CO2.
  6. Bør fastsættes celler i mindst 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. Ved 3, 7 og 14 timer fix celler ved tilsætning af et lige volumen 2% formaldehyd til hver brønd (slutkoncentration 1% formaldehyd). Placer plader tiltidlige tidspunkter ved 4 ° C natten over. For den endelige tidspunkt (14 timer), fix cellerne ved stuetemperatur i 2 timer.
  7. Efter fiksering fjernes forsigtigt dækglas med pincet og skyl i DPBS.
  8. Fjern overskydende væske ved at placere kanten af ​​dækglasset på en foldet Kimwipe.
  9. Påfør 6 pi Fluorescensmonteringsmedium med DAPI til et objektglas.
  10. Lå en kant af dækglasset på diaset og forsigtigt falde med celle nedad i montage medium. Montering mediet vil sprede sig og danne et jævnt lag under dækglasset. Der er ingen grund til at trykke på dækglasset.
  11. Seal kanter dækglas med klar neglelak og lad det lufttørre.
  12. Opbevares forberedt dias i et dias kasse (beskyttet mod lys) ved stuetemperatur indtil den er klar til at analysere ved konfokal mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Indsamling alveolær makrofag af BAL fra ustimulerede mus vil resultere i en> 95% ren population baseret på cytologi. De 3 og 7 timer (figur 2) tidspunkter forud for hyfe fase af svampevækst og giver mulighed for en sammenligning af fagocytisk effektivitet konidier blandt genotyper. 14 hr tidspunkt er hvor genotyper kan sammenlignes med hensyn til evnen til at inhibere overgang fagocyteres konidier på vævet-invasiv hyfe fase (figur 3). Intakt makrofager kan identificeres ved konfokal mikroskopi baseret på PKH26 og DAPI farvning af membranen og kerne, henholdsvis (figur 2 og 3). Konidier og hyfer identificeres baseret på GFP-ekspression (figur 2 og 3).

iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg "/>
Figur 1.. Anatomisk Retningsbestemte Referencer og 4-vejs stophane. A) anatomiske retningsbestemte referencer til en mus er vist. Cranial er i retning af hovedet, mens de caudale er i retning af halen. Den ventrale side af en quadruped er mod maven eller den nedre overflade af dyret, mens den dorsale side er mod bagsiden eller den øvre overflade af dyret. B) 4-vejs stophane har tre luer-forbindelser og et håndtag, der roterer 360 ° til at lede strømmen af ​​væsker gennem stophane. Placering af den tomme sprøjte den fulde sprøjten og kateteret er angivet. Klik her for at se større billede.

Figur 2 Figur 2. Fagocytose A. fumigatus sporer er ens mellem genotyper efter 7 timer. At evaluere evne isolerede alveolære makrofager med NADPH oxidase aktivitet for at begrænse væksten i fagocyteret konidier, (A) vildtype, (B) Ncf1 * / * Mn +, og (C ) Ncf1 * / * Mn - mus blev administreret iv PKH26. Alveolære makrofager blev høstet ved BAL 10 dage senere og podet med konidier af GFP-udtrykkende A. fumigatus. Cellerne blev fastsat til 3, 7, og 14 timer efter tilsætning af konidier. Ved 3 (data ikke vist) og 7 timer både det samlede antal makrofager og med ≥ 1 fagocyteres konidier (pile) var tilsvarende blandt de tre genotyper, hvilket afspejler lignende fagocytose effektivitet. Intakte makrofager identificeres baseret på PKH26 (rød) og DAPI (blå) farvning af membran ennd kerner hhv. Fluorescens billeder fra en enkelt Z-plane er belagt med den lyse felt image. Den lyse felt billede består af lys, der transmitteres gennem hele prøven og så når overlejret på fluorescerende Z-plain tillader visualisering af celler og konidier i hele Z-stakken. Scale bar, 19 mM. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3. Makrofag NADPH-oxidase er nødvendig for at bekæmpe væksten af A. . fumigatus sporer Konfokal mikroskopi af (A, D) vildtype, (B, E) Ncf1 * / * Mn + og (C, F) Ncf1 * / * Mn - < / Sup> alveolær makrofag ved 14 timer efter podning med GFP + A. fumigatus konidier. Intakte makrofager identificeres baseret på PKH26 (rød) og DAPI (blå) farvning af membraner og kerner, hhv. Optrukne pile viser intakte makrofager med mindst en fagocyterede konidier og hule pile peger på hyfer. Talrige ændringsforslag med mindst 1 fagocyteres konidier blev observeret med vildtype-og Ncf1 * / * Mn +-celler, men ikke med NADPH oxidase-deficiente celler. GFP signal i hyfer blev variabel baseret på planet af z-stablet viste billede. AC) Fluorescens billeder fra en enkelt Z-planet med lysfelt billede muliggøre visualisering af celler og hyfer inden for hele Z-stakken. DF) Fluorescensbilleder fra en enkelt Z-planet uden lysfelt baggrund muliggøre identifikation af celler, men ikke det rumlige forhold af celler og svampe i forskellige Z-planer. Scale bar, 19 um..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med denne fremgangsmåde til ex vivo-analyse af den antifungale aktivitet af makrofager sammen med in vivo-svampe udfordring, vi tidligere vist, at NADPH-oxidase i makrofager spiller en vigtig rolle i forsvaret mod A. fumigatus 4.. Brugen af isolerede alveolære makrofager giver os mulighed for at fokusere på deres svampedræbende aktivitet i fravær af andre immunceller (f.eks rekrutterede neutrofiler), som forsvarer mod Aspergillus in vivo.

Forskellige visualisering strategier er blevet anvendt til at evaluere makrofag antifungal aktivitet in vivo og ex vivo. Luther et al., Brugte konfokal mikroskopi til at studere fagocytose af Aspergillus konidier af menneskelig (høstet fra lunge transplanterede patienter) og mus ændringsforslag 12. Geunes-Boyer et al. karakteriseret samspillet mellem Candida krusei og murine makrofager efter fagocytose. Deanvendes en makrofag cellelinie RAW264.7 og primær makrofag fra bughinden 13. García-Rodas et al. viste, at tensidprotein-D binder til og fremmer fagocytose og overlevelse af Cryptococcus neoformans 14. SP-D binding blev også undersøgt in vivo ved hjælp af SP-D - / - mus intranasalt podet med Alexa Fluor 488-mærket C. neoformans. Efter lungeudskylning blev AM'er immunofluorescently mærkes og konfokal mikroskopi blev anvendt til at analysere fagocytose.

Makrofager fra forskellige anatomiske steder (f.eks alveolær, milt, peritoneale), genereret med forskellige stimuli (f.eks thioglycollat ​​elicitation eller in vitro differentiering) eller fra cellelinjer (f.eks, RAW264.7) kan have dramatisk forskellige antimikrobielle og inflammatoriske reaktioner 15 - 18.. Derfor er de fleste nøje at modellere værtens respons på inhaleret sjovgi, brugte vi alveolære makrofager høstes af bronchoalveolar udskylning fra stimulerede mus umiddelbart efter aflivningen.

I første omgang brugte vi live-cell imaging at evaluere makrofag svampedræbende aktivitet 4. Alveolær makrofager blev udsået i kamre objektglas derefter tilsået med GFP udtrykker Aspergillus. Efter 3 timer blev der ikke fagocyterede konidier fjernes ved skånsom vask til at tillade uhindret visualisering af fagocyteret konidier. Konidie spiring blev derefter overvåget ved time-lapse billeddannelse intervaller på 30 minutter ved hjælp af meget lyse billeder for at visualisere makrofag og GFP-fluorescens til at visualisere svampe. Denne metode har den fordel, at erhverve sekventielle billeder af den samme primære cellekultur. Imidlertid tendens til makrofager migrerer over synsfeltet under erhvervelse tilladt for en kvalitativ snarere end en kvantitativ vurdering af conidiocidal aktivitet. En anden ulempe ved live-cell imaging er than mangler klarhed og detaljer som celler bevæger sig ind og ud af flyet af fokus.

For at opnå billeder med flere detaljer vi valgte konfokal mikroskopi, der gør det muligt at genopbygningen af ​​tredimensionale strukturer fra de opnåede billeder. Tredimensional rekonstruktion giver evnen til at differentiere mellem hyfer voksende omkring snarere end i eller gennem en makrofag. Med denne evne til at se celler og svamp i tre dimensioner, fjernelse af ikke-fagocyteret konidier på 3 timer er ikke længere et nødvendigt skridt. Konidier kan også være præcis skelnes som intracellulær versus ekstracellulære.

For forbedret visualisering blev alveolære makrofag mærket in vivo med PKH26. Dette fluorescerende farvestof har en lang alifatisk hale som stabilt indarbejder lipid regioner cellemembraner. Ved intravenøs injektion er dette lipofile farvestof taget op af fagocytiske celler både i blodbanen og i væv. Efter 10 dage Labeledede fagocytter er fjernet fra murine cirkulation og forbliver kun i væv 9, der giver mulighed for indsamling af allerede mærket alveolær makrofag ved BAL. Med anvendelse af in vivo-mærkning efter høst manipulation af alveolære makrofager minimeres.

En anden fordel ved denne protokol er anvendelsen af en GFP-udtrykkende A. fumigatus stamme. Denne svamp udtrykker GFP fra konidie scene gennem hyfe scenen og har ikke behov for yderligere farvning. Med dobbelt farvning af makrofager og Aspergillus, er vi i stand til at identificere fagocyteret konidier.

En begrænsende faktor i denne protokol er makrofag udbytte fra BAL. Et typisk udbytte fra en ikke-stimuleret mus er i området 3-5 x 10 5 alveolære makrofager, men dette antal kan variere i høj grad baseret på faktorer, såsom størrelsen af musen, oplevelse af den person der udfører udskylning, og antallet af instilleringer af udskylning influenzaid og mængden tilbage fra lungerne. I denne protokol, er lungeudskylning udføres med et lukket brysthulen som sammen med gentagne 1 ml instillationer bidrager til at øge celle udbytte i forhold til en åben brysthulen og færre instillationer. Mus numre kan også øges for at øge høstudbytte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Allergy og infektionssygdomme Grant R01AI079253 (til BHS) og af National Cancer Institute Cancer Center Support Grant CA016056 til Roswell Park Cancer Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4Cl Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter BD 381523 Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD 297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers BD Falcon 64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell culture incubator 37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6-well Cell culture plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
  2. Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
  3. Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
  4. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
  5. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
  6. Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
  7. Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
  8. Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
  9. Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
  10. Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
  11. Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
  12. Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
  13. Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
  14. García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
  15. Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
  16. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
  17. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
  18. Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics