В Vivo микроинъекции и электропорации мыши яичка

1Institute of Reproductive Biology, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN)
Published 8/23/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

В этой статье описывается микроинъекции и электропорации мыши яичка в естественных условиях, как техника трансфекции для яичек мышиных клеток для изучения уникальных процессы сперматогенеза. Представленный протокол включает этапы подготовки стеклянной капиллярной, микроинъекции через выводного протока, и трансфекции путем электропорации.

Cite this Article

Copy Citation

Michaelis, M., Sobczak, A., Weitzel, J. M. In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis. J. Vis. Exp. (90), e51802, doi:10.3791/51802 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Этот вклад видео и статья дает исчерпывающее описание микроинъекции и электропорации мыши яичка в естественных условиях. Это особая техника трансфекции для яичек клеток мыши позволяет изучение уникальных процессов в сперматогенеза.

Следующий протокол фокусируется на трансфекции яичка клеток мыши с плазмиды конструкций. В частности, мы использовали репортер вектор pEGFP-C1, который выражает повышенную зеленый флуоресцентный белок (EGFP), а также вектор pDsRed2-N1 выражая красный флуоресцентный белок (DsRed2). Оба закодированные гены-репортеры были под контролем цитомегаловируса человека раннего промотора-(CMV).

Для выполнения перенос гена в яичках мыши, репортер плазмидные конструкции вводятся в семенниках, живущих мышей. С этой целью, яичко из наркоза животное подвергается и сайт микроинъекции подготовлен. Наша предпочтительным местоминъекции отводящий канал, с конечном счете, подключенного рете семенников в качестве анатомического транспортного маршрута сперматозоидов между яичка и придатка яичка. Таким образом, заполнение семенных канальцах после микроинъекции превосходно управление и контроль за использованием окрашенных растворов ДНК. После наблюдения достаточное заполнение яичка его цветной структуры канальцев, орган электропорации. Это позволяет передавать раствора ДНК в клетках семенников. После 3 дней инкубации яичка удаляют и исследовали под микроскопом для зеленого или красного флуоресценции, иллюстрирующий успех трансфекции.

Как правило, этот протокол может быть использован для доставки ДНК-или РНК-конструкции в живой мыши яичка для того, чтобы (по) выражают или сбить генов, облегчая в функции гена естественных условиях анализа. Кроме того, он подходит для изучения репортер конструкции или предполагаемый ген РегулаТори элементы. Таким образом, основными преимуществами техники электропорации являются высокая производительность в сочетании с низким усилием, а также умеренного технического оборудования и навыков, необходимых по сравнению с альтернативными методами.

Introduction

Млекопитающих сперматогенез считается сложный процесс самообновляющихся стволовых клеток последовательно проходящих митоза, мейоза и дифференцировку в целях развития в зрелом гаплоидном сперматозоидов. Эти морфологические изменения в оркестровке различных типов клеток и, несмотря на глубокие попытки, до сих пор невозможно имитировать эти процессы в культуре клеток 1,2. Следовательно, исследование сперматогенеза до теперь полагается на живые организмы в качестве моделей для естественных. В общем, функции гена исследования, как правило, основаны на трансгенных животных. Тем не менее, создании и поддержании такой модели на животных является трудоемким, дорогостоящим и достаточно сложной. Это связано с требуемой длительного процесса размножения для создания и поддержания трансген над поколений. Кроме того, генетические манипуляции всего организма трансгенной или нокаутом подхода является склонны вызывать физиологические нарушения при ориентации гены с основных функций в нескольких регионах, например, за пределами яичка или системно.

Кроме того, некоторые переходные способы трансфекции связаны с некоторых важных недостатков. Например, типичные недостатки вируса-опосредованного переноса генов являются возможно провокация immunoreactions и дополнительных правил безопасности, в то время как липофекция 3 и бомбардировки микрочастицами 4 может привести к повреждению ткани и ограничены определенной глубине клеток для достаточной эффективности трансфекции.

В отличие от этого, электропорации (EP) в качестве еще ​​одного общего пути временной трансфекции, кажется, представляют собой перспективный метод позволяет в естественных условиях трансфекции и последовательной естественных анализа генов в. В общем, ЕР называют динамическим явлением, которое зависит от местного трансмембранного напряжения с следовательно, опосредованных пор в пределах наносекунд. Эти пробелы можно поддерживать в течение миллисекунд, достаточно то предоставлении доступа к ДНК, РНК или малых молекул 5. Когда приложенное напряжение является слишком высокой, как правило, временный характер ЕР противодействует за счет производства тепла и индукции слишком комплексной проницаемости с последующей необратимого повреждения клетки 5.

Здесь мы показываем, что электропорации является эффективным и экономичным система трансфекции который способен быть использованы для генетической трансформации яичка с целью выяснения яичек характеристики генов в естественных условиях. В данной статье рассматриваются подготовку плазмиды, микроинъекции через выводного протока и последующей электропорации мыши яичка. Эта процедура может быть средством выбора для достижения быстрого, конкретную и эффективную трансфекцию семенных канальцах яичек мыши в естественных условиях с целью изучения процессов сперматогенеза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все выполненные эксперименты на животных были одобрены местным комитетом по этике (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit унд Fischerei, Мекленбург-Передняя Померания, Германия).

1 плазмиды Подготовка

  1. Для приготовления плазмиды, использовать плазмиды комплекты очистки (см таблицу материалы) или аналогичные методы с буфером удаления эндотоксина так, что иммунные реакции животного можно избежать. Следуйте инструкциям в руководстве. Применять DDh 2 O разбавить раствора плазмиды.
  2. Ликвидировать мусор, крутя раствора ДНК при максимальной скорости (20000 мкг). Затем собирают супернатант.
  3. Определить концентрацию плазмиды с помощью спектрофотометра (см материалы).
  4. Отрегулируйте концентрацию плазмиды с DDh 2 O в 1-3 мкг (ДНК) / мкл. Примечание: Более низкие концентрации приведет к снижению эффективности трансфекции, в то время как более высокие концентрации могут вызвать слишком вязкий раствор для инъекций. Кроме того,Эффективность трансфекции в зависимости от размера плазмиды и должен быть протестированы индивидуально.
  5. Перед инъекцией, приготовить смесь раствора с, например 40 мкл плазмиды вместе с 5 мкл PBS (10x) и 5 ​​мкл Fast Green (0,5%). Быстрый зеленый необходима для отслеживания процесса впрыска. Предпочтительно, используют тонкие стены ПЦР-пробирки или парафином. Примечание: В зависимости от размера яичка, объем 20-50 мкл будут необходимы для каждого яичка.

2 Получение микроинъекции пипетки

  1. Используйте боросиликатного капилляры (см таблицу материалы) для подготовки микроинъекции пипетки.
  2. Потяните стеклянные капилляры с вертикальной капиллярной съемника (см Материалы таблицу).
  3. Перерыв кончик капиллярной щипцами по мягко диапазонов. Кончик обычно 50-80 мкм в диаметре и длиной около 1 см. Старайтесь избегать советов, которые слишком долго, поскольку они не достаточно жесткой, чтобы проникнуть в ткани.
  4. Наконец, шаrpen чаевые в 30 градусов, чтобы угол 45 ° с помощью микропипетки beveler (см таблицу материалы).
  5. Загрузите микроинъекции пипетки с микс инъекционного раствора (см Plasmid Подготовка). Нанесите раствор в задней части стеклянного капилляра с маленьким шприцем. Примечание: Старайтесь избегать воздушных пузырьков при загрузке, в противном случае это будет выведена на семенных канальцев вместе с плазмиды решения и, следовательно, снизит проводимость, а также, возможно, вызвать повреждение тканей.

3 Анестезия и хирургия

  1. Выполните операцию в асептических условиях, используя стерильного материала (т.е. шприц, игла, хирургических инструментов и т.д.). Это уменьшит заражение животного и обеспечить хорошие показатели выживаемости.
  2. Используйте самцов мышей для электропорации в возрасте 6-8 недель.
  3. Для инициализации послеоперационный лечение обезболивающее, обеспечить мышь с анальгетиками добавил питьевой воды в день до операции. Это задницуОЭС упреждающий обезболивания в случае высокой вероятностью послеоперационной hypodipsia (впускной уменьшилась воды). Для этого, выставить питьевой воды, например, с педиатрической ибупрофен подвески (20 мг / мл). Лечебные питьевой воды также должны быть поставлены в один день и две восстановления в одинаковой концентрации. Это означает, суточную дозу 7,5 мг / кг, действительный в течение 5 мл / сут питьевой воды и массы тела 25 г в течение 8 недель в возрасте C57BL / 6J. Этот режим обезболивающее гарантирует фундаментальное облегчение боли и ускоренное восстановление наряду с высокой благосостояния 26.
  4. Для подготовки анестезии рабочего раствора на день операции, смешать 10% Ketamin и 2% Xylazin в соотношении 1: 1 (см таблицу материалы).
  5. Чтобы анестезию животного, применяют 0,25 мл / 100 мг веса тела анестезирующего раствора подкожно (Ketamin = 0,125 г / кг; Xylazin = 0,025 г / кг). Используйте место для инъекции между таза и конечностей для предотвращения повреждения органов и травмы мышей. Как правило, 10 мин необходимыпока мышь не глубоко под наркозом.
  6. Покройте глаза мыши с ветеринарной мази для предотвращения сухости во время анестезии.
  7. Проверьте глубокий обезболивающий арест, который заметно по общей отсутствия ответа. С этой целью, просто зажать палец животного.
  8. Чтобы начать операцию, удалить животе волосы с электробритва или аналогичный и дезинфицировать работы зона с sterilium или аналогичный.
  9. Сделать вентральный вырез прямо над препуциальных желез в центре брюшной области. В том месте, первый потяните кожу в сторону и провести небольшое поперечное кожную срез о 8-14 мм. Тогда, по-прежнему вдоль брюшной мышечного слоя.
    Примечание: Повреждение должно быть как можно меньше, чтобы уменьшить вред животным.
  10. Потяните вверх живота жировые отложения тщательно подвергать прилагаемый яичка и поместить его на предварительного подготовленного водонепроницаемый одноразовой бумажной салфеткой только около сайте разреза (Рисунок 2А).
  11. Используйте бинокль Fинд в отводящий канал в качестве цели впрыска. Проток эфферентной идентифицируется как тонкой стыке сосуда между яичка и придатка яичка. Он расположен рядом с видного яичка артерии. Проток проходит почти под углом 45 ° к артерии и зримо входит в CAPUT epididymidis. Примечание: В зависимости от возраста мыши, проток обычно похоронен в жировой ткани.
  12. Используйте тонкий пинцет, чтобы очистить выводного протока этой жировой ткани. После этого, поместите выпущенный протока на стерильной бумажной полоске, чтобы обеспечить хорошую видимость воздуховода без ущерба окрестности.

4 Микроинъекция и применение ДНК

  1. Подключите микроинъекции пипетки, который загружается с плазмиды решения блока микроманипулятор / инжектора.
  2. Поместите микроинъекции иглы параллельно выводного протока с кончиком, направленным к рете семенников (Рисунок 2B).
  3. Используйте мелкие пинцеты илишить канал над микроинъекции пипетки. Убедитесь, что капилляр удерживаться параллельно к воздуховоду, потянув его.
    Примечание: Эта процедура является более удобным, чем проникнуть в судно, перемещая иглу с микроманипулятора.
  4. Направьте иглу тщательно к яичка и остановить как она проникает в рете семенников непосредственно под белочной оболочки (Рисунок 2C).
    Примечание: В случае необоснованных сплетение яичка, плазмиды решение будет просачиваться в интерстициальное пространство. Это обычно приводит к выходу из строя трансфекции семенных канальцев.
  5. Для инъекции плазмиды решения использовать microinjector со следующими настройками: пи: 100 гПа, Ti 0,2 сек, и компьютер: 0 гПа (Рисунок 2D).
  6. Контролировать весь процесс впрыска, наблюдая яичко заполнения статус с помощью зеленого цвета. Следите за тем, семенников заполняется только до 2/3 его объема с плasmid решение (Рисунок 2E).
    Примечание: Если объем впрыска превышении ткани яичка может быть нанесен вред.

5 Электропорация яичка

  1. Для эффективного электропорации, замочить Пинцет электроды в PBS (1x). Это обеспечивает адекватное проводимость.
  2. Плавно выжать яичко между мокрыми электродами (Рисунок 2F). Измерьте электрическое сопротивление с электропоратора.
  3. Применить ток яичка. Выполните восемь прямоугольных импульсов 40 V в 4 различных местах яичка с постоянным продолжительности 50 мс Время импульса и 950 мс интервала времени.

6 закрытия раны и после операции

  1. При электропорации уложите яичко обратно в исходное расположение.
  2. Сшейте внутреннюю мышечного слоя с хирургического шва (см материалы).
  3. Закройте кожу, используя шовные клипы (см таблицу материалы). Потяните кожи до умач пинцет. Убедитесь, что исключает мышечного слоя. Поместите клипы, каждый на расстоянии не более 5 мм.
    Примечание: Потому что хирургический шовный может быть проглочена мыши, шовные клипы благоприятствования для закрытия повреждение кожи.
  4. Разрешить мышь для восстановления после анестезии на стерильных бумажных полотенец, помещенных в стерильную пустую клетку мыши, который закаленного на 37 ° C теплой панели. Подушка должна обеспечивать потепление одной половине клетки, создавая тепловой градиент. Для животного это делает возможным поиск для индивидуального, наиболее удобной зоной в связи с разнообразием температуры в клетке. Кроме того, покрытие мыши с листом стерильной бумажным полотенцем так, что стресс может быть дополнительно уменьшено. Примечание: С поверхности тела мыши является необычайно высокой по отношению к массе тела, по сравнению с более крупными животными, тепловая поддержка имеет особое значение для успешного восстановления грызунов.
  5. Когда работает животное полностью проснулся, передавать Iт для дальнейшего выздоровления полностью оборудованная новой клетке мыши. Не кладите животное обратно к своей старой клетке или группе мышей. Убедитесь, что клетка, как чистая и стерильная, как можно предотвратить раневой инфекции. Контролировать весь процесс восстановления. Для передачи мышь обратно в учреждение по уходу за животными, подождите, пока он полностью восстановился и, кажется, ведут себя нормально.
    Примечание: Дополнительная пер- и послеоперационные стратегии обсуждаются Pritchett-Corning KR соавт 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Экспериментальная установка для выполнения микроинъекции и электропорации мыши яичка в естественных условиях, как он используется в соответствии с протоколом показано на рисунке 1. Несмотря на то, что можно получить изготовлены промышленным микропипетки, мы предпочитали, чтобы генерировать свои собственные пипетки, потянув (фиг.1А ) и фаски (Рисунок 1В) стеклянные капилляры, чтобы они соответствовал нашим потребностям. Оборудование для микроинъекции и электропорации показано на рисунке 1В. Из соображений эффективности трансфекции, это имеет важное значение, чтобы использовать прямоугольной формы электропоратора.

На рисунке 2 приведены основные этапы операции мыши с особым акцентом на подготовку выводного протока. В этом контексте яичко подвергается (Рисунок 2А) и отводящий канал идентифицируется бинокулярного наблюдения и освобождается от жировой ткани (FigurE 2B). Затем отводящий канал прокалывается с микроинъекции пипетки и плазмиду вводили раствор (Фигуры 2C-E). Наконец, загружается яичка зажат между двумя электродами и трансфецируют применяемых прямоугольных импульсов (Рисунок 2F).

Это в естественных условиях трансфекции подход позволяет использование различных плазмид, кодирующих различные репортерных генов. Здесь мы использовали репортер вектор pEGFP-C1 (3А), которая выражает повышенную зеленый флуоресцентный белок (EGFP), а также pDsRed2-N1 (3С) вектор благоприятных трансактивацию красного флуоресцентного белка (DsRed2). В нашем случае, как гены-репортеры были под контролем цитомегаловируса человека раннего промотора-(CMV).

Для того чтобы оценить успех трансфекции микроинъекции и электропорации яички собирали через 3 дня после всей процедуры и наблюдают под fluoresценция микроскопия (Рисунок 3). Для детального исследования, яички были формальдегида фиксированной, заливали в парафин, ломтиками (5 мкм), а также контрастному окрашиванию К-Pro-3, в результате чего синего цвета ядер. В конце концов, срезы исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии. Два примера возможных результатов трансфекции можно видеть на рисунке 4. Экспрессия репортерного гена EGFP обозначено зеленой флуоресценции, трансактивации DsRed2 обозначена красным излучением.

Рисунок 1
Рисунок 1 Оборудование для микроинъекции в естественных условиях и электропорации мыши яичка. Стеклянные капилляры формируются с использованием микропипетки съемник (A), а кончики заострены использования микропипетку beveler ( (С). Вместо использования коммерческого микроманипулятор мы использовали XYZ-кросс таблицу микроскопом и прикрепленный блок для хранения микропипетку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2 Иллюстрация в естественных условиях яичка микроинъекции и электропорации разбирательство в мыши в том числе предварительного хирургического вмешательства. Доступ к яичка предоставляется путем открытия живота мышь, которая была под наркозом раньше. Разрез делается чуть выше препуциальных желез. После выявления яичко, он освобождается от брюшного жира годовых DS (А). Под бинокулярного наблюдения, отводящий канал идентифицируется и жир-освобождены. Микроинъекции пипетки расположить рядом протока, а острый конец иглы направлен в сторону выводного протока (B). Стеклянный капилляр вставляется в протока и перемещается в направлении яичка должен быть расположен непосредственно в рете семенников (С). Порядок применения ДНК и заполнения семенных канальцев контролируется с помощью Fast Green (D). Только 2/3 яичка заполняется в целях предотвращения вреда ткани (E). Для конечной стадии электропорации, яичко зажат между электродами пинцет типа применять электрические импульсы квадратных (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

"> Рисунок 3
Рисунок 3 Всего горе семенников через 3 дня после электропорации в естественных При флуоресцентной микроскопии, трансфицированных семенников из C57BL / 6 мышей показывают экспрессию расширенной зеленого флуоресцентного белка -. EGFP (А) и красный флуоресцентный белок - DsRed2 (С) и кодируется на pEGFP- C1 и pDsRed2-N1 плазмиду, соответственно. Экспрессия обоих репортерных генов была под контролем CMV-активного повсеместно-промотора элемента. Эффективной трансфекции целевых семенных канальцах свидетельствует интенсивности флуоресценции. Панели (B) и (D) иллюстрируют автоматическое флуоресценцию нетрансфицированных управления яичка. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4 Разделы мыши яичка 3 дня после одностороннего естественных электропорации в с pEGFP-C1 плазмиды. Трансфекцию исход фиксированной мыши яичка секций (5 мкм) показаны через 3 дня после одностороннего электропорации с pEGFP-C1 плазмиды. Успешно трансфецировали яичек трубчатый cellsare указанную зеленой флуоресценции. TO-PRO-3 контрастно ядра обнаруживаются синим излучением и В). Круглые структуры типичны для организации клеток в семенных канальцах. Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследования в области репродуктивной биологии, особенно в области мужской фертильности и сперматогенеза неизбежно опирается на живые организмы. Для того чтобы исследовать функцию яичек, никакой адекватной культуры клеток системы / в пробирке не установлено способны отражать все важнейшие морфологические изменения от диплоидного сперматогоний в гаплоидном зрелого сперматозоида 1,2. Таким образом, поколение генетически модифицированных животных часто является необходимым и в этом качестве ценного инструмента в мужской репродуктивной биологии. Для этого, значительное число трансгенных, нокаут и забивные мышей были созданы, которые доставлены понимание мужской фертильности. Тем не менее, поколение трансгенных мышей, как правило, делается путем введения генные конструкции в пронуклеус оплодотворенных яиц. Тем не менее, этот метод требует много времени и должна быть сделано путем специализированных лабораториях. Процедура для создания нокаут или стук-в животныхеще более сложным.

Другой способ изучения функции генов живых организмов модели является временной трансфекции. Тем не менее, общая трансдукция с вирусными векторами может привести иммуногенные или другие неспецифические реакции и требует специальных правил техники безопасности. Липофекция 3 и 4 бомбардировки микрочастицами подходы к сожалению, сдерживается в определенной глубине клеток и даже может вызвать вредное воздействие на ткани.

Тем не менее, по средствам непосредственно приложенного электрического прямоугольных импульсов на целевой ткани, так называемой электропорации, это действительно возможно для трансфекции живую ткань, например, настоящим яичка мыши. Кроме того, этот метод требует только низкие издержки, низкую оборудование и должным образом квалифицированный лабораторный Personal.

Еще примечательно выгоды, связанные с в естественных условиях методов трансфекции по сравнению настойчиво гена-изменены режиме животныхLs является возможность котрансфекции. Хотя трансгенные или нокаут-мышей, как правило, несут только одну генную конструкцию, трансфекции в естественных условиях дает всесторонние одновременных анализов различных конструкций генов в пределах одной клетки. Это может быть сделано с помощью различных репортерных генов, например, по сравнению с GFP, YFP или Gaussia- по сравнению с Renilla-люциферазы, так что сравнительное исследование дикого типа и мутантных генов эффектов возможно.

Кроме того, за счет применения специфических промоторов типа клеток, экспрессию генных конструкций могут быть изысканно направлены на специфические клетки в пределах яичка. Например, это может позволить выражение яичек ген только в клетках Сертоли или сперматоцитах.

Протокол, представленные в этой статье охватывает два важных методов в области мужской репродуктивной биологии. Первый микроинъекции в семенных канальцах с подготовкой впрыска капилляра. Это текNique была широко вовлечена в зародыше / клеточной трансплантации либо от трансгенных животных получателю 7 или в контексте ксенотрансплантации 8 стволовых. Второй метод электропорации трансфекции, способный индуцировать переходные поры в плазматической мембране, а также направленной объемного потока заряженных молекул, как плазмиды, обеспечивая вход в определенных клеток или тканей, а. Этот конкретный направление макромолекул путем электропорации часто ценится в одностороннем порядке нейронной трансфекции клеток часто делается в утробе 9,10 или в разработке сетчатки 11.

В предыдущем Подробный протокол метод включает в себя в качестве первых важнейших шагов на анестезию мышей-самцов, экспозиция яичка через брюшную поражения, подготовка выводного протока, а также микроинъекции в протока. Поскольку эти действия вполне требовательны, поэтому мы настоятельно рекомендуем, чтобы первой практике на мертвых животных, прежде чем выполнять оperations на живые мышей. Кроме того, инструкции предоставляются о том, как внедрить и заполнить семенных канальцев с плазмидной ДНК и как вести электропорации яичка соответствующим образом.

Благодаря применению электричества во время ЕР, производство тепловой энергии может вызвать повреждение тканей, особенно при высоком напряжении. Это увеличение эффективности трансфекции 12, 13, 15 по повышенным напряжением сопровождается неблагоприятного влияния яичек сокращение 12-14. Наиболее благоприятный диапазон напряжения, кажется, между 30-50 V, гарантируя небольшие воздействие на целостность яичек, обычное качество спермы 16, нормальное поведение спаривания 17, поддержание потомства производства способности 16-20, а также достаточно трансфекции эффективность.

Что касается интенсивности экспрессии генов, передаваемых генных конструкций, Yomogida др. 21 также показали заметно пониженную выражession линеаризованных векторов 3 дня после осуществления ЕР тогда кольцевой плазмидной ДНК, очевидно, еще поддерживает выражение через 35 дней с самым высоким в клетки Сертоли. Это говорит о том, что лучшие результаты получены при использовании плазмидные конструкции для электропорации, как это сделано здесь. В нашем подходе мы исследовали эффективность трансфекции через 3 дня после электропорации в связи с наблюдением, что этот период времени является достаточным для адекватного заживления ран, репарации целостности клеток, а также желаемой правильной экспрессии репортерных белков EGFP и DsRed2. Таким образом, время инкубации из 3-х дней после хирургического вмешательства и всей процедуры трансфекции представляется необходимым, чтобы гарантировать надлежащим образом восстановлены клеточные функции, включая экспрессии гена таким образом, что сигнал флуоресценции, как интенсивно, насколько это возможно могут быть обнаружены обеспечения надежного результата трансфекции. В отношении эффективности трансфекции, Yomogida и соавт. 21, показало, что йе соматические клетки Сертоли, по-видимому более чувствительны к ЕР-трансфекции, чем зародышевых клеток. Мы рекомендуем ко-трансфекции с яичка целевых и контрольных плазмид, каждый, кодирующий другой гена-репортера.

Представленная электропорации подход применим к широкому спектру возможных вопросов, касающихся мужчин процессов зародышевых клеток и рождаемости. Например, он может быть использован для анализа регуляторные элементы сперматогенеза-специфических генов 17,22. Метод также подходит для с потерей функции исследований с малых интерферирующих РНК 23 и получить-из-функции изучает 24. Кроме того, существуют многообещающие шансы даже выполнить EP для терапевтического лечения и получения трансгенных потомков как исследовательские группы уже показали 18,20,25.

Таким образом, показано новое методологический подход мыши яичка в естественных условиях электропорации в сочетании с выводного протока microinjection плазмиды конструкций, мы надеемся подняться на ценную технику для успешного разгадке природы сперматогенеза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Мартен Михаэлис, Александр Собчак, и Йоахим М. Weitzel работал в Институте репродуктивной биологии, Лейбница Института сельскохозяйственных животных биологии (FBN), Dummerstorf, Германия, заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgements

Мы благодарим Биргит Westernstroeer Центра репродуктивной медицины и андрологии в Университете Мюнстера для преподавания микроинъекции яичек. Кроме того, мы благодарны Урсула Antkewitz и Петра Reckling для оказания технической помощи. Мы благодарим Немецкий исследовательский фонд (DFG) за поддержку этой работы (WE2458 / 10-1).  

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Sigma 1-15 PK
Spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Micropipette puller Narishige PC-10 vertical capillary puller
Microinjection capillaries Clark GC100-10 borosilicate standard wall
Micropipette beveler Bachofer Typ 462 rotating disk beveler
Electroporator Nepagene CUY 21EDIT square wave electroporator
Tweezer electrodes Nepagene CUY 650P5 5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C
Cold light source Zeiss KL 1500LCD
Microinjection pump Eppendorf Femtojet
Micromanipulator homemade XYZ cross table
Surgical instruments FST scissors, forceps, needle holder
Fine forceps FST Dumont #5, #7 efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler FST Michel, 12029-12
Michel suture clips FST Michel, 12040-01 7.5 x 1.75 mm
Surgical suture Catgut, Markneukirchen, Germany Catgut 00
Syringe with 30 G needle B. Braun Omnican 40 to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit Promega Cat. # A2495 plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1 Clontech Cat. #6084-1 CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1 Clontech Cat. #6084-1 CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye Sigma F7258-25G for dilution in ddH2O
10% Ketamine Serum Werk, Bernburg, Germany Urotamin mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine Serum Werk, Bernburg, Germany Xylazin mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium Bode Chemie Sterillium disinfection
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide Invitrogen T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl Carl Roth 3957.1
Ibuprofen, Dolormin Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany 01094902 analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl Carl Roth 6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O Carl Roth T106.2
18 mM KH2PO4 Carl Roth 3904.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
  2. Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. Models of in vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).
  3. Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
  4. Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
  5. Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
  6. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  7. Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
  8. Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
  9. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
  10. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
  11. Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
  12. Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
  13. Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
  14. Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
  15. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
  16. Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
  17. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
  18. Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
  19. Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
  20. Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
  21. Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
  22. Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
  23. Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
  24. Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
  25. Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
  26. Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats