Metode til Mikroinjektion af

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Metoder, der producerer morphant embryoner er afgørende for at studere udviklingsmæssige mekanismer og gen-regulatoriske netværk. Havet stjerne Patiria miniata er en ny model for disse studier. Her præsenterer vi en protokol for opnåelse af kønsceller, der producerer kulturer af embryoner, og hurtig mikroinjektion af zygoter fra denne art.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cheatle Jarvela, A. M., Hinman, V. A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes. J. Vis. Exp. (91), e51913, doi:10.3791/51913 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pighuder har længe været en favorit modelsystem til undersøgelser af reproduktion og udvikling, og for nylig til undersøgelse af genregulering og udviklingen af ​​udviklingsprocesser. Havet stjerne, Patiria miniata, er ved at vinde udbredelse som en model for disse typer af undersøgelser, der tidligere blev udført næsten udelukkende i søpindsvin, Strongylocentrotus purpuratus og Lytechinus variegatus. En fordel ved disse modelsystemer er let at fremstille modificerede embryoner, hvor et bestemt gen er op eller nedreguleret, mærkning af en gruppe af celler, eller indføre et reportergen. En enkelt mikroinjektion metode er i stand til at skabe en bred vifte af sådanne modificerede embryoner. Her præsenterer vi en metode til at opnå kønsceller fra P. miniata, der producerer zygoter, og indføre forstyrrende reagenser via mikroinjektion. Sunde morphant embryoner isoleres efterfølgende for kvantitative og kvalitative studier af gene funktion. Tilgængeligheden af ​​genom og transkriptom data for denne organisme har øget de former for undersøgelser, der udføres og den lethed at udføre dem.

Introduction

Havet stjerne, Patiria miniata, (almindeligvis kendt som bat-stjerne) fremstår som en interessant og alsidig model for en række cellulære 1- 3, udviklingsmæssige 4,5, evolutionær 6 til 8, og økologiske undersøgelser 9- 11. Voksen P. miniata er fordelt langs Stillehavskysten fra Sitka, Alaska til Baja, Californien 12 og let vedligeholdes i marine akvarier. Oocytter er opnåelige året rundt og hver hun kan kaste titusinder af æg. Oocytter let modnet og befrugtet eksternt 13. De resulterende embryoner er gennemsigtige tillader nem observation; de udvikler synkront, og kun kræver havvand til udvikling. Hele genom samling og flere transcriptomes er også tilgængelige for P. miniata ( Echinobase.org ). Sådanne fordele gør dem ideelle til en række af forskningog undervisning.

I de seneste år, s miniata er blevet en model for udviklingsmæssige genregulatorisk netværk analyser 14.-16. Formålet med sådanne undersøgelser er at identificere hele kompliment af regulerende gener og bestemme netværket af deres samspil. Meget af dette arbejde indebærer forstyrrende genekspression gennem indførelse af antisense-oligonukleotider eller in vitro-syntetiserede mRNA'er. Derudover er cis regulatoriske analyser anvendes til at karakterisere funktionen af regulatorisk DNA 15. Disse analyser kræver indførelse af perturbations- reagenser og / eller DNA-reporter-konstruktioner i embryoner. Endvidere at karakterisere de efterfølgende virkninger af disse forstyrrelser, må man analysere mange embryoner til ændringer i genekspression af potentielle mål. Teknikker til mikroinjektion af mange hundrede zygoter er centrale for dette arbejde.

Pighuder, inklusiv P. miniata de novo ved mikroinjektion. Mikroinjektion giver mulighed for at ændre embryoner med reagenser, der ikke er celle-gennemtrængelig. Følgende protokol beskriver en metode til at indføre DNA, mRNA, celle sporstoffer, og morpholino antisenseoligonukleotider ind i hundredvis af befrugtede æg i en 2-3 timers mødet gennem mikroinjektion. Dette giver tilstrækkeligt materiale til en række efterfølgende eksperimenter, herunder, men ikke begrænset til, qPCR, in situ-hybridisering, RNA-Seq og western blotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hold alle havvand eller kunstigt havvand (SW), voksne dyr, og kulturer ved 15 ° C så meget som det er praktisk. Sikre æg og zygoter holdes nedsænket i SW.

Kommercielt fremstillede havet salte rekonstitueret med destilleret eller omvendt osmose vand tjener godt som en kilde af SW. Tjek saltholdighed ved hjælp af et hydrometer og justere salte eller vand for at opnå optimale niveau. Hold Vægtfylde niveauer mellem 1,020-1,025. Hold alle glasvarer og plastvarer adskilt fra alt andet laboratorieudstyr for at undgå enhver forurening med kemikalier. Ren embryo kvalitet laboratorieudstyr ved at skylle med demineraliseret vand eller lejlighedsvis opblødning i fortyndet natriumhypochlorit efterfulgt af skylning flere gange i vand.

1. Indhentning og modning mælke fra Patiria miniata Voksne

  1. Vælg et dyr at udskære gonaderne. Bestem sex efter excision ved at kigge for tilstedeværelsen af æggestokke eller testikler, fordi P. miniata ikke selvxually dimorf.
  2. Skær en lille åbning, der ikke er større end 1 cm, langs siden af et hav stjerne arm med en skalpel (figur 1A). Brug små stumpendede pincet trække sig tilbage kanter snittet for at få adgang gonaden væv og træk gonade væv ud gennem snittet.
    BEMÆRK: Undgå at trække ud tarmvæv, som er en løs grå eller brun væv (figur 1B). Ovarierne er typisk orange, gul eller lysebrun (figur 1C), mens testiklerne er hvide eller beige, og når forstyrret vil forårsage havvand bliver mælket eller uklar (figur 1D).
  3. Retur hunner til akvarierne. Isoler hanner i en time eller to i en beholder af SW, da stress fra håndtering kan fremkalde gydning. Dyr helbrede langs incisionssted og fortsætte med at give mælke herfra til flere måneder.
  4. Saml testiklerne i et 1,5 ml Eppendorf-rør med så lidt SV som muligt og opbevares på is indtil brug. Opbevar alle testiklerne ikke osed på dagen for indsamling ved 4 ° C i op til en uge.
  5. Saml ovarier i et lille glas dyrkningsskål i en flere milliliter SW. At frigøre oocytter fra frugtknudevæv, drille hinanden vævet med to par tænger, indtil ingen store stykker tilbage.
    BEMÆRK: Optimalt er de fleste af de oocytter fuldt udviklet. Sådanne oocytter er store, runde og klar gul eller lysebrun med en særskilt germinale vesikel i oocytten (figur 2A) i forhold til den delmængde af uudviklede oocytter, som er mindre, brun, kornet og uigennemsigtig (figur 2B). Hvis mere end omkring 25% af oocytter er af den ubebyggede sort, vælg en anden kvinde til at opnå oocyter.
  6. Hæld oocyter og resterende væv gennem en mesh-filter kop med en 200 um porestørrelse og indsamle flyde igennem. Dette vil indeholde alle sorter af oocytter, men fjerne ovarievæv. Fordrive de resterende oocytter fra vævet fanget af filteret ved sprøjtning wed SW fra en sprøjteflaske. Filter kopper er lavet ved hjælp af en 50 ml konisk rør (figur 3A-A ').
  7. Hæld gennemstrømningen fra trin 1.6 gennem en 100 um mesh filter kop. Kassér små oocytter i flow gennem. Stort fuldt udviklede oocytter der er klar til modning vil bo på filteret. Skyl oocytterne i et rent 200 ml bægerglas.
  8. Tilføj 95 ml SW til en 200 ml bægerglas af oocytter. Der tilsættes 5 ml 200 uM 1-methyladenin til en slutkoncentration på 10 uM.
  9. Overfør oocytterne til en stor lavvandet dyrkningsskål og sted ved 15 ° C. En høj overfladeareal til volumen dyrkningsskål tillader iltudvekslingen. Oocytterne ikke modne eller ikke kan udvikle sig godt, hvis de er overfyldte i denne modning fase. Opdelt i flere retter af SW plus 10 uM 1-methlyadenine indtil kulturen er mindre end 200 oocytter / ml.
  10. Lad oocytterne at modne i 45-90 minutter, men ikke længere, da dette vil gøre oocytterne ikke kan være fertilized. At afgøre, om modning er færdig, se på oocytterne under et dissekere omfang. De germinale vesikel bevæger sig mod og sikringer med cellemembranen under modning. Derefter bryder sammen, og derfor er ikke længere synlig i modne oocytter (figur 2C).

2. Befrugtning af modne oocyter

  1. Valgte en lille klynge af testikel væv, groft ært, og hakkekød i et lille glas dyrkningsskål med ca 1 ml SW.
  2. Anvend en Pasteur-pipette til at overføre 2-3 dråber af den resulterende mælkeagtige havvand til omkring 100 ml af modne oocytter og slyng dyrkningsskålen for at blande. Undgå at overføre stykker af testikel væv. Undgå at tilsætte større mængder sæd, da dette kan resultere i polyspermi og efterfølgende dårlig udvikling.
  3. Efter flere minutter observere oocytterne under et dissektionsmikroskop. Befrugtede æg eller zygoter, har en befrugtning kuvert, hvilket er en klar boble, der rejser sig fra cell membran (figur 2D).
    BEMÆRK: Du må ikke gå videre med kulturen, hvis mindre end 90% af æg befrugte siden fattige fertilisationsgrader er en indikation af en usund kultur, der også kan ikke udvikle sig godt.
  4. Efter befrugtningen er færdig, skal du ændre SW på zygoter ved at hælde gennem en 100 um mesh-filter og skylning i en kultur fad med frisk SW. Det er vigtigt at fjerne den overskydende sædceller til at forhindre iltmangel. Placer dyrkningsskålen ved 15 ° C i 15-30 min.

3. De-jellying og Roning befrugtede æg

  1. Forbered injektion retter ved at tage låget fra en 60 x 15 mm polystyren petriskål.
    1. Tegn en permanent tusch linje på bagsiden af ​​skålen, omkring det område, der matcher synsfeltet på mikroinjektion mikroskop. Dette sikrer, at alle roet embryoner under mikroskop synsfelt.
    2. Brug et glas Pasteur-pipette til at score en linje gennem cirklen, sreferably ud til den ene side af cirklen (figur 3B). Brug denne linie senere at bryde injektionsnåle (trin 4.5).
      Brugte reagenser almindeligvis til at klæbe søpindsvin embryoner, f.eks protaminsulfat eller poly-L lysin, er unødvendige: BEMÆRK. De-gelé P. miniata zygoter klæber meget godt til uovertrukne plast. Bemærk, at de ikke klæber godt til glas retter.
  2. Tilføj omkring 10 ml SW til hver skål, så overfladen er dækket, men vandet vil ikke plaske for meget i skålen, da dette kan forstyrre roet embryoner.
  3. Fjern P. miniata zygote gelé frakke med syre SV forud for roning. Denne gelé pels er mere omfattende end den, der blev observeret for model søpindsvin arter.
    1. Forbered syre SW i området pH 4,0-4,2. PH er afgørende for at tillade effektiv fjernelse af gelé frakke, mens den tillader en normal udvikling.
    2. Tilføje enkelte dråber 1 N (1 M) HCl i SW til en 1 L bestand af SW. Lad hver dråbe at blande den heltog overvåge pH, før du tilføjer mere HCI.
      BEMÆRK: en til flere ml HCl resultater i passende pH, men føjer ikke hele mængden på én gang.
      BEMÆRK: Klargør 1 N HCI i stinkskab med SW og 12 N (12 M) HCI.
    3. Fjern SV på zygoter ved at hælde dem på en 100 um mesh-filter. Skyl ind i et 200 ml bægerglas i den mindste mængde af SW muligt (ca. 10 ml). Fyld bægeret op til 150 ml med syre SW (pH 4,0) og tillade zygoter at sidde i det sure SW i 3 min.
  4. Strip gelé pels fra zygoter ved at hælde dem frem og tilbage mellem to 200 ml bægerglas, hver gang passerer zygoter gennem en 200 um mesh filter. Hæld zygoter gennem filteret omkring 5-10x løbet om en 2 min tid vindue.
  5. Fjern syre SV ved at hælde zygoter på en 100 um mesh-filter. Skyl zygoter ind i et lille glas dyrkningsskål med SW. De-gelatineret zygoter kan klæbe til plast retter. Row embryoner øjeblikkeligt; de begynder at producere mere jElly frakke, som fører til dårlig adhæsion til plastskåle over tid.
  6. Brug en mund pipette (figur 3C-C «) at afhente zygoter fra glasset kultur fad og placere dem i lige linjer på injektion retter. Smelt midten af ​​den tynde side af en Pasteur-pipette over en flamme, indtil glasset er blød. Trække hurtigt enderne af glas fra hinanden for at frembringe en meget tynd strækning af glas. Når glasset er cool, brække den lille ende af Pasteur pipette (for yderligere information om at udarbejde en mund pipette se Wessel et al. 2004 17 eller søde m.fl.. 2004 18).
    1. Lav en robåd pipette, således at diameteren er blot større end diameteren af ​​de embryoner, således at kun en enkelt zygote vil ind og ud af pipetten ad gangen. Dette vil gøre det muligt for en enkelt række til at danne. Pipetter med mindre diameter kan fratage befrugtning kuvert og forstyrre zygoter som P. miniata zygoter ikke har en hyalinmembran ennd er helt bløde.
    2. Hvis zygoter ikke holde sig til plast skålen, holde dem for yderligere tid i syre SW (op til flere minutter mere). Alternativt kan en mindre diameter pipette kan støtte i at fjerne gelé lag for at tillade zygoter at holde mere effektivt.
    3. De zygoter er svagt positivt opdrift og har tendens til at flyde eller svæve lige over bunden af ​​skålen. I dette tilfælde placere ro pipetten så zygoter forsigtigt presset på overfladen af skålen, når de forlader pipetten (figur 3D).
      BEMÆRK:. Det er tilladt at montere mange rækker på disse retter P. miniata embryonale membraner ikke bliver vanskeligere at trænge ind over tid, og derfor kan man injicere hundredvis af zygoter på en enkelt skål.

4. Injektion af Zygoter

  1. Forbered injektionsopløsninger med passende koncentrationer af morpholino antisenseoligonukleotider (Maso), mRNA eller DNA i en slutkoncentrationentration 200 mM KCI. 400-800 uM MASO og 2,5 ng / ul DNA tendens til at producere morphant fænotyper samtidig minimere toksicitet. Den endelige koncentration i ægget bliver 1/125 th startkoncentration 14. Til injektionsopløsninger indeholdende Masos, opvarmes til 65 ° C i 5 minutter umiddelbart før brug, og derefter opbevares ved stuetemperatur.
    1. For at lette sortering injicerede embryoner tilføje rhodamine dextran sporstof til injektionsopløsningen for at opnå en koncentration på 0,1%.
  2. Forbered injektionsnåle ved at trække glas kapillarrør (1,0 mm OD x 0,75 mm indvendig diameter, 100 mm længde) i en nål trække instrumentet efter producentens anvisninger. Nåle er egnet til injektion i søpindsvin fungerer også godt for søstjernerne, så bruger lignende parametre 19.
  3. Lægge ca. 2 pi injektion opløsning i en injektion nål ved hjælp af en microloader pipettespids.
  4. Sæt den stumpe ende af kanylen ind i manipulator. Indstil picospritzer til 100 ms puls og et lufttryk på 40 PSI.
  5. Placer en skål af roede embryoner på mikroskop scenen og har alle embryoner synsfelt. Orientere skålen, således at den markerede linie er på den side nærmest nålen. Placer nålen i en omtrent 60 ° vinkel, så spidsen er nær midten af ​​linjen og lige over overfladen af ​​vandet.
  6. Fokus på den markerede linie og sænke nålen indtil spidsen kommer i fokus. Sænk spidsen lidt mere og bryde det åbne ved at køre den forsigtigt ind i kamme af den markerede linie. Løft spidsen fra overfladen af ​​skålen og placere den på toppen af ​​den første række af zygoter og fokusere på de zygoter.
  7. Sænk spidsen sådan, at det vil spidde centrum af zygote kommer ind fra omkring en 60 ° vinkel. Nålen let trænger s miniata zygoter. Træd på fodpedalen (eller andre midler til at tvinge materiale fra kanylen) indføre en bolus af InjeIndsatsen løsning i embryoet.
  8. Målet for en bolus, der er 20-30% af diameteren af ​​embryonet, eller mellem 25 og 80 pl. Hvis bolusen er større eller mindre end dette, justere varigheden af ​​injektionen på picospritzer og indsprøjte den næste embryon. Fortsæt med at justere varigheden at opnå den ønskede bolusstørrelse. Start ved 100 ms varighed. Re-knække nålen hvis den er større end omkring 200 ms er nødvendig for at indføre passende bolus. Kassér nålen og forberede et nyt, hvis der er behov for mindre end 15-20 ms for at opnå dette bolusstørrelse da nålen er for stor og kan forstyrre den normale udvikling.
  9. Fortsæt at injicere de resterende zygoter af injektion skålen. Embryoner kan let injiceres indtil spaltningsprodukter starter og i enkelte blastomeres efter første spaltning. Periodisk løfte nålen over overfladen af ​​vand for at fjerne zygoter, der klæber på nålen. Hvis det er nødvendigt igen bryde spidsen af ​​nålen eller indlæse en ny nål, hvis en blokering opstår.

  1. Lad embryoner til at udvikle ved 15 ° C i SW. Fastholde højt overfladeareal til volumen i kulturerne for at tillade ilt udveksling. Sikre embryoner er ikke overfyldt; holde kulturer på eller under 200 embryoner / ml. Afhængig af den ønskede fase af embryo, planer om at indsamle injicerede embryoner på omkring 20-24 timer efter befrugtningen.
    BEMÆRK: Dette er ofte en ideel tid til at sortere og indsamle og fordi normalt fostre let kan skelnes morfologisk, men er endnu ikke svømning.
  2. Hvis embryoner er klækket, salt forsigtigt chok at forhindre svømning. Tilsæt 200 pi af 5 M NaCl til 10 ml SW i injektion skålen mens der forsigtigt hvirvlende SW. Efter nogle få minutter vil embryonerne falde til bunden af ​​skålen. Saml disse og flytte dem til normal saltholdighed SW.
  3. Saml injicerede embryoner efter en passende fluorescerende lyskilde forenelig med sporstof anvendes i plast proon, opløsning. Hvis der ikke sporstof blev anvendt, sortere embryoner at selektere for normal morfologi.
  4. Ved hjælp af en mund pipette, tegne fluorescerende embryoner op med en minimal mængde af SW og blæse dem ud i en lille dyrkningsskål fyldt med SW. Ideelle munden pipetter har en tilstrækkelig stor åbning til embryoer at blive trukket ind og ud uden at beskadige dem, men ikke så stort, at uønskede embryoner og fremmede SV også trækkes op.
  5. Når alle de ønskede embryoner er blevet indsamlet i den nye fad, observere embryoner under fluorescerende lys, og fjern eventuelle un-injicerede embryoner eller dårligt udviklede embryoner.
  6. Kultur sorteres embryoner til ønskede faser i en inkubator og fortsætte med billedbehandling eller andre ønskede protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med denne protokol er at indføre reagenser i embryoner. Vi demonstrere effektiviteten af ​​protokollen ved at indsprøjte en DNA-reporter-konstrukt, som driver ekspressionen af ​​grønt fluorescerende protein (GFP). Injicerede embryoner udtrykker GFP i klonede patches (figur 4A-B) som DNA inkorporerer under tidlig spaltning. Mange reagenser, der er ønskeligt at indføre i embryoner er giftige i store mængder og til suboptimale partier af embryoner. Toksicitet manifester forsinker udvikling, arrestere udvikling i tidlig spaltning eller det befrugtede æg scenen, eller ved at pålægge afvigende udvikling (figur 5A-C).

Figur 1
Figur 1. Indhentning mælke fra P. miniata voksne. A) at udskære kønskirtler lave et snit på siden af en arm proksimaltil midten af dyret. B) Den mørkebrune materiale trækkes fra dette indsnit er tarmvæv. Undgå at trække tarmvæv, da det vil skade dyret. C) frugtknudevæv typisk orange farve som vist her, men kan også være gul eller lysebrun. D) Testes er hvide eller beige farve, som vist. Alle skalapanelerne betegne 1 cm.

Figur 2
Figur 2. Modning og befrugtning af oocytter. A) Sunde oocytter der er klar til modning er store og klare med en synlig germinal vesikel. B) Oocytter, der ikke er klar til modning er mindre, brun, og kornet udseende. C) en oocyt, der er blevet modnet med 1-methyladenin . Den germinale vesikel er brudt sammen. D) en zygote omgivet af en fertilization kuvert. E) Undgå kulturer med store oocytter, som ikke kan modnet fordi disse oocytter ikke vil blive fjernet ved filtrering. Sådanne oocytter er lidt mindre end den, A. og er mørkere brun og kornet struktur. Skalalinjen i A betegner 50 um og repræsenterer skalaen for billeder AE.

Figur 3
Figur 3. Apparater til montering. AA ') En mesh-filter fastgjort til et 50 ml konisk rør. Den tilspidsede ende af røret, og i midten af låget er skåret ud til at give kulturer skal hældes gennem røret og filtreres. B) En injektion skålen konstrueret ud fra låget på en 60 x 15 mm polystyren dyrkningsskål. En cirkel tegnet omkring centrum skitserer synsfeltet af injektionen mikroskop og tjener som en guide til rowing embryoner. En linje scoret into skålen er nyttigt for at bryde injektionsnåle. CC ') Mouth pipette set-up. Montér et mundstykke i den ene ende af en flere meter lang gummislange. Monter den anden ende til en Pasteur-pipette, som er blevet formet ved kortvarigt smeltning og trække den smalle ende af glasset. D) Skematisk viser en ideel ro Pasteur-pipette form og bredde til at fremme stikker uden at beskadige embryoner. Når bryde ende ud af den trak pipette, er det nyttigt, hvis ende er tilspidset for at forhindre nye zygoter fra variabel væk fra fadet. Alle skalapanelerne betegne 3 cm.

Figur 4
Figur 4. Reagenser succes introduceret af Mikroinjektion. A) DIC en blastula embryo injiceret med et GFP reporter plasmid. Embryoet har normal morfologi. B) GFP EXPREssion i vist i A. C embryo) DIC billede af to morfologisk normale blastula embryoer. D) Et foster fra C udsender en rød fluorescens fra indførelsen af Texas Red dextran. Den anden embryo er un-injiceres og udviser ingen fluorescens. Skalapanelerne betegne 50 um. Målestokken i A repræsenterer skalaen for A og B. Scale bar i C repræsenterer skalaen for C og D.

Figur 5
Figur 5. Overinjection og reagens toksicitet resultat i arresteret eller afvigende udvikling. Alle billeder er af embryoner 24 timer efter injektion fra samme injektion parti. AA ') En overinjected zygote arresteret i én-celle stadiet. BB') Et embryo anholdt i begyndelsen af ​​spaltning. En sund foster vil splitte symmetrisk, mens fosteret anholdtpå grund af unormale celledelinger. CC ') Et embryo med vildt afvigende udvikling på grund af toksicitet. Mens fosteret er formet omtrent som en blastula embryoer (D), er asymmetrisk og unormalt fortykket. DD) Et korrekt der udvikler injiceres blastulaen embryo. Målestokken i A betegner 50 um og repræsenterer skalaen for alle paneler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er to vigtige skridt, der er svært for nybegyndere i denne teknik, men er afgørende for en vellykket skabe morphant embryoner. Den første er at vælge sunde oocytter, der vil modnes og befrugte ordentligt. Den procentdel af den normale udvikling i en kultur afhænger af sæsonen, sundhed af dyret, og det antal gange, oocytter er blevet høstet fra et enkelt individ. Oocytter tendens til at være af en bedre kvalitet fra april til oktober. Det er vigtigt at se nøje på de oocytter, før du fortsætter til at sikre, at de fleste ligner figur 2A i stedet figur 2B. Det er tilladt at have et lille antal af oocytter, som ikke vil ældre, især hvis de er små nok til at bortfiltrere som oocytterne behandlet. Lejlighedsvis, oocytter, der er uudviklet er næsten lige så stor som fuldt udviklede oocytter, der er klar til modning. De adskiller sig ved deres kornet, brun coloring (Figur 2E). Brug ikke partier af oocytter af denne type, fordi filtrering ikke vil isolere fuldt udviklede oocytter fra uudviklede oocytter og de ​​ofte resultere i abnorme embryokulturer der er mere tilbøjelige til at udstille de fejl, der ses i figur 5.

Den anden afgørende skridt er injektion bolusstørrelse. Indførelse en mængde af forstyrrende reagens, der er tilstrækkelig stor til at udøve en virkning, men ikke så stor, at forårsage ikke-specifikke virkninger. Første gang en forstyrrende reagens anvendes, er det nyttigt at udføre en titrering, hvor flere koncentrationer af reagens forsøgt. Udfør efterfølgende microinjections med den højeste koncentration, der ikke forårsager udviklingsmæssige abnormiteter, der ikke er relateret til den forventede fænotype, eller forsinkelse udvikling (figur 5A). Undgå injektion af en bolus, der er større end 30% af diameteren af ​​embryonet, da dette kan forstyrre normal udvikling. Overdrevent lille bolus størrelser, af Contrast, er vanskelige at visuelt inspicere for ensartet dimensionering, som kan føre til en overdreven vifte af perturbationsmetoder fænotyper tværs gentagelser.

Forstyrrende reagenser kan forårsage udviklingsmæssige forsinkelser eller ikke-specifikke fænotyper i effektive koncentrationsintervaller. Det er derfor meget vigtigt, at injicere søskende kontrol med en godartet reagens, såsom en standard kontrol MASO, standard DNA-konstruktioner eller rhodamin sporstof. Assay morphant embryoner, hvis disse kontroller viser normal udvikling. Injicerede embryoner, herunder kontrol, til tider udviser en rynket blastula fænotype, men de vil ofte fortsætte gennem resten af ​​udvikling normalt. Desuden, hvis en bestemt reagens konsekvent forårsager udviklingsmæssige forsinkelser i de resulterende morphant embryoner sammenligne disse embryoner til at styre embryoner til at bestemme, hvor mange timers forsinkelse, de oplever.

Der er nogle få attributter i denne metode, der kan begrænse dens nytte i filtreÆRLIGE eksperimentelle scenarier. Et sådant spørgsmål er, at man kun kan indføre reagenser ved befrugtede æg eller tidlige spaltningsprodukter faser. Dette er særligt problematisk, hvis genet eller sti af interesse er især afgørende i den tidlige udvikling og deraf morphant fostre levedygtige, eller for udviklingsmæssigt unormal for en meningsfuld undersøgelse. Sommetider dette problem er løst ved at injicere færre kopier af forstyrrende reagens, hvilket resulterer i en blidere, ufuldstændige knockdown. Hvis en passende celle-permeabel lægemiddel til målgenet eller sti findes, er det nyttigt at sammenligne fænotypen af ​​embryoner injiceret med reagenser på det befrugtede æg scenen med embryoer behandlet med lægemiddel ved en senere, mere passende tidspunkt. Da injektion af Masos eller mRNA'er giver større specificitet, er det mere kraftfuld at bruge denne metode i forbindelse med et lægemiddel-behandling undersøgelse i modsætning til at opgive mikroinjektion fordel for medicinsk behandling.

Endelig, selv om denne mikroinjektion metode vil producere en tilstrækkelig mængde af embryoer til en lang række efterfølgende anvendelser, vil det i bedste producere flere 100-1000 sunde held injicerede embryoner. Nogle ønskede eksperimenter kan kræve betydeligt mere materiale end dette. Andre metoder med held anvendes i søpindsvin systemet kan ændres for at skabe endnu større antal morphant hav stjerne embryoner, såsom pantropiske retrovirus 20, selv om denne metode er ny og har endnu ikke vundet udbredt brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret af forfatterne.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation IOS 0844948 og IOS 1024811

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyladenine Acros Organics (Fisher Scientific) AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter Small Parts (originally Sefar) CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter Small Parts (originally Sefar) CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875713A
Capillary tubing FHC, Inc 30-30-0 For pulling microinjection needles
Model P-97 Needle Puller Sutter Instruments P-97
Dextran, Rhodamine Green Life Technologies D7163 If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer
Instant Ocean Sea Salt Doctors Foster and Smith CD-116528 Also available in many pet stores
Microloader tips Eppendorf 5242 956.003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
  2. Terasaki, M., Runft, L. Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes. Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).
  3. O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization. J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).
  4. McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development. Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).
  5. Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).
  6. McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms. EvoDevo. 3, 17 (2012).
  7. Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star. BMC Biol. 11, 68 (2013).
  8. Morino, Y., et al. Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae. Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).
  9. Hart, M. W. Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin. Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).
  10. McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species. Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).
  11. Keever, C. C., et al. Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential. Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).
  12. Lambert, P. Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. UBC Press. (2000).
  13. Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).
  14. Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).
  15. Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins. Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).
  16. McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos. Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).
  17. Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. Obtaining and handling echinoderm oocytes. Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).
  18. Sweet, H., et al. Blastomere isolation and transplantation. Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).
  19. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).
  20. Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics