Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Anastasis (grego para "ressuscitar para a vida") refere-se a recuperação de células que morrem. Antes essas células se recuperar, eles passaram por checkpoints importantes da apoptose, incluindo fragmentação mitocondrial, liberação de citocromo c para o citosol, ativação de caspases, condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, blebbing membrana plasmática, o encolhimento celular, exposição da superfície celular de fosfatidilserina, e formação de corpos apoptóticos. Anastasis pode ocorrer quando os estímulos apoptóticos são removidos antes da morte, permitindo assim que as células morrem a inverter a apoptose e, potencialmente, outros mecanismos de morte. Portanto, anastasis parece envolver processos de cura fisiológicas que também poderiam sustentar as células danificadas de forma inadequada. As funções e mecanismos de anastasis ainda não estão claros, prejudicado em parte pelas ferramentas limitadas para a detecção de eventos passados ​​após a recuperação de células aparentemente saudáveis. Estratégias para detectar Anastasis permitirá estudos sobre os mecanismos fisiológicos, os perigos de células mortas-vivas em patologia da doença e possíveis terapias para modular anastasis. Aqui, descrevemos estratégias eficazes por meio de microscopia de células vivas e um biossensor caspase mamífero para identificar e rastrear anastasis em células de mamíferos.

Introduction

A apoptose (palavra grega para "cair para a morte") é geralmente aceite que é um processo de uma maneira que termina em suicídio celular 1-7. Perturbação genética de pró-morte genes resulta na sobrevivência de células extra que de outra forma morrem em animais inteiros, incluindo as células que já iniciadas 8,9 a via de apoptose. Da mesma forma, as manipulações genéticas permitem que as células de mamíferos saudáveis ​​que artificialmente mostrar "me come" sinais ou que perdem aderência à sua matriz extracelular para escapar da morte por fagocitose de células inteiras ou entosis, respectivamente 10,11. No entanto, nós e outros mostraram que, sem manipulação genética de células de mamíferos saudáveis ​​normais e linhas de células também pode recuperar desde as fases iniciais da apoptose 12-15. Usando ferramentas para rastrear células individuais, demonstramos ainda mais a recuperação de estágios finais de apoptose 12,13, depois que as células passaram checkpoints importante que típicoly marcar o "ponto de não retorno" 2-6. Estes pontos de controlo de fase de apoptose tardia incluem libertação mitocondrial de citocromo c, a activação de caspases, fragmentação nuclear, e formação de corpos apoptóticos. Adotamos uma palavra composta grega "anastasis", que significa "subindo para a vida", para descrever essa inversão de apoptose à beira da morte celular 2-6.

A não ser que todo o processo de morrer recuperação é observado por imagens de células vivas, é um desafio para distinguir as células que sofreram anastasis a partir de células que nunca experimentaram eventos apoptóticos. Décadas de trabalho têm revelado que as características morfológicas de suicídio celular por apoptose são movidos por eventos bioquímicos e moleculares conservados evolutivamente 16-19. Estes eventos promover a auto-destruição das células que regulam os processos de desenvolvimento e homeostáticos em organismos unicelulares e pluricelulares, eliminando danificado ou dcélulas angerous 16-19. Enquanto as células em apoptose pode ser facilmente distinguidos por manifestações morfológicas, bioquímicas e moleculares padronizados de apoptose 1,5,6,16,20, atualmente não há nenhum marcador conhecido específico para anastasis 12,13. É importante notar que as células que sofreram anastasis parecem ser as células saudáveis ​​normais, e as células que começam a inversão apoptose apenas aparecem como células moribundas apoptóticos 12,13. Assim, novas ferramentas são necessárias para concluir com segurança que uma determinada célula sobreviver já havia experimentado processos apoptóticos ativos.

A apoptose é geralmente assumido como uma cascata irreversível porque é um processo de destruição rápida e maciça. Embora possa demorar alguns minutos para dias para algumas células para iniciar a apoptose, uma vez que as mitocôndrias têm lançado fatores apoptogénicas como citocromo c para o citosol 21,22, caspases pode ser ativado dentro de 5 minutos 23,24, seguido por citoplasmática econdensação nuclear dentro de 10 min 25-27, e morte celular pouco depois 25-27. Caspases activadas orquestrar a apoptose por clivagem e inactivação de componentes estruturais e funcionais importantes para o propósito de demolição 2,28 celular, tais como o inibidor da endonuclease DFF45 / ICAD 29,30. Caspases também ativar fatores pró-apoptóticos, como BID membro família Bcl-2, que transloca para a mitocôndria para promover a liberação mitocondrial do citocromo c 31,32. Atividade Caspase também resulta em exposição na superfície celular de phosphatidylserine como um "me comer" sinal para a promoção engulfment de morrer células por macrófagos ou células vizinhas através de fagocitose 33. Além disso, os eventos apoptóticos tornar mitocôndrias disfuncionais, interrompendo bioenergética celular e metabolismo 34,35,36. Assim, a recuperação de tal destruição parece intuitivamente improvável.

Contrariamente ao original esperarções, as células podem reverter o processo de morte celular por apoptose, mesmo numa fase tardia. Ao monitorar continuamente o destino de morrer células em cultura, observou-se a reversibilidade da fase de apoptose tardia em um intervalo de células primárias e linhas de células 12,13. A remoção do estímulo morte permitiu a recuperação das características evidentes de apoptose, tais como a fragmentação mitocondrial, a condensação da cromatina, danos no ADN, de vesículas de membrana do plasma, a exposição da superfície celular de fosfatidilserina, a libertação de citocromo c mitocondrial, activação de caspases, fragmentação nuclear, encolhimento da célula, e formação de corpos apoptóticos. Estas observações levantam questões sem respostas sobre as funções, as consequências, e os mecanismos de anastasis. Para responder a estas perguntas, um pré-requisito é para identificar com segurança as células que sofreram anastasis. Aqui, descrevemos os métodos de microscopia ao vivo e um biossensor caspase para detectar células que já inverteu apoptose fase tardia e then sobreviveu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparação de células para imagens de células vivas

  1. Para facilitar a detecção de alterações morfológicas, escolher células aderentes, tais como células HeLa (carcinoma cervical humano), as células que são planas sobre o substrato para melhor visualizar alteração da membrana plasmática e organelos intracelulares.
    Nota: Reversão de apoptose tem sido observada em várias células de mamífero 12,13, incluindo as células do fígado de rato primária, macrófagos primários, cardiomiócitos primários de rato, e também linhas celulares tais como as células de rim embrionário humano HEK-293T, macaco verde africano epiteliais renais COS -7 células musculares cardíacas de rato, HL-1 células, os fibroblastos de rato NIH 3T3, furão (Mustela putoris furo) CRL1656 células do cérebro, células A375 de câncer de pele humana, células de câncer testicular CRL1973 humanos, células pequenas humanos H446 de carcinoma de pulmão de células, o câncer de fígado humano As células HepG2, células MCF-7 de cancro da mama humanos, células PC3 cancerosas humanas da próstata e células de neuroblastoma SH-SY5Y humanos.
  2. Pré-lavagem de lamelas de vidro de vidro placas de cultura de célula inferior com etanol absoluto para limpeza e esterilização.
    Nota 1: O uso de pratos de vidro de fundo é recomendado para alta qualidade de contraste de interferência diferencial (DIC) de microscopia, e alta confocal ampliação ou microscopia de epi-fluorescência (ver discussão).
    Nota 2: Para ampliações elevadas (40X, 60 / 63X ou 100X objetivos e altas aberturas numéricas 1.3 ou 1.4), o uso de placas de cultura de células com fundo de vidro mais fino (espessura 0,085-,16 mm) proporciona longas distâncias para a imagem latente de trabalho (Veja Protocol 3 ).
  3. Dependendo do tipo de célula, placas de cultura de vidro de fundo pode necessitar de revestimento com poli-d-lisina (0,1 mg / ml), colagénio (solução 0,01% em ácido acético 0,01 M) e / ou fibronectina (5 ug / ml) antes da semeadura células.
    Nota: A optimização do tipo e concentração de agente de revestimento é necessário para diferentes linhas de células. Células HeLa podem aderir directamente sobre o vidro, sem revestimento. No entanto, algumas células, Such como rato musculares cardíacas HL-1 células, não podem aderir diretamente para superfícies de vidro, mas exigem protocolos de cultura e de revestimento específicas 37.
  4. Semente de ~ 2-3 x 10 5 células em 35 milímetros de vidro pré-revestidas placas de cultura de células e incubar inferior a 37 graus Celsius (° C) com 5% de CO 2 durante um dia para alcançar 80% de confluência.
    Nota 1: As condições óptimas de densidade das células, tempo de incubação, e as condições de cultura podem variar, dependendo do tipo de célula. Confluência celular pode afetar a resposta apoptótica de células (Veja o Protocolo 2). Em alta confluência, as células podem ser menos sensíveis às mesmas concentrações de estímulos apoptóticos.
    Nota 2: Evitar o excesso de células confluentes, como alta densidade celular pode obscurecer alterações morfológicas de células individuais e suas organelas.

2. Aplicação e remoção de Apoptotic celular Estímulos

  1. Pouco antes da utilização, pré-misturar o agente de indução de apoptose com 37 ° C, meio de cultura celular. Etanol (3,6-4,5% Vol / vol) serviu como indutor de apoptose na presente demonstração.
    Nota 1: Os dados publicados e não publicados demonstram que as células também pode reverter a apoptose, que é desencadeada por outros estímulos apoptóticos 12,13, tal como dimetil sulfóxido (DMSO, 8% v / v, durante 24 horas), estaurosporina (STS, 0,5 uM para 1 hr), e o taxol (1 uM durante 12 horas). Optimização de dosagem para o desencadeamento de apoptose é necessário para diferentes tipos de células para alcançar a dosagem mínima que pode desencadear a maioria das células na população que sofre apoptose.
    Nota 2: Pré-mistura de agentes indutores da apoptose por meio de cultura de células é importante para evitar a exposição desigual das células a estímulos apoptóticos.
  2. Imagem de um grupo de células de saúde no prato de cultura de células antes de se aplicar o agente de indução de apoptose para estabelecer morfologias da linha de base.
  3. Remover o meio original da placa de cultura de células, e, em seguida, aplicam-se 2 ml de agente indutor de apoptose pré-misturado com o prato dedesencadear células para sofrerem apoptose. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 (ou outras condições de cultura normais).
  4. Após a incubação, as células observar pela luz, de epi-fluorescência ou microscopia confocal para monitorizar a progressão de características apoptóticas.
    Nota 1: As células que sofrem apoptose exibirá características morfológicas, bioquímicos e moleculares de apoptose que podem ser detectados por microscopia e biossensores baseados em fluorescência (Veja Protocolos 3 e 4).
    Nota 2: O tempo de incubação das células com diferentes indutores de apoptose variará, dependendo do tipo de célula, condições de células (tais como o estado dos nutrientes e de confluência), e a dose de estímulo aplicado morte. Titulação cuidadosa pode não ser necessária.
  5. Quando as células exibir marcas de apoptose, remover agente de indução de apoptose por lavagem das células uma vez com água morna (37 ° C, ou outra temperatura de cultura normal) meio de cultura de células fresco.
    Nota 1: As células em apoptose são mais frouxamente ligados ema placa de cultura, é importante aplicar e remover suavemente meio de modo que as células não serão lavados.
    Nota 2: As células suspensas ao vivo pode ser recuperado a partir do sobrenadante por centrifugação suave (160 xg durante 1 min) e foi adicionado de volta para o prato de cultura.
  6. Incubar as células a 37 ° C com 2 ml / prato de 35 milímetros de meio de cultura celular fresco em 5% de CO 2. Como alternativa, o uso de meio condicionado (sem células meio de cultura recolhidos a partir de células saudáveis) para aumentar ainda mais a sobrevivência das células em apoptose.
    Nota: Lavagem e incubando as células com meio fresco permitir que a maioria das células para inverter a apoptose induzida por etanol após exposição ao etanol, 12,13. No entanto, repetindo este passo de lavagem pode ser necessária quando as células são expostas a outros estímulos apoptóticos (ver discussão).

3. Viver Microscopia celular

  1. Recomendamos o uso de um confocal ou epi-fluorescência microscópio invertido com controle ambiental (37 ° C,5% de CO 2) para a microscopia de células vivas.
    Nota: Também é possível para a imagem das células utilizando microscópios verticais com um objetivo de imersão de água. Mergulhar o objectivo directamente para o meio de cultura para células de imagem. No entanto, as células podem ser esmagados pela objectiva de imersão durante a focagem.
  2. Pré-aquecer o microscópio (como câmara ambiental controle, palco incubadora, e aquecedor objetiva), pelo menos 2 horas antes de imagem.
    Nota: Isto permite que componentes de microscópio para alcançar termo-equilíbrio, de modo que pode evitar o desvio de focagem e de mudança de plano xy, devido à expansão e contracção térmica dos componentes.
  3. Coloque um 35 milímetros prato de vidro de fundo das células em cultura (Veja Protocolo 1) no palco de um microscópio invertido e capturar imagens de células usando um plano de Apochromat objetiva de 40X ou 63X com uma abertura numérica (NA) 1.3 ou 1.4 para a imagem latente de células do fundo do prato através de lamelas de vidro.
    Nota: Evite aplicar mais de 2 ml de meioprato inferior a 35 mm de vidro, como o peso do meio poderia causar curvatura do fundo de vidro, o que torna difícil a imagem um campo de células no mesmo plano focal.
  4. Manter as células a 37 ° C ou a temperatura normal correspondente durante todo o processo de imagiologia.
    Nota: O processo de apoptose, e provavelmente à reversão de apoptose, depende de actividades enzimáticas sensíveis à temperatura. Por conseguinte, a manutenção de células a 37 ° C (por exemplo com um microscópio de fase superior incubadora) é importante em todo o experimento. Diminuição da temperatura poderia abrandar a resposta apoptótica e a resposta de recuperação após a remoção do estímulo por apoptose.
  5. Use um dispositivo de umidade ou colocar uma película transparente (ver Materiais) na placa de cultura para reduzir a perda de água por evaporação a partir do meio.
    Nota: a folha poderia interromper a polaridade da luz para microscopia DIC. Restaurar polaridade ajustando o polarizador no caminho da luz.
  6. Manter o pH nameio de cultura de células (pH 6,8 -7,3) por incubação em 5% de CO 2 com uma câmara de controlo do ambiente no microscópio.
    Nota: A manutenção do pH no meio de cultura pode também ser alcançada através da adição de tampão HEPES, ou por meio de CO 2 usando -independente comercial (ver Materiais). As condições óptimas podem variar, dependendo do tipo de célula.
  7. Minimizar fluorescência / laser (excitação intensidade da luz) a exposição a células durante o processo de imagem para evitar fototoxicidade, reduzindo a intensidade de fluorescência para o mais baixo necessário para obter imagens de alta qualidade de células / estruturas subcelulares ou biossensores expressas (detalhes no protocolo nº 4).

4. Estratégias para a detecção e seguimento Anastasis durante e após apoptóticos Eventos

  1. Blebbing Plasma membrana, condensação citoplasmática, o encolhimento celular e formação de corpos apoptóticos (Veja Figuras 1A - C, E).
    1. Execute time-lapse dife de células vivasrential contraste de interferência (DIC) ou microscopia de contraste de fase para acompanhar um grupo de células de saúde e observar sua morfologia celular (Veja Protocol 3 para microscopia de células vivas, e veja a discussão).
      Nota 1: Reduzir a intensidade da fonte de luz para a imagem latente contrato DIC / fase para evitar a fototoxicidade para as células.
      Nota 2: Se DIC e microscopia de contraste de fase não estão disponíveis, use CellTracker manchar o citosol para delinear a morfologia de células vivas para microscopia confocal ou epi-fluorescência e monitorar a morfologia celular.
    2. Aplicar estímulo para desencadear a morte celular de células que sofrem apoptose (Ver Protocolo 2 para a aplicação e remoção de estímulos apoptóticos).
    3. Observar as células tratadas por características morfológicas de apoptose, tais como formação de bolhas de membrana plasmática, condensação citoplasmática, encolhimento celular e formação de corpos apoptóticos (Figuras 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Lave estímulos morte, e as células re-abastecimento por meio fresco quando as células displacaracterísticas morfológicas y da apoptose.
      Nota 1: Aplicar estímulo da morte celular ou de mudar o meio de cultura celular na fase de microscópio durante lapso de tempo de imagem de células vivas pode ser conseguido através da utilização de uma câmara de cultura de células de perfusão, ou pode ser realizada directamente sobre o prato de cultura de células por pipetagem cuidadosa sem tocar o prato, durante os intervalos entre as imagens.
      Nota 2: sistemas de compensação de desvio de focagem para evitar uso fora de foco das células, devido à perda de termo-equilíbrio do sistema de microscópio após a mudança do meio de cultura de células (ver discussão).
    5. Contínua imagiologia lapso de tempo para rastrear o destino das células que exibem marcas de apoptose. As células que revertem a apoptose pode reparar danos e recuperar o normal morfologia plana (Figuras 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Fragmentação mitocondrial, o DNA / condensação da cromatina, ea fragmentação nuclear (Ver Figuras 1D, 1F, 1G).
    1. Para visualizar mitochondria, células mancha com 50 nM MitoTracker corante fluorescente verde-vermelho / vermelho escuro /, e simultaneamente manchar o núcleo com 10 ug / ml de Hoechst 33342 corante nuclear azul em meio de cultura durante 20 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
      Nota 1: Reduzir a concentração de corantes e duração da incubação para evitar a toxicidade e reduzir a fluorescência de fundo, quando necessário. Optimizar as condições de coloração para obter uma boa relação sinal-ruído com a quantidade mínima de corante e tempo de incubação para a coloração.
      Nota 2: Use as manchas fluorescentes para as mitocôndrias como MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM, ou MitoTracker Verde FM, que não vaza para fora da mitocôndria durante a apoptose. Isto permite a visualização da morfologia mitocondrial durante a apoptose e anastasis. Veja os materiais e equipamentos para a tabela detalhes sobre essas manchas.
    2. Mantenha as células coradas no escuro para evitar a fotodegradação.
    3. Remover o excesso de corante por lavagem das células3 vezes com 37 ° C, solução salina tampão fosfato (PBS) ou solução de meio de cultura celular fresco, com 1 min de incubação em meio fresco entre cada lavagem, e, em seguida, ainda mais em incubar o meio fresco durante 20 min antes da lavagem final para permitir excessiva manchas a sair das células para reduzir o sinal de fundo não específico para imagiologia.
      Nota: Reduza os tempos de incubação com meio celular após coloração pode resultar em alta fundo para imagens.
    4. Realize em tempo real confocal de células vivas ou microscopia de epi-fluorescência para as células saudáveis ​​da imagem antes da indução de apoptose é aplicada (Veja Protocol 3 para microscopia de células vivas).
      Nota: As células saudáveis ​​exibir mitocôndrias tubulares e núcleos redondos, na maioria dos tipos de células (Figuras 1D, 1F, 1G).
    5. Desencadear células a sofrer apoptose (ver Protocolo 2 para a aplicação e remoção de estímulos apoptóticos para as células).
    6. Continue time-lapse microscopia de células vivas para observar alterações na morpholog mitocondrial e nuclearies imediatamente após o estímulo é aplicado a morte das células. Observar as células para exibir marcas de apoptose, tais como a fragmentação mitocondrial e inchaço, condensação de cromatina e fragmentação nuclear, em contraste com as células saudáveis ​​que exibem mitocôndrias e núcleos tubulares redondos.
    7. Quando as células exibir marcas de apoptose, lavar e fornecer células com meio fresco, e continuar a imagiologia de lapso de tempo para rastrear o destino das células. As células que revertem apoptose recuperar mitocondrial normal e morfologia nuclear (Figuras 1D, 1F, 1G).
      Nota: Executar microscopia DIC em paralelo quando possível obter informação adicional para o acesso as fases de apoptose por meio da observação das alterações da morfologia celular no mesmo grupo de células (Ver 4.1 Protocolo para a microscopia DIC).
  3. Detecção de liberação mitocondrial do citocromo c, utilizando células que expressam estavelmente um -GFP fusão citocromo c protein (Ver Figura 2).
    1. Mancha células expressando estavelmente citocromo c -GFP 23,24 com MitoTracker Red rotular mitocôndrias de células polarizadas (Veja Passos 4.2.1 a 4.2.3 para mitocôndrias coloração de células vivas).
    2. Execute microscopia confocal de células vivas ou epi-fluorescência em tempo real para rastrear células saudáveis ​​(Detalhes no Protocolo n.º 3 para imagens de células vivas).
      Nota: O sinal -GFP citocromo c localiza principalmente nas mitocôndrias das células saudáveis ​​(Figuras 2A i, 2B).
    3. Desencadear células a sofrer apoptose (ver Protocolo 2 para a aplicação e remoção de estímulos apoptóticos para as células). Continuar microscopia de lapso de tempo para observar a translocação de citocromo c -GFP de mitocôndrias para o citosol (Figuras 2Aii-iii, 2B).
      Nota: libertação mitocondrial de citocromo c para o citosol é um marcador mitocondrial de permeabilização da membrana exterior (MOMP)4, um passo crítico no dependente da mitocôndria apoptose 21,22
    4. Quando as células exibir o sinal -GFP citocromo c no citoplasma, remover o estímulo da morte celular, e fornecimento de células com meio fresco (Ver Protocolo 2). Continue imagem time-lapse para acompanhar o destino de células com GFP cytosolic.
      Nota: As células que revertem apoptose recuperar a morfologia celular normal, e reduzir o seu sinal -GFP citocromo c cytosolic presumivelmente através de degradação ou translocação de volta para a mitocôndria (Figuras 2Aiv-vii, 2B).
    5. Capturar imagens DIC em paralelo para obter informações adicionais para acessar os estágios de apoptose pela observação de alterações na morfologia celular em células individuais ou grupo de células (Ver Protocolo 4.1 para microscopia DIC).
  4. Detecção da actividade de caspase utilizando um biossensor caspase (Ver Figura 3)
    1. Células transfecção com a caspase biossensores NES-DEVD-YFP-NLS para16 a 24 horas antes de submetê-los a um estímulo de apoptose 13.
    2. Manchar as culturas transfectadas com Hoechst 33342 para rotular núcleos celulares (Veja Passos 4.2.1 a 4.2.3 para a coloração de células vivas nuclear).
    3. Execute microscopia confocal de células vivas ou epi-fluorescência em tempo real para rastrear células saudáveis ​​(Detalhes no Protocolo n.º 3 para imagens de células vivas).
      Nota: O sinal de biossensor NES-DEVD-YFP-NLS localiza principalmente no citosol de células saudáveis, devido ao seu sinal de exportação nuclear (NES) (Figuras 3A, 3C e 3Bi, ver Discussão).
    4. Desencadear células a sofrer apoptose (ver Protocolo 2 para a aplicação e remoção de estímulos apoptóticos para as células). Continue microscopia de lapso de tempo para observar a translocação nuclear de YFP.
      Nota: A activação de caspases cliva o motivo DEVD na caspase biossensores NES-DEVD-YFP-NLS, resultando em YFP-NLS translocação desde o citosol para o núcleo (Figuras 3A, 3Bii-iv, ver Discussão).
    5. Nota: As células que invertem a apoptose recuperar a morfologia celular normal, mas reter o sinal YFP nuclear (Figuras 3 BV-x, células 1 e 2, e 3D).
    6. Continue imagem time-lapse para rastrear o destino das células que exibem YFP nuclear.
      Nota: O sinal YFP nuclear se tornará degradadas várias horas depois que as células se inverteram apoptose (Figuras 3B, vi-x, Cell 1, Veja Resultados e Discussão) presumivelmente através dos mecanismos normais de apuramento de células, como a degradação do proteassoma.
    7. Capturar imagens DIC em paralelo para obter informação adicional para o acesso as fases de apoptose por observação de alterações na morfologia celular em células individuais ou um grupo de células. (Veja Protocol 4.1 para microscopia DIC).
  5. Exposição de superfície celular de fosfatidilserina (Ver Figura 4)
    1. Semear as células em glass lamelas para atingir 80% de confluência celular (Ver Protocolo 1).
    2. Co-manchar as células com MitoTracker vermelho fluorescente e azul Hoechst 33342 mancha para mitocôndrias e núcleos, respectivamente (ver Passos 4.2.1 a 4.2.3 para mitocondrial de células vivas e coloração nuclear).
    3. Acionar células a apoptose por meio de um indutor de apoptose (Veja Protocolo 2).
    4. Aplicar fluorescente marcado com anexina V (ver Materiais) para corar as células apoptóticas 10 min a 37 ° C antes da remoção do indutor de apoptose para detectar a exposição de fosfatidilserina sobre a superfície de células apoptóticas.
      Nota 1: saudável células não são coradas com anexina V a fosfatidilserina porque normalmente é sequestrado no-folheto interno da membrana plasmática da célula 38. As células apoptóticas são coradas com anexina V, que se liga a fosfatidilserina na superfície celular (Figuras 4A e 4B).
      Nota 2: fluorescente marcado com anexina V, também pode ser aplicado para corar as células apoptóticas immediately após a remoção do indutor de apoptose, com 10 minutos de incubação.
    5. Remover estímulo da morte celular, lavar as células marcadas com PBS quente ou meio fresco uma vez, e, em seguida, fornecer células com meio fresco durante 2 horas a 37 ° C com 5% de CO 2 (Ver Protocolo 2).
      Nota 1: As células que reverteram a apoptose recuperar a morfologia normal e reter sinal V anexina marcado por fluorescência depois de recuperar a morfologia normal (Figuras 4A e 4B).
      Nota 2: O sinal de anexina V diminui com o tempo em células recuperadas (ver discussão).
    6. Fix células em pontos de tempo seleccionados com paraformaldeído a 4% contendo 8% de sacarose em 1x PBS durante 20 min no escuro à temperatura ambiente, e lava-se as células fixadas, com PBS por 3 vezes para remover células paraformaldeído antes da montagem sobre lâminas de vidro com lamelas de montagem antifade (Veja Materiais) para microscopia confocal ou epi-fluorescência e observar anexina V em células após a remoção da apoptose indutor.
      Nota 1: A sacarose em fixador preserva estrutura da membrana celular durante a fixação.
      Nota 2: Guardar a solução de paraformaldeído em escuro a 4 ° C para evitar a degradação.
      Nota 3: Aquece-se a solução de paraformaldeído a temperatura ambiente antes de ser aplicada a células de fixação para evitar um choque frio para as células.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para estudar a reversão da apoptose, células de cultura de tecido são primeiro expostos a um estímulo de morte para desencadear a apoptose. Quando as células apresentam marcas de apoptose, o meio de cultura fresco é então aplicada para lavar o estímulo e em seguida incubar as células moribundas para permitir a recuperação (Figura 1A). Aqui, a questão-chave a ser abordado é o quão longe morrendo células cultivadas individuais podem progredir para apoptose e ainda sofrer anastasis. Esta questão pode ser definitivamente respondida por monitoramento contínuo com biomarcadores para rastrear destinos celulares utilizando os métodos descritos abaixo.

Descrevemos primeiro nossas estratégias para detectar reversão da apoptose em células de cultura de tecido por meio de microscopia de células vivas de lapso de tempo, que é necessário para o controle e a gravação da resposta de células individuais, antes, durante e após a exposição a um estímulo 12,13 apoptótica. Células aderentes se espalham sobre a sua saudáveis ​​substrato anexado (Figura 1bi) 12,13, e exibido mitocôndrias filamentosos e núcleos redondos antes do tratamento (Figuras 1CI, Di, Ei, Fi, Gi) 12,13. Depois da exposição ao etanol 3,8-4,5% em meio de cultura de células (vol / vol), DIC ou microscopia de contraste de fase revelou que as células exibiram características morfológicas de apoptose, incluindo a condensação do citoplasma, membrana de plasma de vesículas, e encolhimento da célula (Figuras 1Bii, 1Cii- iii, e 1Eii-vi) 12,13. A formação de corpos apoptóticos pelas mesmas células foi facilmente observada por DIC (Figuras 1Eii-vi). A fragmentação das mitocôndrias MitoTracker-marcados (Figuras 1Dii-iii, 1Fii-vi) 12,13, bem como a condensação de ADN nuclear Hoechst-coradas (Figuras 1Dii-iii, Fii-iii, Gii) 12,13, e fragmentação dos núcleos (FigoUres 1Evi e fvi, setas brancas), foram detectados simultaneamente por microscopia confocal ou epi-fluorescência. As células que reverteram a apoptose foram posteriormente observado para recuperar a morfologia normal, aparentemente reparar seus danos (Figuras 1Biii, C e Div-vi, E e fVII-xii, e GIII) 12,13. Células sob estas condições também tinha sido mostrado para recuperar a mobilidade organela, migração celular, e endocitose funcional a partir do consumo de divisão de emissão de fluorescência Quantum Dots e células 13. Curiosamente, algumas células que apoptose reverenciado indicadas morfologia irregular nuclear (Figura 1Fxii), e também a divisão celular anormal e a formação de micronúcleos (Figuras 1Giv-vii) 13, que é um biomarcador de danos no DNA, a ruptura dos cromossomas e perda cromossoma inteiro em células em divisão 39, 40. C Deslocadoshromosomes ou fragmentos de cromossoma exterior não ser incluído no núcleo de células filha são delimitados por membrana nuclear 39, 40. Assim, uma consequência da anastasis poderia ser o alojamento de genomas que foram danificadas durante a apoptose abortada, levando à tumorigênese e progressão do câncer. A presença de micronúcleos também é comum em células cancerosas 40,41.

Lançamento da citocromo c é um passo crítico para mediar ou amplificar dependente de caspase apoptose 20-22. Usando células HeLa que expressam de forma estável com etiquetas-GFP citocromo c, acompanhámos a deslocalização subcelular de citocromo c durante a apoptose e anastasis por microscopia confocal. Conforme relatado 23,24, citocromo c -GFP localizada a mitocôndria antes do tratamento (Figuras 2ai e B), mas, em seguida, foi libertado para o citosol, após um estímulo morte tinha sido aplicada (Figuras 2Aii,2Aiii e B). Outras características morfológicas específicas tais como a fragmentação mitocondrial e blebbing membrana plasmática, também foram observadas em células que haviam lançado citocromo c -GFP (Figura 2Aiii). Estas células foram relatados a sofrer morte celular, logo após a libertação do citocromo c 23-27. No entanto, após a remoção do estímulo da morte, observou-se que os níveis de citocromo c citossólico -GFP diminuiu, mitocôndrias recuperou estruturas filamentosas, e a membrana de plasma recuperado um aspecto normal (Figuras 2Aiv-vii, e B). Portanto, as células em apoptose podem sofrer anastasis após a liberação mitocondrial do citocromo c.

A amplificação de caspases-clivagem DEVD a jusante, é geralmente considerado como o "ponto de não retorno" na apoptose 2,5. Por isso, foi utilizado um biossensor NES caspase-DEVD-YFP-NLS exprEssed a partir de um plasmídeo de 13, tornando-se possível detectar células sobreviventes que já experimentaram a actividade da caspase (Figura 3A). Este biossensor caspase é um polipéptido com um sinal de exclusão nuclear N-terminal (NES), um ligante com a caspase-3/7 sítio de clivagem de consenso (DEVD) 26,42,43, seguido por uma proteína fluorescente amarela (YFP) e um sinal de localização nuclear do C-terminal (NLS). Em células normais, esta biossensor predominantemente localiza no citosol como uma função do NES (Figuras 3Bi, Ci-iv, e D) 13. Durante a apoptose, as caspases activadas clivar o motivo de DEVD, libertando YFP-NLS, que efectua a translocação eficiente a partir do citosol para o núcleo em células que, simultaneamente, ou subsequentemente, mostrar outras características da apoptose, como de ADN / condensação da cromatina e encolhimento da célula (Figuras 3B ii -iv, e D) 13. Assim, océlulas de se reter a função nuclear de importação após a ativação da caspase. Após a remoção do indutor de apoptose, células que sofrem de exibição anastasis recuperação morfológica mesmo após a activação da caspase tenha ocorrido (figuras 3 BV-x, e D) 13, aparentemente revertendo fase apoptose tardia. Durante a recuperação da morfologia normal, o sinal YFP nuclear diminui de intensidade em algumas células quando elas começam a reverter a apoptose após a remoção do estímulo de morte (Figuras 3 BV-x, Cell 1) 13, o que sugere que as células degradar o biosensor clivada pela caspase, possivelmente o mesmo mecanismo usado para remover outros produtos clivada pela caspase durante e após anastasis.

Anastasis também pode ser detectada sem microscopia de células vivas. Isto pode ser conseguido através da utilização marcado por fluorescência anexina V 38,44, que se liga a fosfatidilserina e marcas exteriorizada (PS) com um passo inicial na apoptose ( (Figura 4B) 13, como fosfatidilserina é restrito para o folheto interno da membrana plasmática das células saudáveis ​​38. Em contraste, as células que morrem apoptóticas induzidas por etanol expor fosfatidilserina sobre a superfície celular (Figura 4B) 13, e, por conseguinte, podem ser marcados com a anexina V fluorescente 38,44. Notavelmente, células de anexina-V marcado pode recuperar a morfologia normal após a remoção dos estímulos de morte, o que sugere que os cardiomiócitos primários reverteram apoptose (Figura 4B) 13. Outros têm previamente aplicada uma estratégia semelhante para sugerir que a recuperação a partir da apoptose pode ocorrer in vivo. Em um modelo in vivo de lesão isquêmica transitória, anexina V rotulagem dependente de caspase de cardiomiócitos em coelhos e camundongos aparentemente reconsultadas na internalização de anexina V por células sobreviventes após isquemia transitória 45, sugerindo que anastasis poderia ocorrer em animais vivos. Além disso, dois outros estudos utilizaram a selecção de células para identificar uma fracção de anexina V-rato marcado BCL 1 .3B3 células de linfoma B (expostas a anticorpos anti-imunoglobulina, que induzem a apoptose em BCL .3B3 1) e células de carcinoma mamário de rato que expressam MOD temperatura p53 sensíveis ao (que provoca a apoptose depois incubadas abaixo da temperatura permissiva) continuaram a proliferar após eles foram devolvidos para as condições de cultura normais 14,15. Em conjunto, esses estudos sugerem que a anexina V é útil para determinar o destino das células que inverteu a apoptose sem microscopia de imagem de células vivas. No entanto, é preciso tomar cuidado com esta estratégia, tal como anexina V fluorescência não é permanente (Figura 4B) 13, se detectáveis ​​por apenas algumas horas após a remoção do estímulo da morte, de modo queestes métodos não podem fornecer acompanhamento a longo prazo das células que reverteram apoptose.

Figura 1
Figura 1: Acompanhando a reversão da apoptose por imagens de células vivas. (Reproduzido com permissão de Tang et al, MBOC 23, 13 2240-2252, para figuras 1A -. D e G). (A) Abordagem para induzir a apoptose e, posteriormente, permitir que as células cultivadas para se recuperar após lavagem para retirar o indutor de apoptose. (B) Time-lapse microscopia de contraste de fase de células vivas de células de fígado de rato primários saudáveis ​​(não tratada), o mesmo grupo de células que foram tratados com etanol 4,5% em meio de cultura (vol / vol), durante 5 horas (tratadas), e, em seguida, lavadas e adicionalmente incubadas com meio de cultura fresco durante 24 h (lavada). Barra de escala, com 100 m. (C) Continuous time-lapse de células vivas microscopia epi-fluorescência da mesma célula do rato de fígado primário antes ethatratamento nol (i), nos tempos indicados após tratamento com etanol a 4,5% em meio de cultura de células durante 2,5 horas (ii e iii), e depois da lavagem e incubação com meio fresco para permitir a recuperação, durante 1 h (IV - VI). Imagens fundidas de mitocôndrias MitoTracker coradas (vermelho) e do núcleo Hoechst-coradas (azul) foram visualizadas por microscopia de epi-fluorescência, e morfologia das células por microscopia DIC. Barra de escala, 10 mm. (D) apenas (sem DIC) imagens de fluorescência mescladas a partir do painel C revelar morfologias organela. (E) Continuous time-lapse de células vivas microscopia confocal das células de carcinoma de pulmão de células H446 pequenos humanos antes do tratamento etanol (i) , após o tratamento com etanol a 3,8% em meio de cultura de células durante 2 h 28 min (ii-vi), e depois da lavagem e incubação com meio fresco para permitir a recuperação (vii-xii). Imagens fundidas de mitocôndrias MitoTracker coradas (vermelho) e os núcleos Hoechst-coradas (azul) foram visualizadas por microscopia confocal, e c ell morfologia por microscopia DIC. As setas brancas indicam um núcleo fragmentada em corpos apoptóticos (vi). Barra de escala, 10 mm. (F) Mesclado imagens de fluorescência só (sem DIC) a partir do painel E revelam morfologias organela. (G) Continuous células vivas microscopia epi-fluorescência de lapso de tempo para a imagem latente nuclear monocromático Hoechst-manchado de uma única célula HeLa que sofre a divisão celular imprecisa. Antes do tratamento de etanol (i), o tratamento com etanol a 4,3% em meio de cultura de células, durante 5 h (ii) e após a remoção do etanol (lavada, iii-vi). Painéis iv revela divisões celulares anormais. As setas vermelhas indicam os principais núcleos nas células divididas iv- (vi). Barra de escala, 30 mm. Os tempos são indicados como hr: Min. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

gura 2 "src =" / files / ftp_upload / 51964 / 51964fig2highres.jpg "/>
Figura 2: Detecção de inversão de apoptose após a libertação mitocondrial de citocromo c (A) contínua com lapso de tempo célula microscopia confocal vivo de células HeLa que expressam estavelmente o citocromo c -GFP (Cyto -GFP C) antes (i), durante (ii-iii) e depois (iii-vii) a exposição ao etanol 3,9% em meio de cultura celular. Imagens confocal mesclada de CytoC-GFP (verde), mitocôndrias MitoTracker coradas (vermelho), e núcleos Hoechst-coradas (azul) são combinados com imagens DIC (painel esquerdo). Versões não mescladas são apresentados separadamente para CytoC-GFP, apresentado como um mapa de calor da intensidade do sinal (painel médio esquerdo), imagem monocromática de CytoC-GFP (painel do meio), e imagem monocromática de mitocôndrias (painel do meio à direita). Imagens mesclada de CytoC-GFP e mitocôndrias (painel direito). (B) A mudança do citocromo c cytosolic-GFP intensidade do sinal das células, Cell 1 e 2 celular, tal como indicado na imagem monocromática CytoC-GFP no Painel Ai. Os tempos são indicados como hr: Min. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Detecção de reversão de apoptose após a ativação da caspase (Reproduzido com permissão de Tang et al, MBOC 23, 13 2240-2252, para 3A - D.). (A) Diagrama da proteína de fusão caspase biossensor composto de um sinal de exportação nuclear (NES), o sítio de clivagem da caspase DEVD, proteína fluorescente amarela (YFP), e o sinal de localização nuclear (NLS). (B) contínua de lapso de tempo em directo célula de microscopia confocal de células HeLa que expressam os biossensores NES-DEVD-YFP-NLS caspase antes (i), durante (ii -iv) e após (vx) exposição a etanol 4,3% em meio de cultura celular. Imagens confocal mesclada da biosensor caspase (verde), núcleos Hoechst-coradas (azul) e imagens DIC (painel esquerdo), a imagens monocromáticas de sinal YFP (painel do meio), e um mapa de calor, indicando a intensidade do sinal YFP (painel da direita) . (C) Os controlos não tratados analisados ​​como no painel B. (D) quantificada intensidades de fluorescência para o biossensor caspase nuclear activado em células individuais (numeradas de 1 e 2 no painel Bi) antes, durante e após a exposição de etanol, e em controlos não tratados (numerada 3 e 4 no painel Ci) foram calculados como a percentagem de YFP presente no núcleo (núcleo / total de intensidade de sinal YFP célula x 100%). Os tempos são indicados como hr: min. Barra de escala, 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ays "> Figura 4
Figura 4: Detecção de reversão da apoptose por fluorescente marcado com anexina V (Reproduzido com permissão de Tang et al, MBOC 23, 13 2240-2252, para Figuras 4A - B.). (A) Diagrama do ensaio anastasis V-FITC de anexina utilizado no painel B. (B) de rato neonatal miócitos ventriculares cardíacas primárias foram expostas ao etanol 4,5% em meio de cultura de células durante 5 horas, e, em seguida, incubadas com anexina V-FITC durante 10 min antes da remoção do meio de etanol. As células foram ou corrigido imediatamente (tratado), ou fixo após a realimentação com meio fresco para uma recuperação adicional de 2 horas (lavou). As células não tratadas que foram expostas a anexina V-FITC servir como controlo (não tratada). Mitocôndrias MitoTracker coradas (vermelhos), os núcleos Hoechst-coradas (azul) e anexina V-FITC (verde) foram visualizadas por microscopia confocal, e morfologia celular foi visualizado por microscopia DIC. Scbar ale, de 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastasis se refere ao fenômeno em que as células que tenham activado via de morte celular reverter posteriormente o processo de morrer e sobreviver. Aqui, nós demonstramos que imagens de células vivas podem ser usados ​​para confirmar que as mesmas células individuais de fato pode reverter processo de morte celular por apoptose numa fase tardia, e, em seguida, continuar a sobreviver e reproduzir. Os nossos protocolos descrever várias condições de tratamento específicas do tipo de células optimizado para induzir apoptose e permitem que uma grande proporção das células de se submeter a reversão da apoptose monitorizada com diversos biomarcadores para a verificação. Em relação às questões técnicas, pratos de fundo de vidro foram usados ​​para cultura de células para a imagiologia 12,13, devido ao vidro fino altamente transparente entre as células e a objectiva do microscópio, o que permite longas distâncias de trabalho de alta qualidade confocal ou microscopia de epi-fluorescência em grande ampliação, facilita a observação de apoptose clássico incluindo fragmentação mitocondrial, A libertação do citocromo c, e a condensação nuclear e a fragmentação. O vidro também não distorce a polaridade da luz, para permitir microscopia DIC alta qualidade para a monitorização da formação de bolhas de membrana, retracção celular de células, e a formação de corpos apoptóticos durante a apoptose. Microscopia DIC tem vantagens sobre microscopia de contraste de fase para observar estas características morfológicas de apoptose, como DIC aumenta o contraste de amostras de células não coradas e transparentes, melhorando a detecção de morfologias celulares. Se DIC e microscopia de contraste de fase não estão disponíveis, CellTracker podem ser utilizados para corar o citosol para descrever a morfologia de células vivas por microscopia confocal ou epi-fluorescência e controlar a morfologia celular.

A aplicação de doses adequadas de estímulos de morte e as estratégias de retirada dos estímulos são etapas fundamentais para a detecção de anastasis. Optamos por utilizar baixas concentrações de etanol como um estímulo de morte para o descr experimentosibed aqui porque uma grande percentagem de células tratadas podem uniformemente em apoptose e pode recuperar a partir deste, potencialmente mais suave, estímulo morte. No entanto, estas abordagens também pode ser aplicado com sucesso com outros estímulos de morte, como já relatado 12,13. No entanto, alguns estímulos de morte são inerentemente mais difíceis do que outros, tais como estaurosporina (STS), um agente indutor de apoptose comumente usado. Talvez porque se liga seus substratos com alta afinidade 46-48, lavagens repetidas são essenciais, mas ainda não pode remover eficientemente STS das células. Neste caso, utilizando-se concentrações mais baixas de drogas e menor tempo de incubação da droga que ainda pode ativar processo de morte por apoptose poderia ser útil para permitir que mais células para reverter a apoptose. Re-alimentação as células com meio de cultura de células condicionado pode também aumentar a inversão da apoptose melhor do que o meio de cultura de células fresco. As células apoptóticas são geralmente fracamente ligado à superfície do prato de cultura particularmente em vidro surcaras, pelo que é importante para lavar os indutores de apoptose com cuidado para evitar destacando as células. Revestimento de pratos de vidro com poli-D-lisina, colagénio e / ou a fibronectina pode aumentar a adesão de células para permitir determinados tipos de células, tais como cardiomiócitos 37, para fixar correctamente na superfície de vidro de placas de cultura de células, particularmente após a exposição das células a um estímulo morte.

O processo de apoptose, e provavelmente à reversão de apoptose, depende de actividades enzimáticas que podem ser influenciadas pela temperatura. Por conseguinte, a manutenção de células a 37 ° C ou à sua condição de cultura normal é importante em todo o processo de imagem ao vivo para assegurar a reprodutibilidade dos resultados experimentais. Pré-quente do microscópio antes de iniciar a imagem de células vivas é também um passo crítico que permite que os componentes de microscópio para alcançar termo-equilíbrio. Isso pode evitar a deriva de foco e mudança de plano xy devido à expansão térmica e contração docomponentes durante imagens de células vivas. Aplicando ou remoção do estímulo morte mudando a forma de uma placa de cultura com uma pipeta, quer ou por perfusão no sistema de microscopia pré-aquecido durante o exame de lapso de tempo pode ainda causar deriva de foco devido a alterações de temperatura ou de volume do meio. Aquisição Z-stack pode ajudar a células de imagem no plano focal correto, mas vai aumentar o risco de fototoxicidade devido à exposição adicional de células de lasers fluorescentes. Como alternativa, a utilização de sistemas de compensação foco deriva, como um sistema de correção de foco automático à base de laser infravermelho, pode manter as células no mesmo plano focal durante time-lapse imagens de células vivas, mantendo a distância entre a células / vidro e o objetivo sem adicional a exposição das células ao comprimento de onda curto, a fluorescência fototóxica.

Libertação mitocondrial de proteínas apoptogénicas tais como citocromo c, e activação de caspases efectoras, tais como a jusante / efeitoou caspase-3 e caspase-7, têm sido geralmente considerado como sendo o "ponto de não retorno" no 2,5,6 processo de morte celular por apoptose. As transferências de Western foram usadas para detectar a clivagem (activação) da caspase-3 e os seus substratos, tais como poli (ADP) polimerase -ribose-1 (PARP) e DFF45 / as DC na população de células inteiras durante a indução de apoptose e, após remoção da apoptose estímulos, e revelaram que a caspase-3 clivada, as DC, e PARP em células mostrou-se durante a exposição a estímulos de morte, mas desapareceu após as células foram re-alimentação com meio de cultura fresco 13. No entanto, estes métodos de revelar o estado geral na população de células, mas não distinguem as células individuais que, em última análise morrem por aqueles que irá inverter a apoptose e, em seguida, sobreviver. Fracionamento bioquímico para analisar liberação de citocromo c tem ressalvas semelhantes. Portanto, para rastrear o destino das células individuais após libertação de citocromo c e caspase-acvação, duas das características mais reconhecidas de apoptose 2,5,6, marcadas com GFP citocromo c (Cyto -GFP C) e um biossensor da caspase, tais como o utilizado aqui NES-DEVD-YFP-NLS, combinado com células vivas microscopia de contornar estes problemas através da observação directa e recuperação morfológica a translocação do biossensor Cyto C -GFP nas mesmas células. Estes resultados indicam a reversibilidade da apoptose após citocromo c mitocondrial liberação e ativação caspase.

O desafio actual para estudar anastasis é a falta de técnicas de marcação para detectar as células que sofreram anastasis em qualquer ponto ao longo da sua vida útil, in vivo ou in vitro. A expressão estável da caspase biossensores NES-DEVD-YFP-NLS também permite a detecção da actividade da caspase se caspases são activados de novo no futuro, mas não regista permanentemente a actividade da caspase como o biossensor activada será degradada sem Sustaatividade caspase ined 13. Outros biossensores caspase previamente relatados, tais como os biossensores baseados em FRET SCAT (por exemplo ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49, bem como repórteres fluorescentes Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 e CPV (por exemplo, células CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52, pode ser utilizado para detectar a actividade da caspase em animais inteiros e em células em cultura, mas têm limitações semelhantes. Da mesma forma, Cyto C -GFP não pode ser utilizado para rastrear as células que reverteram a apoptose, a longo prazo, uma vez que é libertado a partir da mitocôndria para o citosol durante a apoptose e é subsequentemente degradada. Rotulagem anexina V tem sido utilizado para rastrear as células que reverteram apoptose, mas a intensidade do sinal também diminui com o tempo, de modo que não é útil para o seguimento a longo prazo de anastasis 13,45. Contínua a longo prazo in vivo de imagens pode ser usado para rastrear o destino das mesmas células após exposição de estímulos de morte. No entanto, a longo prazo in vivo de imagens ainda é um desafio to desempenho na maioria dos animais vivos. Por isso são necessárias novas abordagens para estender a pesquisa anastasis para estudos com animais inteiros, e para a triagem de drogas que possam promover ou inibir anastasis utilizando células de cultura de tecidos

No futuro, os protocolos mais recentes e técnicas que controlam o destino celular de longo prazo são necessários para desenvolver e testar as implicações fisiológicas, patológicos e terapêuticos de anastasis. Propusemos que anastasis poderia ser um mecanismo geral para a sobrevivência de células lesionadas resgatar células que são difíceis de substituir, tais como os neurónios e as células maduras cardíaca 13. No entanto, anastasis de células cancerosas apoptóticas após tratamentos quimioterapêuticos pode resultar na recuperação de células perigosas que conduzem a recidiva de tumores resistentes 12,13. Anastasis também poderia ser um importante mecanismo de desenvolvimento de neoplasias, como algumas células apresentam transformação oncogênico depois que inverteu a apoptose 13. Portanto, realçando anastasis poderia ser um novo Theratera- estratégia para a inibição da neurodegeneração e insuficiência cardíaca, enquanto suprime anastasis como um novo modo para prevenir ou tratar cancros. Desenvolvimento de biossensores para monitorar reversão de apoptose em sistemas modelo de doença vai avançar a compreensão dos mecanismos de sobrevivência de células de anastasis e potenciais terapias para doenças incuráveis, modulando anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Agradecemos Rev. Dr. Ralph Bohlmann e Rev. Dr. James Voelz por sugerir a palavra "anastasis" para descrever a reversão da apoptose; Douglas R. Green para as células HeLa que expressam estavelmente o citocromo c -GFP; Charles M. Rudin e Eric E. Gardner para H446 células; Lamb Heather de assistência em desenho dos desenhos animados para o vídeo; Yee Hui Yeo para valiosa discussão deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), a Bolsa de Estudos Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), bolsa Fulbright 007-2009 (HLT), Life Science Foundation Research fellowship (HLT), NIH concede NS037402 (JMH) e NS083373 (JMH) e Universidade Comitê Grants do Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang é um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação Life Sciences Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics