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大鼠血清适用于哺乳动物全胚胎培养的制备

Biology

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Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture. J. Vis. Exp. (90), e51969, doi:10.3791/51969 (2014).

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Abstract

Introduction

各种型号的动物被用于发育生物学在分子和细胞水平研究发育机制。例如,两栖类和鸟类物种已被广泛地用作传统的模型动物,都适合直接操纵的胚胎,因为这些胚胎发育母体之外。相对于这些动物,哺乳动物胚胎生长在母亲的子宫,并且在稍后阶段的增长是关键取决于子宫的功能。因此,它通常是难以直接操纵哺乳动物胚胎如那些来自小鼠,大鼠在早期阶段。在20世纪60年代,丹尼斯新成立的哺乳动物全胚胎培养(WEC)技术,使用WEC设备有连续供氧和热控制1。职业英语运动中,小鼠和大鼠胚胎能生长在体外 ,( 子宫外)。虽然WEC技术是通过添加各种CHEMIC常用于畸形人的化合物到培养基中,这种技术也被用在各种发育生物学研究,以了解在哺乳动物2-4独特发育机制。例如,WEC是通过使用荧光染料5,细胞移植6,并通过脂质转染7和电穿孔8-13基因导入结合其他技术,如细 ​​胞标记,在野生型和突变体胚胎。

最近, 在子宫内的操作已经被用于分析在啮齿动物胚胎的发育过程的后期和已结合电穿孔技术14-16。然而,这些技术不适合于由于难以在早期阶段实现精确局部注射的DNA溶液成胚胎的着床后和妊娠中期胚胎的操纵。虽然超声引导细胞移植和注射病毒载体的成早期胚胎( ,E8.5-E-9.5中的鼠标), 在子宫内已有报道以前17,18,优秀的技能都需要有很高的成功率进行这些实验。因此,WEC与高可达体外具有优势对于小鼠和大鼠胚胎的操控。

从雄性大鼠制备立即离心(IC)的大鼠血清通常用于WEC介质。当胚培养在植入后阶段( 即,早于E8.0在小鼠或E10.0大鼠),合成培养基和IC大鼠血清的混合物通常被用作用于WEC 19的介质。但是,要培养胚胎在妊娠中期( 。,E8.0-12.5在小鼠胚胎或E10.0-E14.5大鼠胚胎),100%的血清应作为一个媒介,因为目前没有可用的替代介质允许胚胎在体外正常生长超过2天。

高品质的大鼠血清的制备是在WEC的实验实现重复性的关键一步。相比延迟离心,集成电路具有减少溶血时的血清被收集通过挤压纤维蛋白凝块,因为大部分的红血细胞已被分离的纤维蛋白凝块的好处。如溶血性大鼠血清不能支持大鼠和小鼠胚胎的正常生长,血清的使用即时离心制备优选使用延迟离心制备。我们的协议包含其他协议相比,两个额外的步骤18-20( ,,储存在冰上收集的血液前,先离心和保持所收集的血液样本,2小时,4℃第一次离心后)。前者步骤可延缓血液凝块的形成,而后者步骤促进纤维蛋白凝块,易于压缩的固化。因此,我们的协议可以由初学者。然而,重现采血及血清提取准确地单指协议的书籍是非常困难的19-21。在这个视频文章中,我们展示我们的标准协议,以获得最佳的IC大鼠血清,其中包括来自雄性大鼠和提取血清离心的腹主动脉采血的准备。

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Protocol

注:动物实验均按照健康指南的国家研究院​​实验动物的护理和使用进行。委员会对日本东北大学医学院动物实验批准本文所述的实验步骤。

1,麻醉和开腹手术

  1. 采血,用无特定病原体雄性SD大鼠。快速大鼠至少18小时,同时提供水。采集的血液用退休种鸡雄性大鼠在6-8个月的婴儿(550-650克)。
  2. 流2.5-4.0%异氟醚,其是吸入麻醉剂,成箱连接到麻醉装置引入麻醉在2.0-3.5升/分10分钟。大鼠转成箱地介绍麻醉。
    1. 通过检查该响应的刺激与钳爪的损失确认麻醉。覆盖无线鼠的鼻子TH连接到麻醉设备,采血过程中深深地麻醉大鼠口罩。的浓度和流量维持在2.5-4.0%和2.0-3.5升/分钟,分别。
      注意:氟烷不应被用于吸入麻醉,因为胚胎培养是从大鼠麻醉,该试剂显示出在胚胎发育的延迟相比,从胚胎大鼠用异氟烷麻醉22中得到的血清中培养收集的血清中。
  3. 为了避免毛皮的污染,消毒皮肤浇70%乙醇到麻醉的大鼠的腹部。拿起消毒皮肤和腹壁在用一对钳子的下部区域并同时切割这些层朝向胸部区域具有对大剪刀,以暴露内部器官。反映肠道腹腔有一对钳子的外面。
  4. 切开皮肤和腹壁向后肢用一双大剪刀进一步暴露后腹部。反映了多余的脂肪在腹腔有一对钳子的外面。
  5. 拿起内脏脂肪在使用两对钳子的中线,并仔细在一个平行的方向分割的脂肪,以暴露腹主动脉。重复此过程,以分裂内脏脂肪在纵向上可以轻松地找到腹主动脉分叉处。此外,主动脉是搏动,并且可以使用这种特性的相邻腔静脉进行区分。
  6. 拿起腹主动脉周围脂肪和分叉小心地用两对钳,分离脂肪在腹主动脉。

2,采血车

  1. 小心地插入一21号针头连接到20毫升注射器立即颅内主动脉分叉处,以在向下的方向的斜面的尖端。握住注射器用一个手,拉注射器慢慢加收15毫升血液从雄性大鼠。
  2. 从注射器取下针头,并倒入血成两个冰冷的10毫升无菌试管中( 图1A)。保持在冰上的管中,直至离心延缓血液凝块的形成。离心管几个在同一时间减少离心时间。
  3. 通过开胸手术和切割心脏或斩首安乐死的麻醉大鼠。

3。大鼠血清的制备

  1. 离心分离所采集的血液进行5分钟,在1200×g离心和室温(RT)到血液分离成上层和下层( 图1C)。
  2. 保持所述管,在4℃下进行1.5-2小时,以固定的纤维蛋白凝块。
  3. 拿起纤维蛋白凝块中使用一对弯钳的上层,并且挤压的纤维蛋白凝块,分离血清。然后,按纤维蛋白凝块面临做的弯钳wnwards两个层( 图1D)之间的界面附近。
  4. 重复步骤3.3,以进一步分离纤维蛋白凝块。
  5. 离心试管中5分钟,在1200×g离心和RT( 图1E)。
  6. 小心地在空气层流柜用无菌移液管将血清转移至15毫升无菌试管中。
  7. 离心5分钟,收集的大鼠血清在1200×g离心及RT以除去任何剩余的红细胞。
  8. 仔细普尔血清成新15毫升使用无菌移液管,以避免污染残余的红细胞在管( 图1F)的底部灭菌试管中。
  9. 孵育在水浴中的血清在56℃30分钟以灭活补体系统。
  10. 冷却大鼠血清的试管至RT,在该空气层流柜中​​。该血清应当等分,以个别无菌试管10毫升存储该管在-20℃直到使用( 图1H)。

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Representative Results

图1示出的所描述的程序,用于血细胞和血清的分离代表性结果。我们一般会取得将15ml的血液从一个退休的雄性大鼠( 图1A)。通过离心,收集的血液可以被分离成含有血清和血纤蛋白凝块,这是用箭头表示,并将含有血细胞( 图1C)的下层的上层。重要的是,溶血的血样不能被分离成血清和血液的层( 图1B)。离开该管在4℃下2小时后,血纤维蛋白凝块变成固体。此凝固方便的血清从纤维蛋白凝块,利用一对钳子弯曲的(图1D)中分离。试管,随后离心。纤维蛋白凝块是可见的血清和血细胞层( 图1E)之间的接口。从两个试管的血清被收集到使用一次性吸一新管中。我们可以从雄性大鼠获得大约6毫升血清的,如果整个过程是成功的。以进一步除去红细胞,收集血清再次离心。任何剩余的红细胞沉淀在管( 图1F)的底部。我们将上清液转移到新管中,并检查了纯化血清的颜色来判断溶血的程度,即使我们能够从离心后的上层收集血清。对WEC的理想大鼠血清通常表现出浅黄色(左管在图1G),同时用轻微的溶血大鼠血清表现出粉红色的颜色(右管在图1G)。集成电路大鼠血清可以在-20℃(左图1H)被存储为至少6-12个月。轻度溶血血清表现出更深的颜色比理想的血清冻结时(左侧图1H)。


图1。血液离心,从雄性大鼠血清制备的程序。 A)从雄性大鼠身上采集的血液样品等分成两个试管离心。B,C)的非分离的样品(B)和理想分离为含有血清和血纤蛋白凝块的上层(箭头C)和纤维蛋白凝块是用一对镊子的E中的第二次离心后挤压含有血细胞的第一次离心D)之后的较低层的血清和血细胞层。左侧管显示理想的大鼠血清具有浅黄色颜色血细胞的纤维蛋白凝块是在接口(箭头)观察到F)沉淀第三离心(箭头)。G)之后。右管显示有轻度溶血大鼠血清。

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Discussion

在WEC实验可重复性的结果是依赖于使用高品质IC大鼠血清和准确的胚胎解剖技术3。不要缩短采血前禁食期间,因为禁食是必要的血液中的葡萄糖浓度标准化。雌性大鼠不应该被用来进行血清的制备,因为激素水平在雌性动物按动情周期的变化,并且这种变化在雌二醇的激素不适用于胚胎培养物。此外,极其脂肪酸雄性大鼠不应该用于血清制备,以避免在血液中大量脂肪污染。

当采集血液,首先保证的动脉血液的颜色是鲜红的颜色,体现在麻醉状态下正常呼吸。减少呼吸导致减少所收集的血液的量。要恢复在这种情况下,暂时减少的速度注射器是PuLLED。在无血清的制备中最关键的问题是溶血。如果所采集的血液样品表现出严重溶血,血不通过离心分离成两层。因为轻度溶血血清可支持亚最佳发展,例如血清应该被丢弃。如溶血倾向于通过强制压力被诱导,注射器应缓慢收集血液时,拉。为了避免起泡的血液时所采集的血液样品被注入到试管中,这增加了溶血是很重要的。

为了培养小鼠胚胎,从雄性小鼠收集血清IC可理想;然而,这一要求是不实际的,因为我们不能从鼠标获得足够大的体积的血液中。当我们准备大鼠血清,我们准备至少10退休繁殖雄性大鼠。在我们的实验室中,采血常规进行由至少两个个体:个体收集的血液和个别麻醉并进行第一次离心。

迄今为止,在使用商业WEC大鼠血清结合化学定义的培养基一些研究报道23-25。例如,50%的市售的大鼠血清和50%DMEM的混合物支持E8.5小鼠胚胎的36小时和23 E9.75小鼠胚胎的40小时24正常生长的正常生长。在另一个协议中,可用从另一家公司和50%的F12培养基中的N-2 50%大鼠血清组成的混合物还支持E7.5和E8.5小鼠胚胎24小时25的正常生长。不过,目前还不清楚这些媒体组合是否适合大鼠和小鼠胚胎的文化在稍后阶段,如E11.5-E12.5小鼠和E13.5-E14.5的影响。使用替代大鼠血清各种另类媒体职业英语运动的研究也有报道26-28。例如,DMEM/F12,20%胎牛血清(FBS)的组合支持发育opment从E11.5 28小时26大鼠胚胎。然而,这种介质是不适合于鼠胚胎培养从E10.5 28小时26。因此,我们认为,胚胎在含有FBS培养基中正常生长依赖于胚胎萌芽阶段。

WEC使用的无血清培养基包含唯一的定义的试剂,包括市售的胚胎干细胞培养基,牛血清白蛋白,和N-2,补充已有报道。这种介质支持10.5天的小鼠胚胎为16-40小时27文化,28。MORRE -斯科特等人证明了小鼠胚胎24小时培养的头顶到臀部尺寸比E11的显著较小.5胚胎在子宫内生长。然而,其主要的结构,如体节和背根神经节,在这些培养的​​胚胎显示正常。另一方面,Kalaskar和代尔报道,胚胎在该培养基中测试的60%表现出范人的发展18小时后,但良好的发展胚胎中的一个额外的20-22小时培养率下降至30-40%。相反,这些研究中,我们可以成功地从E12.5重现小鼠和大鼠胚胎中使用我们的协议两天产生的100%的IC大鼠血清培养良好的发展( 。,约48小时)大鼠6或10.5天在小鼠8通过在24小时更换培养基一次。这些结果表明,我们的方法用于制备集成电路的大鼠血清是用于各种应用的哺乳动物WECat不同胚胎阶段的实验是有用的。因此,我们希望我们的视频协议将帮助新引进的研究人员利用职业英语运动,以他们的实验室实验。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott B506 For rat anesthesia.
Large scissors Napox B-7H Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. 
Curved forceps Napox A-3-2 Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat Charles Rivers Laboratories Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml) TERUMO SS-29ESZ
Needle (21 G x 5/8") TERUMO NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml) ASIAKIZAI 1101C000B-10 For collection of boold
Sterile disposable pipette Eiken Chemical CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)  Falcon 2196

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References

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