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哺乳類の全胚培養に適したラット血清の調製

Biology

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Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture. J. Vis. Exp. (90), e51969, doi:10.3791/51969 (2014).

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Abstract

Introduction

モデル動物種々の分子および細胞レベルでの発達のメカニズムを調べるために発生生物学において使用される。例えば、両生類や鳥類は、広くこれらの胚が母親の外側を開発するための胚を直接操作するのに適している古典的なモデル動物として使用されている。これらの動物とは対照的に、哺乳類の胚は母親の子宮で成長し、後の段階での成長は、子宮の機能に決定的に依存している。したがって、そのような直接早い段階でのマウスおよびラット由来のもののような哺乳動物の胚を操作するために、典型的には困難である。 1960年代には、デニスの新連続酸素供給や熱制御1とWECの装置を用いて哺乳動物全胚培養(WEC)の手法を確立した。 WECでは、マウスおよびラットの胚は、生体外すなわち、子宮の外側)に成長することができます。 WECの技術は、多くの場合、様々なchemicを添加することによって奇形学において使用されたがらは、培養培地中に化合物が、この技術はさらに、哺乳動物2-4の固有の発達のメカニズムを調べるために、種々の発生生物学研究に使用されている。例えば、WECは、蛍光色素5、細胞移植6、および7リポフェクションおよびエレクトロ8-13を介して遺伝子導入を用いて、野生型及び変異胚におけるこのような細胞標識のような他の技術と組み合わされる。

近年、 子宮操作の段階でげっ歯類の胚における発生過程を分析するために使用されており、エレクトロポレーション技術14-16と組み合わされている。しかしながら、これらの技術は、初期の段階で胚にDNA溶液の正確な局所注射を達成する困難さに起因し、妊娠中期の胚の着床後の操作には適していない。初期胚への超音波ガイド下細胞移植およびウイルスベクターの注入が( すなわち、子宮内でマウスE8.5-E-9.5)は、以前に17,18に報告されている、優れたスキルが高い成功率でこれらの実験を行うために必要とされる。したがって、高いアクセシビリティエクスビボでWECは、マウスおよびラット胚の操作に対して利点を有する。

雄性ラットから調製し、直ちに遠心分離した(IC)ラット血清は、多くの場合、WEC媒体に使用される。胚( すなわち、ラット又はマウスE10.0においてE8.0より以前)着床後の段階で培養すると、合成培地およびICラット血清の混合物はしばしばWEC 19のための媒体として使用される。全く、現在入手可能な代替メディアが許さないので、妊娠中期での培養胚( すなわち 、E8.0-12.5マウス胚またはラット胚におけるE10.0-E14.5)で、100%の血清を培地として使用する必要があります胚は、2日以上、インビトロで正常に成長する。

高品質のラット血清の調製物であるWECの実験で再現性を達成するための重要なステップ。遅延遠心分離に比べて、ICは、赤血球の大部分が既にフィブリン塊から分離されているので、血清はフィブリン塊を圧搾することによって収集されるときに溶血を低減するという利点を有する。溶血性ラット血清、ラットおよびマウス胚の正常な成長を支えることができないように、即時の遠心分離を用いて血清の調製は、遅延された遠心分離を用いて調製することが好ましい。我々のプロトコルは、他のプロトコルに比べて2つの手順が含まれている18〜20( すなわち 、前最初の遠心分離に氷上で採取した血液を貯蔵し、最初の遠心分離の後、4℃で2時間採取した血液サンプルを維持する)。前者のステップは、血栓の形成を遅らせることができ、後者のステップは、簡単にスクイズのため、フィブリン塊の凝固を促進する。そのため、我々のプロトコルは、初心者で使用することができます。しかし、採血し、血清を再生する単にプロトコルブックを参照することにより正確に抽出が19-21は非常に困難である。このビデオの記事では、我々は雄ラット、遠心分離により血清の抽出の腹部大動脈から採血を含み、最適なICのラット血清の調製のための私達の標準的なプロトコルを示しています。

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Protocol

注:動物実験は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行った。東北大学医学部の動物実験委員会は、ここに記載の実験手順を承認した。

1。麻酔および開腹

  1. 採血のために、特定の病原体を含まない雄のSDラットを使用しています。水を提供しながら、少なくとも18時間、ラットを絶食。血液を収集するための年齢(550〜650グラム)の6-8ヶ月で退職した男性のブリーダーラットを使用してください。
  2. 10分間、2.0〜3.5 L /分で、麻酔を導入するために、麻酔装置に接続ボックスに、吸入麻酔薬であるイソフルラン2.5から4.0パーセントを流れる。麻酔を導入するボックスにラットを転送します。
    1. ピンセットで足に刺激に対する応答の低下を確認することによって、麻酔を確認してください。ラットのWIの鼻をカバー深く採血時にラットを麻酔するための麻酔器に接続されたマスクを番目。濃度および流量は、それぞれ、2.5から4.0パーセントと2.0〜3.5 L /分に維持される。
      注:この試薬 ​​展示イソフルラン22で麻酔したラットから得られた血清中で培養した胚に比べ胚発生の遅れで麻酔したラットから採取される血清中の胚が培養されたため、ハロタン吸入麻酔のために使用すべきではありません。
  3. 毛皮の汚染を避けるために、麻酔したラットの腹部に70%エタノールを注ぐことによって皮膚を消毒する。ピンセットで下部領域で消毒し、皮膚や腹壁をピックアップし、内臓を露出させ、大きなハサミで胸部領域に向けて、同時に、これらの層を切った。ピンセットと腹腔の外腸を反映している。
  4. と後肢に向けて皮膚や腹壁をカット大鋏は、さらに後方腹部を露出させる。ピンセットと腹腔の外に余分な脂肪を反映している。
  5. 鉗子の2ペアを使用して正中線で内臓脂肪をピックアップし、腹部大動脈を露出させ、平行方向に慎重に脂肪を分割します。簡単に腹部大動脈の分岐部を識別するために、縦方向に内臓脂肪を分割するには、この手順を繰り返します。加えて、大動脈は拍動性であり、この特性を利用して、隣接する大静脈と区別することができる。
  6. 腹部大動脈の周りの脂肪や鉗子の2ペアを慎重に分岐をピックアップし、腹部大動脈に脂肪を分離する。

2。採血

  1. 下方向に斜面で、大動脈の分岐部に直接頭蓋20ミリリットルの注射器に接続されている21のG針の先端を慎重に挿入します。 1で注射器を保持する手、そして雄ラットからの血液の15ミリリットルを収集するために、ゆっくりとシリンジを引き出します。
  2. 注射器から針を外し、2氷冷10-mlの滅菌試験管( 図1A)に血液を注ぐ。血栓の形成を遅らせるために、遠心分離まで氷上にチューブを保つ。一度に複数のチューブを遠心分離することにより、遠心分離時間を短縮。
  3. 開胸して心臓や断頭を切断することによって、麻酔したラットを安楽死させる。

3。ラットの血清の準備

  1. 上下の層( 図1C)に血液を分離するために1,200×gで、室温(RT)で5分間採取した血液を遠心分離する。
  2. フィブリンクロットを修正する1.5〜2時間、4℃でチューブを保つ。
  3. 湾曲したピンセットを使用して、上層のフィブリン塊をピックアップし、血清を分離するために、フィブリン塊を絞る。すると、DOが直面湾曲したピンセットでフィブリン塊を押す2層( 図1D)との界面近傍wnwards。
  4. さらに、フィブリン塊を分離するためにステップ3.3を繰り返します。
  5. 1200 XGおよびRT( 図1E)で5分間試験管を遠心分離する。
  6. 慎重に層流気流キャビネットに滅菌ピペットを用いて、15​​ミリリットルの滅菌チューブに血清を移す。
  7. 残りの赤血球を除去するために1,200×gで、室温で5分間収集ラット血清を遠心分離する。
  8. プールチューブの底に残留赤血球( 図1F)による汚染を避けるために、滅菌ピペットを用いて注意深く新しい15ミリリットル滅菌チューブに血清。
  9. 補体系を不活性化するために30分間56℃の水浴中で血清をインキュベートする。
  10. 層流気流キャビネットにRTにラット血清のチューブを冷却します。血清は、個々の滅菌チューブに10ミリリットルに等分しなければならない。使用します( 図1H)まで-20℃でチューブを保管してください。

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Representative Results

図1は、血液細胞、血清を分離するための記載された手順の代表的な結果を示している。我々は、一般的に引退した雄性ラット( 図1A)からの血液の15ミリリットルを得る。遠心分離によって、採取した血液、血清、矢印で示されているフィブリン塊、および血液細胞( 図1C)を含む下層を含有する上層とに分離することができる。重要なことには、溶血血液試料は、血清、血液の層( 図1B)とに分離することができない。 2時間4℃でチューブを出た後、フィブリン塊が固体になる。この固化は、湾曲鉗子(図1D)を使用したフィブリン塊から血清を分離するのに便利です。試験管は、その後、遠心分離した。フィブリン塊は、血清および血液細胞層( 図1E)の間の界面に見える。 2本の試験管からの血清に集めた使い捨てピペットを用いて新たなチューブ。全体の手順が成功した場合、我々は、オスのラットからの血清の約6ミリリットルを入手することができます。さらに、赤血球を除去するために、採取した血清を再び遠心分離した。残りの赤血球は、チューブ( 図1F)の底に沈殿した。私たちは、新しいチューブに上清を移して、我々は、遠心分離後、上層から血清を収集することができていても、溶血の程度を判断するために、精製された血清の色をチェックした。軽度の溶血とラット血清はピンクがかった色( 図1Gに右管)示すが、WECのための理想的なラット血清は、一般的に、( 図1(g)にチューブを残した)淡黄色を呈する。 ICラット血清( 図1Hの左側)に-20℃で少なくとも6〜12ヶ月間保存することができる。凍結時に軽度の溶血との血清( 図1Hに残って)理想的な血清より深い色を示した。


図1。血液を遠心分離し、雄ラットの血清を調製するための手順。 A)雄ラットから採取した血液サンプルを遠心分離するための2つの試験管に等分される。B、C)非分離された試料(B)および理想的な分離血清およびフィブリン塊(矢印C)を含有する上層に第一の遠心分離後の血液細胞を含有する下層は、D)フィブリン塊をピンセットを用いて圧搾される。E)は 、血清および血液細胞層を二回目の遠心分離後。血液細胞のフィブリン塊がインターフェイス(矢印)で観察される。F)第三の沈殿を遠心分離(矢印)。G)の後に、左チューブを淡黄色の色で理想的なラット血清を示す。右の管は軽度の溶血とラット血清を示しています。

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Discussion

WECの実験における再現性のある結果は、高品質のICラット血清、正確胚解剖技法3を使用することに依存している。空腹時には、血液中のグルコース濃度を標準化する必要があるため、採血前に絶食期間を短くしないでください。ホルモンレベルが発情周期に係る雌の動物に変化するため、雌ラット血清の調製のために使用すべきではない、およびエストラジオールホルモンのこのような変化は、胚の培養には適していない。また、非常に脂肪雄ラットは、血液中の脂質汚染大量のを回避するために、血清調製のために使用すべきではない。

血液を収集する際、最初の動脈血の色は麻酔下で正常な呼吸を反映して、明るい赤色であることを確認してください。呼吸低下は、採取した血液の量の減少をもたらす。このような場合に復旧するには、一時的に注射器がPUする速度を下げるlled。血清中の準備の中で最も重大な問題は、溶血である。採取した血液サンプルは重度の溶血を示す場合、血液を遠心分離により二層に分離されない。軽度溶血血清は次善の開発をサポートする可能性があるため、このような血清は破棄されるべきである。溶血が強制圧力によって誘発される傾向にあるように、血液を収集する際、注射器をゆっくりとプルアップする必要があります。なお、採取した血液サンプルを溶血を増加させる、試験管に注ぎ入れているときに血液をバブリング避けることが重要である。

培養マウス胚に、雄のマウスから採取したIC血清が理想的であり;我々は、マウスから血液の十分に大きな容量を得ることができないためしかし、この要件は実用的ではない。我々はラット血清を準備するとき、私たちは、少なくとも10の雄ラットを繁殖引退準備。私たちの研究室では、採血を定期的に少なくとも2の担当者が行っている:個々の血液と個々の麻酔を収集し、実行する最初の遠心分離。

今日まで、化学的に明確な培地を組み合わせることによってWECの商業ラット血清を用いたいくつかの研究は、23〜25が報告されている。例えば、50%の市販のラット血清および50%のDMEMの混合物は、36時間2340〜24時間のためのE9.75マウス胚の正常な成長のためのE8.5マウス胚の正常な成長をサポートしています。別のプロトコルでは、別の会社から入手できる50%のラット血清とN-2を補充した50%のF12培地からなる混合物は、24時間25 E7.5とE8.5マウス胚の適切な成長をサポートしています。しかしながら、これらのコンビナトリアル媒体は、マウスにおけるE11.5-E12.5およびラットにおけるE13.5-E14.5のように、後の段階でのラットおよびマウス胚の培養に適しているかどうかは不明のままである。代わりに、ラット血清の様々な代替メディアを使用してWECの研究はまた、26-28に報告されている。例えば、DMEM/F12、20%ウシ胎児血清(FBS)の組み合わせは、開発をサポート28時間26 E11.5からのラット胚のopment。しかし、この媒体は、28時間26 E10.5からのラットの胚培養には適していません。したがって、我々はFBSを含む培地中の胚の正常な成長が胚の胚の段階に依存していると信じています。

唯一市販​​されている胚性幹細胞培地、ウシ血清アルブミン、およびN-2サプリメントを含む定義された試薬からなる無血清培養培地を使用してWECが報告されている。この媒体は16〜40時間27、28のため、E10.5マウス胚の文化をサポートしています。Morreスコット 24時間培養マウス胚のクラウン·ツー·臀部サイズはE11のそれよりもかなり小さいことを示した子宮内で成長した胚0.5。しかし、このような体節および後根神経節などの主要な構造は、これらの培養された胚では正常に表示されます。一方、Kalaskar及びローダーは、この培地中で試験した胚の60%がノルムを示したことを報告ら18時間後の開発が、追加の20〜22時間培養した胚では良い開発率は30から40パーセントに低下した。これらの研究とは対照的に、我々は、正常ラット6又はE10.5でE12.5からICラット血清2日間我々のプロトコルを用いて製造さ( すなわち 、約48時間)は100%で培養したマウスおよびラット胚の良好な現像を再現することができ24時間後に一度培地を交換することにより、マウス8。これらの結果は、ICラット血清を調製するための私たちの方法は、哺乳動物のWECat異なる胚の段階を適用する種々の実験のために有用であることを示唆している。したがって、我々は我々のビデオプロトコルは、新しい研究者が自分の研究室にWECを用いた実験を紹介するのに役立ちますことを願っています。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott B506 For rat anesthesia.
Large scissors Napox B-7H Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. 
Curved forceps Napox A-3-2 Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat Charles Rivers Laboratories Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml) TERUMO SS-29ESZ
Needle (21 G x 5/8") TERUMO NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml) ASIAKIZAI 1101C000B-10 For collection of boold
Sterile disposable pipette Eiken Chemical CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)  Falcon 2196

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References

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