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Preparazione di Rat Siero Adatto per mammiferi tutta la cultura Embrione

Biology

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Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture. J. Vis. Exp. (90), e51969, doi:10.3791/51969 (2014).

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Abstract

Introduction

Una varietà di modelli animali sono utilizzati in biologia dello sviluppo per studiare meccanismi di sviluppo a livello molecolare e cellulare. Ad esempio, anfibi e aviarie sono stati ampiamente usati come animali modello classico che sono adatti per la manipolazione diretta di embrioni perché questi embrioni si sviluppano al di fuori della madre. In contrasto con questi animali, embrioni mammiferi crescono nell'utero della madre, e la crescita in fasi successive è strettamente dipendente dalla funzione dell'utero. Pertanto, è tipicamente difficile da manipolare direttamente embrioni di mammifero come quelli di topo e nel ratto nelle fasi iniziali. Nel 1960, Denis New istituito un mammifero intera coltura degli embrioni (WEC), tecnica che utilizza apparecchiature WEC con un apporto di ossigeno continuo e controllo di calore 1. In WEC, topo e ratto embrioni possono crescere ex vivo (cioè, al di fuori dell'utero). Anche se la tecnica del WEC è stato spesso utilizzato in teratologia con l'aggiunta di vari chemicAl composti nel terreno di coltura, questa tecnica è stata utilizzata anche in diversi studi di biologia dello sviluppo per esaminare unici meccanismi di sviluppo nei mammiferi 2-4. Ad esempio, WEC è combinata con altre tecniche, quali l'etichettatura delle cellule, in wild-type e mutanti embrioni utilizzando colorante fluorescente 5, il trapianto di cellule 6, e l'introduzione del gene via lipofezione 7 ed elettroporazione 8-13.

Recentemente, in manipolazione utero è stato utilizzato per analizzare i processi di sviluppo in embrioni di roditori in fasi successive ed è stato combinato con tecniche di elettroporazione 14-16. Tuttavia, queste tecniche non sono adatti per la manipolazione di postimpianto e midgestation embrioni causa di difficoltà a raggiungere iniezione locale accurata della soluzione di DNA in embrioni nelle fasi iniziali. Sebbene il trapianto di cellule eco-guidata e l'iniezione di vettori virali in embrioni precoci (cioè, Sono stati segnalati E8.5-E-9.5 nel topo) in utero precedentemente 17,18, ottime capacità sono necessarie per eseguire questi esperimenti con un alto tasso di successo. Pertanto, WEC con alta accessibilità ex vivo ha dei vantaggi rispetto alla manipolazione di topo e ratto embrioni.

Subito centrifugati (IC) siero di ratto preparati da ratti maschi è spesso usato per le medie WEC. Quando gli embrioni sono coltivate nella fase post-impianto (cioè, prima del E8.0 nel topo o E10.0 nel ratto), una miscela di terreno sintetico e siero di ratto IC viene spesso usata come mezzo per WEC 19. Tuttavia, per gli embrioni di cultura a metà della gestazione (cioè., E8.0-12.5 in embrioni di topo o E10.0-E14.5 in embrioni di ratto), siero al 100% dovrebbe essere utilizzato come mezzo perché nessun media alternativi attualmente disponibili consentono embrioni a crescere normalmente in vitro per più di 2 giorni.

La preparazione del siero di ratto di alta qualità èun passo fondamentale per il raggiungimento riproducibilità negli esperimenti WEC. Rispetto a centrifugazione differite, IC ha il vantaggio di ridurre emolisi quando il siero viene raccolto comprimendo il coagulo di fibrina perché la maggior parte dei globuli rossi sono stati già separato dal coagulo di fibrina. Come siero di ratto emolitica non riesce a sostenere la crescita normale di ratto e di topo embrioni, preparazione del siero utilizzando immediata centrifugazione è preferibile preparato utilizzando centrifugazione ritardato. Il nostro protocollo contiene due passaggi aggiuntivi rispetto ad altri protocolli 18-20 (es., Conservare il sangue raccolto in ghiaccio prima della prima centrifugazione e mantenere i campioni di sangue raccolti per 2 ore a 4 ° C dopo la prima centrifugazione). Il primo passo può ritardare la formazione del coagulo di sangue, e quest'ultimo passo promuove la solidificazione del coagulo di fibrina per facile spremitura. Pertanto, il nostro protocollo può essere utilizzato da principianti. Tuttavia, la riproduzione di raccolta del sangue e sieroestrazione con precisione semplicemente facendo riferimento ai libri di protocollo è estremamente difficile 19-21. In questo articolo video, dimostriamo il nostro protocollo standard per la preparazione di siero ottimale ratto IC, che comprende la raccolta di sangue dall'aorta addominale di ratti maschi e estrazione del siero mediante centrifugazione.

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Protocol

NOTA: Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Il Comitato per la Sperimentazione Animale della Facoltà di Medicina di Tohoku University ha approvato le procedure sperimentali qui descritte.

1. Anestesia e laparotomia

  1. Per la raccolta di sangue, utilizzare specifici ratti maschi Sprague-Dawley esenti da organismi patogeni. Digiunare i ratti per almeno 18 ore, fornendo acqua. Utilizzare pensionati ratti allevatore maschi a 6-8 mesi di età (550-650 g) per la raccolta di sangue.
  2. Portata 2.5-4.0% isoflurano, che è un anestetico inalatorio, in una scatola collegata ad un apparecchio anestesia introdurre anestesia a 2,0-3,5 L / min per 10 min. Trasferire i ratti nella casella di introdurre l'anestesia.
    1. Conferma anesthetization controllando la perdita della risposta alla stimolazione delle zampe con pinze. Coprire il naso di ratti wi° Una maschera collegata ad un apparecchio di anestesia per anestetizzare profondamente i ratti durante il prelievo. La concentrazione e flusso sono mantenuti a 2.5-4.0% e 2.0-3.5 L / min, rispettivamente.
      NOTA: alotano non deve essere utilizzato per l'anestesia per inalazione perché embrioni coltivati ​​nel siero che vengono raccolti da ratti anestetizzati con questa mostra reagente un ritardo nello sviluppo embrionale rispetto a embrioni coltivati ​​nel siero ottenuti da ratti anestetizzati con isoflurano 22.
  3. Per evitare la contaminazione del pelo, disinfettare la pelle versando il 70% di etanolo sul ventre di ratto anestetizzato. Sollevare la pelle disinfettata e parete addominale in corrispondenza della zona inferiore con un paio di pinze e tagliare questi strati contemporaneamente verso la regione torace con un paio di forbici grandi per esporre gli organi interni. Riflettere l'intestino di fuori della cavità addominale con un paio di pinze.
  4. Tagliare la pelle e la parete addominale verso gli arti posteriori conpaio di forbici grandi per esporre ulteriormente la regione addominale posteriore. Riflettere il grasso extra al di fuori della cavità addominale con un paio di pinze.
  5. Sollevare il grasso viscerale sulla linea mediana utilizzando due coppie di pinze e dividere accuratamente il grasso in una direzione parallela esporre l'aorta addominale. Ripetere questa procedura per dividere il grasso viscerale in una direzione longitudinale di identificare facilmente la biforcazione dell'aorta addominale. Inoltre, l'aorta è pulsatile e può essere distinto dalla vena cava adiacente utilizzando questa caratteristica.
  6. Sollevare il grasso intorno l'aorta addominale e la biforcazione accuratamente con due coppie di pinze e separare il grasso sulla aorta addominale.

2. Raccolta di sangue

  1. Inserire delicatamente la punta di un ago G 21 collegato ad una siringa da 20 ml subito cranialmente alla biforcazione dell'aorta, con il bordo inclinato verso il basso. Tenere la siringa con una solamano, e tirare la siringa lentamente per raccogliere 15 ml di sangue da un ratto maschio.
  2. Rimuovere l'ago dalla siringa, e versare il sangue in due tubi ghiacciati 10 ml sterili test (Figura 1A). Conservare le provette in ghiaccio fino centrifugazione per ritardare la formazione del coagulo. Ridurre il tempo di centrifugazione mediante centrifugazione diversi tubi in una sola volta.
  3. Euthanize il ratto anestetizzato da toracotomia e tagliando il cuore o decapitazione.

3. Rat Siero Preparazione

  1. Centrifugare il sangue raccolto per 5 minuti a 1200 xg e temperatura ambiente (RT) per separare il sangue in strati superiore e inferiore (Figura 1C).
  2. Conservare le provette a 4 ° C per 1,5-2 ore per risolvere il coagulo di fibrina.
  3. Sollevare il coagulo di fibrina nello strato superiore usando un paio di pinze curve, e spremere il coagulo di fibrina per separare il siero. Quindi, premere il coagulo di fibrina con le pinze curve fronte downwards prossimità dell'interfaccia tra i due strati (Figura 1D).
  4. Ripetere passo 3.3 per staccare ulteriormente il coagulo di fibrina.
  5. Centrifugare le provette per 5 minuti a 1200 xg e RT (Figura 1E).
  6. Trasferire accuratamente il siero in una provetta sterile da 15 ml con una pipetta sterile in un armadio flusso d'aria laminare.
  7. Centrifugare il siero di ratto raccolti per 5 minuti a 1200 xg e RT per eliminare cellule rosse rimanenti.
  8. Pool attenzione il siero in un nuovo tubo 15 ml sterilizzati utilizzando una pipetta sterile per evitare la contaminazione da globuli rossi residue al fondo della provetta (figura 1F).
  9. Incubare il siero in un bagno d'acqua a 56 ° C per 30 minuti per inattivare il sistema del complemento.
  10. Raffreddare le provette di siero di ratto a RT nell'armadio aria a flusso laminare. Il siero deve essere frazionare a 10 ml in provette sterili individuali. Conservare le provette a -20 ° C fino al momento dell'uso (Figura 1H).

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Representative Results

La Figura 1 mostra i risultati rappresentativi delle procedure descritte per la separazione delle cellule del sangue e siero. Abbiamo tipicamente ottiene 15 ml di sangue da un ratto maschio, in pensione (Figura 1A). Per centrifugazione, il sangue raccolto può essere separato in uno strato superiore contenente siero e il coagulo di fibrina, che è indicato con una freccia, e uno strato inferiore contenente i globuli (Figura 1C). È importante sottolineare che i campioni di sangue emolitiche non possono essere separati in siero e livelli ematici (Figura 1B). Dopo aver lasciato il tubo a 4 ° C per 2 h, il coagulo di fibrina diventa solido. Questo solidificazione è conveniente per la separazione del siero dal coagulo di fibrina usando un paio di pinze curve (Figura 1D). La provetta è stata successivamente centrifugato. Il coagulo di fibrina è visibile all'interfaccia tra il siero e strati di cellule del sangue (Figura 1E). Il siero dalle due provette sono state raccolte inuna nuova provetta con una pipetta monouso. Possiamo ottenere circa 6 ml di siero di un ratto maschio se l'intera procedura è riuscita. Per rimuovere ulteriormente globuli rossi, il siero raccolto è stato centrifugato di nuovo. Qualsiasi residuo globuli rossi precipitato sul fondo del tubo (Figura 1F). Abbiamo trasferito il surnatante in una nuova provetta e controllato il colore del siero purificato per giudicare il grado di emolisi anche se siamo in grado di raccogliere il siero dallo strato superiore dopo centrifugazione. Il siero di ratto ideale per WEC presenta in genere di colore giallo chiaro (tubo a sinistra in figura 1G), mentre il siero di ratto con emolisi lieve presenta un colore rosato (tubo a destra in figura 1G). Siero di ratto IC può essere conservato per almeno 6-12 mesi a -20 ° C (a sinistra in Figura 1H). Il siero con emolisi lieve esposto un colore più intenso rispetto al siero ideale quando congelati (a sinistra nella figura 1H).


Figura 1. Procedure per la centrifugazione del sangue e la preparazione di siero di ratti maschi. A) I campioni di sangue prelevati da un ratto maschio sono divisi equamente in due provette per centrifugazione. B, C) ​​campione non separati (B) e la separazione ideale nello strato superiore contenente siero e il coagulo di fibrina (freccia in C) e lo strato inferiore contenente i globuli dopo la prima centrifugazione. D) Il coagulo di fibrina è spremuto usando un paio di pinze. E) I livelli di siero e di cellule del sangue dopo la seconda centrifugazione. Il coagulo di fibrina si osserva all'interfaccia (frecce). F) Precipitazione di globuli dopo la terza centrifugazione (freccia). G) Il tubo di sinistra mostra siero di ratto ideale con un colore giallo chiaro. Il tubo di destra mostra siero ratto con emolisi mite.

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Discussion

Risultati riproducibili in esperimenti WEC dipendono l'uso di siero di ratto IC alta qualità e accurata tecnica embrione dissezione 3. Non accorciare il periodo di digiuno prima del prelievo del sangue, perché il digiuno è necessario standardizzare le concentrazioni di glucosio nel sangue. Ratti femmina non devono essere utilizzati per la preparazione di siero perché i livelli ormonali cambiano in femmine secondo il ciclo estrale, e tali cambiamenti di ormoni estradiolo non sono adatti per colture embrionali. Inoltre, ratti maschi estremamente grassi non devono essere utilizzati per la preparazione del siero per evitare una grande quantità di contaminazione lipidi nel sangue.

Quando raccogliere il sangue, prima assicurarsi che il colore del sangue arterioso è un colore rosso brillante, riflettendo la normale respirazione in anestesia. Diminuzione respirazione porta ad una riduzione della quantità di sangue raccolto. Per recuperare in tali casi, ridurre temporaneamente la velocità alla quale la siringa è puLLED. Il problema più critico in preparazione siero è emolisi. Se i campioni di sangue raccolti presentano grave emolisi, il sangue non riesce ad essere separato in due strati mediante centrifugazione. Perché siero leggermente emolizzati può sostenere lo sviluppo sub-ottimale, come il siero deve essere eliminato. Come emolisi tende ad essere indotta dalla pressione forzata, la siringa deve essere tirata lentamente quando la raccolta del sangue. È importante evitare gorgogliare il sangue quando i campioni di sangue raccolti sono versati in provette, che aumenta emolisi.

Per gli embrioni cultura topo, siero IC raccolti dai topi maschile può essere l'ideale; Tuttavia, questo requisito non è pratico perché non possiamo avere un grande volume sufficiente di sangue da un mouse. Quando prepariamo siero di ratto, ci prepariamo almeno il 10 pensionati allevamento ratti maschi. Nel nostro laboratorio, raccolta del sangue è normalmente eseguita da almeno due persone: l'individuo raccolta del sangue e la anestetizzante individuo ed eseguendo l'prima centrifugazione.

Ad oggi, diversi studi con siero di ratto commerciale nel WEC, combinando mezzo chimicamente definito sono stati segnalati 23-25. Ad esempio, una miscela del 50% in commercio siero di ratto e il 50% DMEM supporta la normale crescita di embrioni di topo E8.5 per 36 hr 23 e la normale crescita delle E9.75 embrioni di topo per 40 hr 24. In un altro protocollo, una miscela composta di siero di ratto 50% disponibile da un'altra società e il 50% di media F12 supplementato con N-2 supporta anche la corretta crescita di E7.5 ed E8.5 embrioni di topo per 24 ore 25. Tuttavia, non è chiaro se questi media combinatorie sono adatti per la cultura del ratto e topo embrioni in fasi successive, come E11.5-E12.5 nei topi e E13.5-E14.5 nei ratti. Gli studi WEC attraverso vari mezzi alternativi al posto del siero di ratto sono stati riportati anche 26-28. Ad esempio, una combinazione di DMEM/F12 e siero fetale bovino 20% (FBS) supporta lo svisviluppo di embrioni di ratto da E11.5 per 28 ore 26. Tuttavia, questo mezzo non è adatto a cultura embrione di ratto da E10.5 per 28 hr 26. Pertanto, riteniamo che la normale crescita di embrioni in terreno contenente FBS è dipendente dallo stadio embrionale degli embrioni.

WEC utilizzando terreni di coltura privo di siero composto solo di reagenti definiti, compresi mezzi disponibili in commercio cellule staminali embrionali, sieroalbumina bovina, e N-2 integratore sono stati segnalati. Questo mezzo supporta la coltura di embrioni di topo E10.5 per 16-40 hr 27, 28. Morre-Scott, et al. Dimostrarono che la dimensione corona-to-groppa di embrioni di topo in coltura per 24 ore è significativamente inferiore a quella di E11 0,5 embrioni coltivati ​​in utero. Tuttavia, le principali strutture, quali somiti e gangli spinali, appaiono normali in questi embrioni coltivati. D'altra parte, Kalaskar e Lauderdale riferito che il 60% degli embrioni testati in questo terreno esposto normaAl di sviluppo 18 ore più tardi, ma il tasso di buon sviluppo in embrioni coltivati ​​per un ulteriore 20-22 ore è scesa al 30-40%. In contrasto con questi studi, possiamo riprodurre con successo un buon sviluppo di topi e ratti embrioni coltivati ​​in 100% siero di ratto IC prodotte utilizzando il nostro protocollo per due giorni (cioè., Circa 48 ore) da E12.5 nei ratti 6 o E10.5 in topi 8 cambiando il mezzo una volta a 24 h. Questi risultati suggeriscono che il nostro metodo per preparare siero di ratto IC è utile per una varietà di esperimenti che applicano WECat diversi stadi embrionali di mammifero. Pertanto, ci auguriamo che il nostro protocollo il video aiuterà i nuovi ricercatori introducono esperimenti utilizzando WEC ai loro laboratori.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott B506 For rat anesthesia.
Large scissors Napox B-7H Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. 
Curved forceps Napox A-3-2 Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat Charles Rivers Laboratories Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml) TERUMO SS-29ESZ
Needle (21 G x 5/8") TERUMO NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml) ASIAKIZAI 1101C000B-10 For collection of boold
Sterile disposable pipette Eiken Chemical CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)  Falcon 2196

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References

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