인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

Developmental Biology
 

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Rodríguez-Fuentes, N., Reynoso-Ducoing, O., Rodríguez-Hernández, A., Ambrosio-Hernández, J. R., Piña-Barba, M. C., Zepeda-Rodríguez, A., Cerbón-Cervantes, M. A., Tapia-Ramírez, J., Alcantara-Quintana, L. E. Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix. J. Vis. Exp. (96), e51999, doi:10.3791/51999 (2015).

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Abstract

Introduction

거기 쌍 및 조직에서 ororgan 병변 무기력하고, 경우에 치명적인 때문에 의학 목적의 것으로 이루어진다 tissuesis 하나의 재생. 맥락에서, 건강 노동자들과 연구자들은 지속적으로 새로운 치료 alternativesto가 손상 조직의이 쌍 - 재생 과정을 촉진 제공하는 기술, 방법 및 도구를 찾고있다. 이 세포 계보, 조직 재생 과정을 연구하는 이상적인 모델을 나타내고 있기 때문에, 생의학는 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 분화 할 가능성이 높기 때문에에, 중간 엽 줄기 세포 (MSC들), 특히 성체 줄기 세포에 대한 연구에 초점을 맞추었다 세포 계통은 다소 MSC들과 현실을 치료하기 위해, 중간 엽 줄기 세포의 thetherapeutic 전위 특성은 숙주 조직에서 중간 엽 줄기 세포의 원하는 동작을 보장 생체 재료 및 셀룰러 비계를 이용하여 새로운 세포 배양 기술의 구현을 수반한다.

생체 분석에 복잡한 오픈 시스템에서 외삽 및 구현, 시험 관내 추정에 적합하다. 다공성 뼈 물질과 같은 임의의 지형에 세포 부착을 보장 초점 기술들이 배양 웰의 바닥에 재료의 접착에 의해 연구 및 콜라겐 아가 로스 중합체를 이용되어왔다. 이러한 방법의 경우, 표면 상에 시딩 된 셀 기공 및 상부면 상에 보유 하였다. 그러나, 이러한 양태는 생체 내에서 확보 할 수없는생체를 둘러싸 체액 다공성 지지체의 원하는 위치에서 셀을 드래그 할 수있는 시스템은 복잡한 장비가 필요하지만, 시험관 내 어 세이 (5)에 조골 세포 마커의 발현을 촉진 초음파 자극의 사용이다. 연속 배양의 사용은 배양 배지 내 영양분의 균질 분포를 보장 생물 반응기를 필요로; 이에 기술과 설비의 벽에 부착 매체에서 사용되는 유량 배지 교체시 그러나, 배양 된 세포의 상당한 비율이 손실된다. 이러한 문제는 이러한 유형의 배양 세포 (7)의 충분한 수를 얻기위한 시간이 필요하다 세포 질량을 증가시킨다. 따라서, 본 연구에서 제시된 방법은 세포가 상면 물질 상에 마이크로 질량 시딩 때문에 생체 시스템으로 외삽되어야 기법을 나타내고, 이후 appropri배양 시간을 먹었다, 초기 세포 질량의 60 %가 부착된다. NKB는 osteoconductive 및 골 유도 골격 8 방법이기 때문에 또한,이 기술은 골아 인덕터 (예를 들면, 덱사메타손, 아스코르브 산, 베타 - 글리세로 포스페이트) 또는 조골 세포 분화 및 골 세포 표현형의 유지를 유도하는 초음파 자극의 첨가를 필요로하지 않는다 손상된 뼈 조직에 세포를 삽입하고 조골 세포 계보로 분화를 유도하기 위해이 작업 representsapossibility에서 제시 거대 다공성 뼈 생체 재료에 인간 양막 (AM-중배엽 줄기 세포)에서 중간 엽 줄기 세포의 배양.

Protocol

이 연구는 연구와 관련된 인간의 윤리적 행위에 관한 헬싱키 세계 의학 협회의 선언에 따라 수행하고 Facultad 드 Medicina, UNAM (프로젝트 번호 101-2012)의 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 1. 분리

  1. 시약의 조제
    1. 1 % 항생제 항진균제 용액과 인산 완충 식염수 (PBS) 및 보충을 준비합니다.
    2. 둘 베코 변형 이글 배지, 고 글루코스 (DMEM-HG)을 준비하고, 0.2 ㎛의 필터로 여과하여 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 항생제 - 항진균제 solution.Sterilize이 배양 배지를 추가한다.
    3. FBS 또는 항생제 항진균제 솔루션없이 HG-DMEM 100 U / ㎖에서 콜라게나 제 II 솔루션을 준비합니다.
    4. , 분리에 필요한 고압 증기 멸균에 의한되는 다음 수술 도구를 소독 : 표준 가위를의 간단한 해부 포셉, 미세 포인트와 이빨 집게와 메스 핸들 (# 4).
  2. 양막의 중간 엽 줄기 세포의 분리
    1. 한 손으로 탯줄을 잡고 다른 손으로, 약 5cm (2)의 조각을 얻기 위해, 반투명 시트처럼 보이는 양막 (AM)를 분리. 융모막 부는 시료에 있으면 융모막 부는 양막보다 두꺼운로서, 수동에 의해, 기본 해부 융모막 분리.
    2. PBS 5 ml의 세 가지 세척과 잔여 혈액을 제거하고 간단한 집게와 혈전을 제거합니다. 약 0.5 cm 2의 조각을 생성하기 위해 메스 오전에 작은 상처를 확인합니다.
  3. 양막의 효소 소화
    1. 0.125 % 트립신 5 ㎖ / 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에서 30 분 동안 37 ℃에서 0.5 mM의 EDTA 용액으로 AM 부화. (250) 원심 분리기XG, 5 분 동안 25 ° C 한 다음 상층 액을 버리고 트립신 용액을 제거.
    2. 가끔이 레이 바 등에 따른 진탕하면서 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 2 시간 동안 콜라게나 제 유형 II를 15ml의 용액을 첨가하고, 배양한다. (9)
    3. 즉시 II 콜라겐과 소화 후 250 XG에 15 ml의 PBS 및 원심 분리기를 추가하고 10 분 동안 25 ° C.
    4. 뜨는을 취소하고 250 XG에 PBS 용액과 원심 분리기 15 ㎖를 15 분 동안 25 ° C와 세포 펠렛을 씻는다. 상층 액을 제거한다.
    5. 부드럽게 흔들어 HG-DMEM 10 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁.
  4. 중간 엽 줄기 세포의 확장
    1. 이 종자 배양 플라스크에서 세포 현탁액 (1 × 104 세포 / ㎠) ml의 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 세포를 DMEM-HG 2 ㎖를 추가 배양한다. 5-7 후 배양 배지를 변화시킴으로써 비 - 부착 세포를 제거일.
    2. 이 시간 후에, 90 %의 세포를 얻기 위해 합류 추가 7~10일위한 배지를 3 일마다 변경.
    3. 균체를 회수하고, 0.125 % 트립신 / EDTA 용액 (트립신 처리)와 함께 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 5 분 동안이를 부화.
    4. 즉시 트립신 후, 5 분 250 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 피펫 및 전송에 세포를 수집합니다.
    5. 상층 액을 버리고 HG-DMEM 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁.
    6. 문화 전지 두 75cm 2 배양 플라스크에 서스펜션 (각 플라스크에 5 ml)에 용해시키고, 90 %의 합류까지 문화를 유지한다.
    7. 반복 1.4.3 단계를 반복합니다. 1.4.6에, 9 통로 또는 하위 문화까지.
    8. 유동 세포 계측법 또는 다른 연구 1.4.5하는 단계 1.4.3에서와 같이 트립신 처리하여 세포를 복구 할 수 있습니다.

다공성 뼈 매트릭스 디스크 2. 준비 (NKB)

  1. NKB 디스크를 젖은(직경 12mm, 두께 2mm). 각각의 디스크와 밤새 인큐베이션 Fassina 3에있어서, 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서없이 FBS DMEM-HG의 ㎖, 5
  2. 습윤 처리 한 후, 여분의 배지를 제거하는 5 분 동안 250 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 스핀에 디스크를 넣고. 24 웰 세포 배양 플레이트에 디스크를 놓습니다.
    1. HG-DMEM의 500 μl를 추가하고 25 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 기포가 영양소와 세포의 정확한 분포를 선호하는 NKB 디스크에 존재하지 않는 것을 확인합니다.
    2. 기포 디스크에 발견되면, 흔들어 배양 배지 300 μl를 추가하고, 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 분위기에서 15 분 동안 배양한다. 이 시간이 지나면 잘 세포 배양의 벽을 통해 빠는 배지 300 μl를 제거하고 기포가 형성 없음을 확인합니다.
  3. 간단한 집게를 사용하여 새 24 웰 플레이트에 디스크를 넣습니다.

  1. 전 습윤 생체 디스크의 표면 상에, 세 계대 배양에서 (HG-DMEM 100 ㎕에서 5 × 105 AM-중배엽 줄기) 세포 현탁액 시드 및 37 ℃, 5 % CO 2의 가습 분위기에서 30 분 동안 인큐베이션 ° C. 모든 세포가 지지체의 지형과 상호 작용할 수 있도록 생체 물질의 상면에 천천히 연속적이 단계를 수행한다. 주 :이 절차는 표 1에 나타낸 바이오 물질에 부착 된 세포의 60 %를 달성한다.
  2. 37 ° C에서 5 % CO 2의 가습 분위기에서 3 일 동안 문화를 37 ° C에서 HG-DMEM의 1.5 ML을 추가하고 유지한다. 피 용 배지의 첨가에 난류를 생성하지 않는 배양 접시 접시 바닥에 세포의 성막. 이것은 초기 시간입니다.

흐름 Cytom 4. 세포 표면 마커 특성 분석etry

  1. 매트릭스 디스크에 파종 전에 9 번째 계대 배양에서 세포를 분리합니다. 0.25 % 트립신 / 1 mM의 EDTA를 사용하여 얼음처럼 차가운 2 % 포름 알데히드에서 30 분간를 수정. 고정 후, 0.05 % PBS로 한 번 세포를 씻으십시오.
  2. 얼음에 3 분 동안 20 % 인간의 면역 글로불린과 함께 세포를 배양하여 비특이적 결합을 차단 및 피코 에리 트린 (를 PerCP)와 0.1 × 10 6 세포 씩 품어은 CD73, FITC 접합 된 단클론 항체 CD90, CD34에 대한 PE - 복합 단클론 항체에 대한 단클론 항체를 π 공역 어둠 속에서 25 ° C에서 1 시간 동안, FITC 접합 된 단클론 항체 CD45 및 PE 접합 된 단클론 항체 CD105. 이소 매치 FITC 접합 된 단클론 항체는, PE - 복합 단클론 항체 andPerCP 접합 된 단클론 항체는 음성 대조군을 될 것입니다.
  3. 데이터 수집 및 분석을위한 소프트웨어를 사용하여 표면 마커의 발현 수준을 계산한다.

주사 전자 현미경 5. 세포 접착 검출

  1. PBS로 두 번 문화 3 일에있는 셀 디스크 샘플을 씻어및 0.1 M 나-cacodylate 완충액 (pH 7.2) solutionin 4 % (v / v)의 글루 타르 알데히드와 fixthe 샘플.
  2. 이전 리베라-N 등에 의해보고 된 바와 같이., 현미경 관찰을 위해 열을 준비하고 샘플을 15 kV로의 전위와 500X 및 2000X의 배율에서 주사 전자 현미경을 이용하여 관찰한다.

6. 세포 증식 분석

  1. 배지 1.5 ㎖에 함유 세포 디스크 샘플에 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 세포를 제조업 자의 지침에 필수적 착색제 (AB)에 따른 150 μL를 추가 배양한다.
  2. 즉시 AB (0 시간)에 첨가하고 세포 배양 7 일에 도달 될 때까지 각각 24 시간 후, 600 nm의 기준 파장 570 nm에서 흡광도를 측정한다.

7. 콜로니 형성 단위 (CFU) (11)

  1. 문화 100 100mm 조직 배양 diskin HG-DMEM 당 세포와 14 품다37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 일.
  2. 실온에서 5 ~ 10 분 동안 메탄올 0.5 % 크리스탈 바이올렛 PBS와 문화와 얼룩을 세척 할 것.
  3. 두 번 PBS로 접시를 씻고 혈구를 사용하여 눈에 보이는 식민지를 계산합니다.

Representative Results

인간 중간 엽 줄기 세포 격리

박리 (blunt dissection) (도 1)를 사용하여 융모막으로부터 AM의 기계적 분리 한 후, 접착 세포 집단은 콜라게나 제 및 트립신 II 절단에 의해 수득 하였다. 건강한 도너 어머니로부터 획득 된 광학 현미경 사진 (도 2A) 및 주사 전자 현미경 사진 (도 2B)이 연구에서 사용 된 국지적 태반 3에 도시 한 바와 같이 일째 섬유 아세포와 같은 세포 형태 presenta 배양 접시에 부착 된 선택된 세포 집단이 분리를 게시 withprevious는 동의를 알렸다.

유동 세포 계측법에 의해 특성화

오전로부터 얻은 세포 인구 (3.46 ± 79 %) 표면 중간 엽 마커 CD90 + (6.85 ± 93.5 %)과 CD73 +와 CD105 +에 강하게 반응했다 및 CD34-와 CD45 등 조혈 마커에 부정적인 반응을 보였다. 따라서,이 작품에 사용 된 AM-중배엽 줄기 세포는 이전에 레이 바 등. (그림 3)에 의해보고 accordancewith 정보, 중간 엽했다. 또한,이 결과는 중간 엽 줄기 세포에 대한 세포 치료에 대한 국제 협회 (ISCT)에 의해 확립 된 면역 표현형 특성과 일치한다.

뼈 매트릭스에 세포 부착

주사 현미경 사진에 NKB 축성 후 AM-칠일 중배엽 줄기 세포의 행동을 나타낸다. 생체 재료의 표면은 구형 세포 (첫날), 그리고 분명히 일곱 번째 날에 소 매트릭스 표면에 부착 된 일부 확산 세포로 덮여 있었다. 높은 배율에서 확산 세포 filipodial 프로세스 (FL) (그림 4)를 통해 밀착 것으로 나타났다.

뼈 매트릭스에 세포 증식

AB 분석의 결과는 상대 흡광도의 작은 감소 하였다 U 니트 소 행렬 조건 (+ 골 기질)의 (RAU) 인큐베이션 일일 후 다음 일째, 지지체의 존재 소과의 부재 하에서 수행 배양과 비교하여 통계적으로 유의 한 세포 증식의 증가를 유도 매트릭스 (-bone 매트릭스) (그림 5).

콜로니 형성 단위

CFU는 줄기 세포의 분석 전통적이다. 이 연구에서 고립 된 AM-중배엽 줄기 세포는 배양 14 일째 이산 식민지를 형성하기 위해 능력을 유지.

그림 1
그림 1 : 양막의 분리. (A) 탯줄 (UC)은 양막이 얻어지는 영역을 식별하기 위해 한 손으로 유지된다. (B)는 양막 (AM)은 혈액 신경 밀도없이 반투명 필름을 닮았다.

항상 "> :"유지 - together.within 페이지를 = FO "ve_content 그림 2
그림 2 :. 인간 양막에서 줄기 세포의 형태 학적 특성 후 격리 삼일에서 AM-hMSC 문화 광학 현미경을 이용하여 관찰하고 섬유 아세포와 같은 형태를 보였다.

그림 3
그림 3 :. 특성 유동 세포 계측법은 인간 양막에서 세포가 중간 엽 마커 (CD73, CD90, CD105) 양성 있었기 때문에 오른쪽으로 히스토그램의 변위에 의해 도시 된 바와 같이, 대부분 중간 엽 세포했고, (조혈 마커에 대한 부정적인 CD34 및 CD45), 왼쪽의 히스토그램에 의해 확인 된 바와 같이 변위. PE와 FITC 형광 색소 isotypesfor 컨트롤에서 관찰하는 동안 항원, 빨간색 막대 그래프에 표시됩니다검은.

그림 4
도 4 :.. 소 뼈 매트릭스에 바이오 물질의 기공에 세포의 부착을 보여주는 SEM 이미지의 시리즈 세포 부착 (A)는 구면 상태 (CS)에 바이오 물질에 부착 여러 셀 NKB 기공의 파노라마 비전 생체 물질의 표면 상에 (CF) 평탄화, 소 행렬에 배양 세 하루 누락이 (락)으로 나타내는 뼈 감사 할 수있다. 표면에 적응시키는 과정에서 전지 (B)의 증폭 filipodial 예측을 통해 재료 소 매트릭스에 부착 평평 두 세포 사이 (C)의 상호 작용 (C1, 셀 (1)과 C2 셀 2).. V하려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 서평.

그림 5
그림 5 :. 소 뼈 매트릭스 세포 증식 세포의 증식은 AB 감소에 의해 평가 및 재배 7 일 함께 상대 흡광도 단위로 표현했다. 결과는 부정적 조건 (-bone 행렬)에 비해 정적 달랐다 AM-중배엽 줄기 세포 증식 뼈 매트릭스 (+ 골 기질)의 영향을 나타낸다. (* p <0.05)

그림 6
그림 6 : 중간 엽 줄기 세포의 CFU 분석 초기에 다양한 밀도에서 도금 14 일 동안 배양 (- SD, N = 10 * / 의미).

세포 접착 세포 부착 (%)
바닥에 셀 187,667 ± 1,208 62.47
인공 지지체에 세포 312,333 ± 1,208 37.53

표 1 :. 중으로 두 독립적 인 실험에 소 행렬에 부착 효율 플레이트 접시의 바닥 지지체에 부착 된 세포를 접착 세포 표에 trypsinization.The 데이터에 의해 회수 된 후 혈구에 의해 계수 하였다 대응 표준 편차를 ±

Discussion

양막 (도 1)로부터 수득 된 줄기 세포는 섬유 아세포와 같은 형태, 중간 엽 세포와 유사한 (도 2) 중간 엽 줄기 세포 주로 보여주고 있었다. 또한, 유동 세포 계측법 분석은 이러한 세포는 조혈 계통 마커 (CD34, CD45) (그림 3)에 대한 중간 엽 세포 마커 (CD73, CD90, 및 CD105) 양성 및 음성 인 것으로 나타났습니다. 또한,이 연구에서 고립 된 AM-중배엽 줄기 세포는 CFUs (그림 6)를 형성하는 능력을 제시한다. 마찬가지로,이 양식에 고립 된 중간 엽 줄기 세포는 (그림 5) osteoinductor의 생체 재료 (그림 4)에 연결하고, 발판에 증식 할 수있는 능력을 유지했다.

이러한 이유로,이 연구에서 사용 된 거대 다공성 뼈 생체 재료에 AM-중배엽 줄기 세포의 배양 방법은 손상된 뼈 조직 내의 세포를 삽입 한 differe을 유도 할 수있는 기회를 나타낸다조골 세포 혈통에 ntiation. 이 배양 시스템은 NKB는 osteoconductive andosteoinductive 재료 (8) 때문에 조골 세포 및 조골 세포의 표현형 분화 과정을 유지하기 위해 골아 인덕터의 첨가를 필요로하지 않는다. 인간 태반 등 폐 조직의 사용은 빈번 침습적 방법 또는 낮은 셀 수율 관련된 다른 소스와 비교하여, 중간 엽 줄기 세포로 분화하는 잠재력을 가진 줄기 세포 집단에 액세스하기 위해 간단하고 윤리적 대안을 나타낸다.

셀이 상부 표면 물질 상에 마이크로 질량 시딩 때문에 제안 배양법 생체 시스템으로 외삽 될 수 있으며, 세포에 정착하고 적절한 배양 시간 후에 전체 바이오 물질의 표면에 부착. 이 기술을 구현할 때 또한, 정교한 시약, 장비 및 절차로도 기존의 방법과는 달리, 마이크로 질량 cultureas을 아르 필요하지 않습니다재료에 세포 나누어지는 느리고 꾸준한 침착은 세포가 우선적으로 판의 바닥에 바이오 물질과 상호 작용하지 않도록합니다. 이것은 그들이 표면 또는 세공 내에 있으면 이들이 관계없이 재료에 통합 될 때 세포가 배양 배지에서 필요한 영양분을 가질 것을 보장로서 또 다른 중요한 점은, 세포를 배양하기 전에, 먼저 습윤 물질의 사용이다. 이 유도 및 골아 분화를 유지하기 위해 외부 요인의 첨가를 피할 수 있기 때문에 최종적으로, 골 유도 생체 물질의 사용은이 프로세스에 중요하다. 기술의 한계가 소 행렬의 전위에 기초하여 골 유도된다는 것이다; 그러나, 제안 된 배양 시스템은 20 ~ 200㎛의 기공 분포 어떠한 다공질 재료에 외삽 될 수있다. 따라서, 본 연구에 제시된 절차는 다양한 재료 t에서 중간 엽 줄기 세포를 배양하기위한 다른 방법은모자는 특히 뼈 재생을 위해, 조직 공학을 위해 사용된다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 장학금과 Consejo 나시 오날 드 Ciencia y를 TECNOLOGIA (CONACYT No.49887), Facultad 드 Medicina - UNAM DGAPA IN201510과 DGAPA IN216213에서 제공하는 재정 지원을 인정; 생체 물질에 대한 도움말 연구소의 나시 오날 드 Perinatología의 살바도르 코레아; Nukbone을 기부하고 Biocriss, SA 드 C. V. 또한 잉에 감사드립니다. IIM, UNAM의 헥터 마르티네즈 및 기술 지원을 CINVESTAV의 M EN C 파비 곤잘레스.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sterile phosphate buffered saline GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10010023 cell culture
penicillin-streptomycin GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10378016 cell culture
FBS GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 26140111 cell culture
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 11965118 cell culture
collagenase type II GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 17101015 cell culture
3 mM calcium chloride SIGMA_ALDRICH C5670 cell culture
trypsin/0.5 mM EDTA solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES R001100 cell culture
Trypan Blue solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 15250061 cell culture
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC- CD90, BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD34 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC-CD45 BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD105 BD Pharmigen 562245 cytomery
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Pharmigen BD FACSCalibur cytomery
alamarBlue (AB) LIFE TECHNOLOGIES DAL1025 proliferation cell assay
SUNRISE-reader TECAN, Germany Sunrise proliferation cell assay

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References

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