मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और झरझरा अस्थि मैट्रिक्स पर उनकी खेती

Developmental Biology

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Rodríguez-Fuentes, N., Reynoso-Ducoing, O., Rodríguez-Hernández, A., Ambrosio-Hernández, J. R., Piña-Barba, M. C., Zepeda-Rodríguez, A., Cerbón-Cervantes, M. A., Tapia-Ramírez, J., Alcantara-Quintana, L. E. Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix. J. Vis. Exp. (96), e51999, doi:10.3791/51999 (2015).

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Abstract

Introduction

वहाँ जोड़ी और एक ऊतक ororgan में एक घाव incapacitating हो सकता है और कुछ मामलों में, घातक सकता है क्योंकि चिकित्सा विज्ञान की themain उद्देश्यों की tissuesis एक के उत्थान। इस संदर्भ में, स्वास्थ्य कार्यकर्ताओं और शोधकर्ताओं लगातार नए चिकित्सकीय alternativesto क्षतिग्रस्त ऊतकों की वहाँ जोड़ी-उत्थान की प्रक्रिया को बढ़ावा देने के प्रदान करने की तकनीक, तरीकों और उपकरणों खोज रहे हैं। इस सेल वंश, ऊतक पुनर्जनन प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि इसलिए, जैव चिकित्सा विज्ञान बहिर्जनस्तरीय, mesodermal, और endodermal को अलग करने के लिए कारण इसकी क्षमता के लिए, mesenchymal स्टेम सेल (MSCS), विशेष रूप से वयस्क स्टेम कोशिकाओं के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया है सेल प्रजातियों हालांकि, MSCs के साथ एक वास्तविकता चिकित्सा बनाने के लिए, MSCs की thetherapeutic क्षमता का लक्षण वर्णन मेजबान ऊतक में MSCs के वांछित व्यवहार गारंटी है कि biomaterials और सेलुलर scaffolds के उपयोग से नया सेल कल्चर तकनीक के कार्यान्वयन के साथ किया जाना चाहिए।

विवो assays में खुले परिसर प्रणालियों में एक्सट्रपलेशन और कार्यान्वयन के लिए इन विट्रो आकलन के लिए उपयुक्त हैं। ऐसे झरझरा हड्डी सामग्री के रूप में यादृच्छिक topographies, सेल आसंजन सुनिश्चित करने पर ध्यान केंद्रित है कि तकनीक, संस्कृति कुओं के नीचे करने के लिए सामग्री के आसंजन द्वारा अध्ययन किया और कोलेजन और agarose पॉलिमर नियोजित किया गया है। इन तरीकों के लिए, सतह पर वरीयता प्राप्त थे कि कोशिकाओं pores में और ऊपर की सतह पर बनाए रखा गया। हालांकि, इस पहलू एक में vivo में सुनिश्चित नहीं किया जा सकता हैbiomaterial आसपास के शरीर के तरल पदार्थ झरझरा scaffolds पर वांछित साइट से कोशिकाओं को खींच सकता है, जिसमें प्रणाली, आधुनिक उपकरणों की आवश्यकता है लेकिन इन विट्रो assays 5 में osteoblastic मार्करों की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है जो अल्ट्रासोनिक उत्तेजना, का उपयोग है। निरंतर संस्कृतियों का उपयोग मध्यम संस्कृति में पोषक तत्वों की एक सजातीय वितरण की गारंटी जो बायोरिएक्टर, की आवश्यकता है; इस वजह से यह तकनीक और उपकरणों की दीवारों से मध्यम पालन में प्रयोग किया जाता है कि प्रवाह की दर को मध्यम संस्कृति की जगह हालांकि, जब संवर्धित कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण प्रतिशत खो दिया है। इन मुद्दों संस्कृति के इस प्रकार के और कोशिकाओं 7 के लिए पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए समय के लिए आवश्यक है कि सेलुलर बड़े पैमाने पर वृद्धि हुई है। इस प्रकार, इस काम में प्रस्तुत कार्यप्रणाली कोशिकाओं के एक शीर्ष सतह सामग्री पर सूक्ष्म जन में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं क्योंकि इन विवो प्रणालियों के लिए extrapolated किया जाना चाहिए कि एक तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है, और उपयुक्त के बादऊष्मायन बार खाया, प्रारंभिक सेलुलर द्रव्यमान का 60% पालन किया है। NKB एक osteoconductive और osteoinductive scaffolds के 8, विधि है, क्योंकि इसके अलावा, इस तकनीक osteoblastic inductors के (जैसे, dexamethasone, एस्कॉर्बिक एसिड, या बीटा-glycerophosphate) या osteoblastic भेदभाव और अस्थिकोरक phenotype के रखरखाव के लिए प्रेरित करने के लिए अल्ट्रासोनिक उत्तेजनाओं के अलावा आवश्यकता नहीं है क्षतिग्रस्त हड्डी के ऊतकों में कोशिकाओं डालने और osteoblastic वंश को भेदभाव प्रेरित करने के लिए इस काम representsapossibility में प्रस्तुत Macroporous हड्डी biomaterial पर मानव एमनियोटिक झिल्ली (पूर्वाह्न-hMSCs) से MSCs की संस्कृति के लिए।

Protocol

इस शोध अनुसंधान से जुड़े मनुष्य के नैतिक आचरण के बारे में हेलसिंकी विश्व मेडिकल एसोसिएशन की घोषणा के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था और Facultad डे Medicina, UNAM (परियोजना संख्या 101-2012) के रिसर्च एथिक बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

मानव mesenchymal स्टेम सेल 1. अलगाव

  1. अभिकर्मक की तैयारी
    1. 1% एंटीबायोटिक antimycotic समाधान के साथ फॉस्फेट बफर नमकीन घोल (पीबीएस) और पूरक की तैयारी।
    2. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, उच्च ग्लूकोज (पारा-DMEM) तैयार है, और एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% एंटीबायोटिक antimycotic solution.Sterilize इस संस्कृति के माध्यम जोड़ें।
    3. FBS के या एंटीबायोटिक antimycotic समाधान के बिना पारा-DMEM में 100 यू / एमएल में एक कोलैजिनेज द्वितीय समाधान तैयार है।
    4. अलगाव के लिए आवश्यक autoclaving द्वारा किया जाता है, जो निम्नलिखित शल्य चिकित्सा उपकरणों, जीवाणुरहित: मानक कैंचीएस, सरल विदारक संदंश, ठीक बिंदु और दांतेदार संदंश और एक स्केलपेल संभाल (# 4)।
  2. मानव एमनियोटिक झिल्ली की mesenchymal स्टेम सेल का अलगाव
    1. एक हाथ से गर्भनाल पकड़ो और दूसरे हाथ से, लगभग 5 सेमी 2 का एक टुकड़ा प्राप्त करने के लिए, एक पारदर्शी चादर की तरह लग रहा है जो एमनियोटिक झिल्ली (एएम), अलग। जरायु अनुभाग नमूने में मौजूद है, तो जरायु खंड भ्रूणावरण से अधिक गहरा है, के रूप में मार्गदर्शन विच्छेदन द्वारा अंतर्निहित जरायु अलग।
    2. पीबीएस के 5 मिलीलीटर के तीन washes के साथ अवशिष्ट रक्त निकालें और सरल संदंश के साथ थक्के को हटा दें। लगभग 0.5 सेमी 2 के टुकड़े उत्पन्न करने के लिए स्केलपेल के साथ पूर्वाह्न में एक छोटे से कटौती करें।
  3. एमनियोटिक झिल्ली के enzymatic पाचन
    1. 0.125% trypsin के 5 मिलीग्राम / एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिमी EDTA समाधान के साथ पूर्वाह्न सेते हैं। 250 पर अपकेंद्रित्रXG और 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस और फिर सतह पर तैरनेवाला discarding द्वारा trypsin समाधान निकाल दें।
    2. सामयिक Leyva एट अल के अनुसार झटकों के साथ एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए collagenase प्रकार की 15 मिलीलीटर द्वितीय समाधान जोड़ें और सेते हैं। 9
    3. तुरंत collagenase द्वितीय, साथ पाचन के बाद 250 XG पर 15 पीबीएस के मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज जोड़ने के लिए और 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस।
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 250 XG पर पीबीएस समाधान और अपकेंद्रित्र के 15 मिलीग्राम और 15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस के साथ सेलुलर गोली धोने। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. धीरे झटकों से पारा-DMEM के 10 एमएल में सेलुलर गोली Resuspend।
  4. Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के विस्तार
    1. बीज दो संस्कृति कुप्पी में सेल निलंबन (1 एक्स 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी) के मिलीलीटर, और एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं पारा-DMEM के 2 मिलीलीटर जोड़ने और सेते हैं। 07/05 के बाद संस्कृति के माध्यम से बदलकर गैर पक्षपाती सेल को खत्मदिन।
    2. इस समय के बाद, 90% की एक सेलुलर संगम प्राप्त करने के लिए एक अतिरिक्त 7-10 दिनों के लिए संस्कृति के माध्यम से हर 3 दिन बदल जाते हैं।
    3. कोशिकाओं को ठीक और 0.125% trypsin / EDTA समाधान (trypsinization) के साथ एक 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं।
    4. इसके तत्काल बाद trypsinization के बाद, 5 मिनट के लिए 250 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए एक पिपेट और हस्तांतरण के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा।
    5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पारा-DMEM के 10 एमएल में सेलुलर गोली resuspend।
    6. संस्कृति सेल दो 75 सेमी 2 संस्कृति बोतल में निलंबन (प्रत्येक फ्लास्क में 5 एमएल), और 90% संगम तक संस्कृति को बनाए रखने।
    7. दोहराएँ 1.4.3 कदम। 1.4.6 करने के लिए, 9 पारित होने या उपसंस्कृति तक।
    8. प्रवाह cytometry या अन्य अध्ययन के लिए 1.4.5 करने के लिए कदम 1.4.3 के रूप में trypsinization द्वारा कोशिकाओं को ठीक।

खुली अस्थि मैट्रिक्स डिस्क 2. तैयारी (NKB)

  1. NKB डिस्क गीला करने के लिए(व्यास 12 मिमी, मोटाई, 2 मिमी)।, प्रत्येक डिस्क सेते रातोंरात साथ Fassina एट अल के अनुसार 3 से 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में FBS के बिना पारा-DMEM के मिलीलीटर, 5
  2. गीला प्रक्रिया के बाद, अतिरिक्त संस्कृति के माध्यम से दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए 250 XG पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और स्पिन में डिस्क जगह है। एक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में डिस्क रखें।
    1. पारा-DMEM के 500 μl जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। कोई बुलबुले पोषक तत्वों और कोशिकाओं के सही वितरण के पक्ष में NKB डिस्क पर मौजूद हैं कि सुनिश्चित करें।
    2. बुलबुले डिस्क पर मनाया जाता है, मिलाने और संस्कृति के माध्यम से 300 μl जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 15 मिनट के लिए सेते हैं। इस समय के बाद अच्छी तरह से सेल संस्कृति की दीवार के माध्यम से चूसने संस्कृति के माध्यम से 300 μl को हटा दें और कोई बुलबुले कि फार्म की पुष्टि करें।
  3. सरल संदंश का उपयोग कर एक नया 24 अच्छी तरह से थाली में डिस्क रखें।

  1. पूर्व गीला biomaterial डिस्क की सतह पर, तीन उप-संस्कृतियों से (पारा-DMEM के 100 μl में 5 एक्स 10 05:00-hMSCs) एक सेलुलर निलंबन बीज और 37 पर 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 30 मिनट के लिए सेते सी। सभी सेल पाड़ की स्थलाकृति के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देने के लिए biomaterial के ऊपरी चेहरे पर धीरे धीरे और लगातार इस चरण को पूरा करें। नोट: इस प्रक्रिया तालिका 1 में दिखाया गया biomaterial पर जुड़ी कोशिकाओं के 60% प्राप्त होता है।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में तीन दिनों के लिए संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पारा-DMEM के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें, और बनाए रखने के लिए। बचने के लिए संस्कृति के माध्यम से इसके अलावा में अशांति उत्पन्न न करें कि संस्कृति की थाली डिश के तल पर कोशिकाओं के बयान। यह प्रारंभिक समय है।

फ्लो Cytom द्वारा 4. कोशिका की सतह मार्करों विशेषताetry

  1. मैट्रिक्स डिस्क पर उन्हें बोने से पहले 9 वें उपसंस्कृति से कोशिकाओं को अलग। 0.25% / trypsin 1 मिमी EDTA का प्रयोग करें और ठंडा 2% formaldehyde के में 30 मिनट के लिए उन्हें ठीक। निर्धारण के बाद, 0.05% पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
  2. बर्फ पर 3 मिनट के लिए 20% मानव इम्युनोग्लोबुलिन के साथ कोशिकाओं incubating द्वारा गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक और phycoerythrin (PerCP) के साथ 0.1 एक्स 10 6 सेल aliquots के सेते CD73, FITC संयुग्मित MAb CD90, CD34 के खिलाफ पीई संयुग्मित MAb के खिलाफ MAb संयुग्मित अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए, FITC संयुग्मित MAb CD45 और पीई संयुग्मित MAb CD105। निर्धारण-मिलान FITC संयुग्मित MAb, पीई संयुग्मित MAb andPerCP संयुग्मित MAb के रूप में नकारात्मक नियंत्रण में काम करेंगे।
  3. डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सतह मार्कर की अभिव्यक्ति के स्तर की गणना।

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा 5. कोशिका आसंजन जांच

  1. पीबीएस के साथ दो बार संस्कृति के 3 दिन में सेल-डिस्क के नमूने कुल्लाऔर एक 0.1 एम ना-cacodylate बफर (पीएच 7.2) solutionin 4% (वी / वी) glutaraldehyde साथ fixthe नमूने हैं।
  2. पहले से रिवेरा-एन एट अल द्वारा रिपोर्ट के रूप में।, सूक्ष्म अवलोकन के लिए 10 नमूने तैयार है और 15 केवी का एक बिजली क्षमता में और 500x और 2000x के एक बढ़ाई पर एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग निरीक्षण करते हैं।

6. सेल प्रसार परख

  1. संस्कृति के माध्यम से 1.5 मिलीलीटर, जिसमें सेल-डिस्क नमूने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में कोशिकाओं निर्माता के दिशा निर्देशों के लिए महत्वपूर्ण colorant (एबी) के अनुसार 150 μl जोड़ने और सेते हैं।
  2. इसके तत्काल बाद एबी (0 एचआर) के अलावा और सेल संस्कृति के 7 दिनों तक पहुँचने तक प्रत्येक 24 घंटे के बाद, 600 एनएम के एक संदर्भ के तरंग दैर्ध्य के साथ 570 एनएम पर absorbance के उपाय।

7. कॉलोनी बनाने यूनिट (CFU) 11

  1. संस्कृति 100 100 मिमी टिशू कल्चर Diskin पारा-DMEM के प्रति कोशिकाओं और 14 के लिए सेते37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में दिन।
  2. कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए मेथनॉल में 0.5% क्रिस्टल वायलेट के साथ पीबीएस के साथ संस्कृति और दाग धो लें।
  3. दो बार पीबीएस के साथ प्लेटें धोने और एक hemocytometer का उपयोग दिखाई दे कालोनियों गिनती।

Representative Results

मानव mesenchymal स्टेम सेल अलगाव

कुंद विच्छेदन (चित्रा 1) का उपयोग जरायु से हूँ के यांत्रिक जुदाई के बाद, एक पक्षपाती सेल आबादी ट्रिप्सिन और collagenase द्वितीय पाचन से प्राप्त हुई थी। स्वस्थ दाता माताओं से प्राप्त किया गया ऑप्टिकल माइक्रोग्राफ (2A चित्रा) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (चित्रा 2B) इस काम में इस्तेमाल व्याप्ति placentas में दिखाया गया के रूप में 3 दिनों में तंतुप्रसू-तरह सेल आकृति विज्ञान presenta संस्कृति डिश में संलग्न ये सेल आबादी अलगाव पोस्ट withprevious सहमति को सूचित किया।

फ्लो द्वारा सेल लक्षण वर्णन

पूर्वाह्न से प्राप्त हुई थी कि सेल की आबादी (3.46 ± 79%) सतह mesenchymal मार्करों CD90 (+ 6.85 ± 93.5%) और CD73 + और CD105 + करने के लिए दृढ़ता से प्रतिक्रियाशील था और इस तरह के CD34- और CD45 के रूप में hematopoietic मार्करों के लिए एक नकारात्मक प्रतिक्रिया देखी गई। इस प्रकार,इस काम में इस्तेमाल कर रहा हूँ-hMSCs पहले से Leyva एट अल। (चित्रा 3) द्वारा रिपोर्ट accordancewith जानकारी में, mesenchymal थे। साथ ही, इस परिणाम mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के लिए सेलुलर चिकित्सा के लिए इंटरनेशनल सोसायटी (ISCT) द्वारा स्थापित किए गए थे कि immunophenotype विशेषताओं के साथ मेल खाता है।

हड्डी मैट्रिक्स पर कोशिका आसंजन

स्कैनिंग micrographs NKB पर layering के बाद हूँ-hMSCs सात दिनों के व्यवहार को दर्शाते हैं। biomaterial की सतह गोलाकार कोशिकाओं (एक दिन), और जाहिरा तौर पर सातवें दिन गोजातीय मैट्रिक्स सतह से जुड़ी कुछ प्रसार कोशिकाओं के साथ कवर किया गया था। उच्च बढ़ाई, प्रसार कोशिकाओं filipodial प्रक्रियाओं (फ्लोरिडा) (चित्रा 4) के माध्यम से निकट संपर्क में होना को दिखाई दिया।

हड्डी मैट्रिक्स पर सेल प्रसार

अटल बिहारी परख के परिणामों के सापेक्ष absorbance के में एक छोटी सी कमी देखी गई कि यू एनआईटी गोजातीय मैट्रिक्स हालत (हड्डी मैट्रिक्स) के (राव) ऊष्मायन के एक दिन के बाद और फिर पांचवें दिन, पाड़ की उपस्थिति गोजातीय के अभाव में प्रदर्शन संस्कृति के साथ तुलना में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण सेल प्रसार में वृद्धि लाती है मैट्रिक्स (-bone मैट्रिक्स) (चित्रा 5)।

कॉलोनी बनाने की इकाई

CFU के स्टेम कोशिकाओं की एक पारंपरिक रूप से परख है। इस काम में पृथक पूर्वाह्न-hMSCs संस्कृति में 14 दिनों में असतत कालोनियों फार्म करने के लिए अपनी क्षमता संरक्षित।

चित्र 1
चित्रा 1: एमनियोटिक झिल्ली के अलगाव। (ए) गर्भनाल (यू) एमनियोटिक झिल्ली प्राप्त की है जो इस क्षेत्र में पहचान करने के लिए एक हाथ से आयोजित किया जाता है। (बी) एमनियोटिक झिल्ली (एएम) रक्त innervations बिना एक पारदर्शी फिल्म जैसा दिखता है।

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चित्रा 2:। मानव एमनियोटिक झिल्ली से स्टेम कोशिकाओं के लक्षण के बाद अलगाव तीन दिनों में हूँ-hMSC संस्कृतियों एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मनाया और fibroblast-जैसे आकृति विज्ञान दिखाया गया।

चित्र तीन
चित्रा 3:। लक्षण वर्णन प्रवाह cytometry मानव एमनियोटिक झिल्ली से कोशिकाओं वे mesenchymal मार्कर (CD73, CD90, CD105) के लिए सकारात्मक थे क्योंकि सही करने के लिए हिस्टोग्राम के विस्थापन से दिखाया गया है, ज्यादातर mesenchymal कोशिकाओं थे, और (हिमेटोपोयटिक मार्करों के लिए नकारात्मक CD34 और CD45), बाईं ओर हिस्टोग्राम के विस्थापन से इसकी पुष्टि की है। पीई और FITC fluorochromes isotypesfor नियंत्रण में मनाया जाता है, जबकि एंटीजन, लाल histograms में दिखाया जाता हैकाला।

चित्रा 4
चित्रा 4:।। गोजातीय हड्डी मैट्रिक्स पर biomaterial का pores कोशिकाओं के लगाव दिखा SEM छवियों की एक श्रृंखला कोशिका आसंजन (ए) गोलाकार राज्य (सीएस) में biomaterial का पालन कई कोशिकाओं के साथ एक NKB ताकना की नयनाभिराम दृष्टि और biomaterial की सतह पर (सीएफ) चपटा, गोजातीय मैट्रिक्स पर संस्कृति के तीन दिन में कमी (एलएसी) के रूप में इंगित करता है हड्डी की सराहना करने के लिए भी संभव है। की सतह पर अनुकूल करने की प्रक्रिया में सेल (बी) प्रवर्धन filipodial अनुमानों के माध्यम से सामग्री गोजातीय मैट्रिक्स पर पालन किया और चपटा दो कोशिकाओं के बीच (सी) इंटरेक्शन (सी 1, सेल 1; और सी 2, सेल 2)।। वी करने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण iew।

चित्रा 5
चित्रा 5:। गोजातीय हड्डी मैट्रिक्स सेल प्रसार पर कोशिकाओं के प्रसार को अटल बिहारी कमी द्वारा मूल्यांकन और खेती के 7 दिनों के साथ रिश्तेदार absorbance के इकाइयों में व्यक्त की गई थी। परिणाम नकारात्मक हालत (-bone मैट्रिक्स) के साथ तुलना में स्थिर रुप से अलग था, जो पूर्वाह्न-hMSCs प्रसार में हड्डी मैट्रिक्स (हड्डी मैट्रिक्स) के प्रभाव में दिखाए जाते हैं। (* पी <0.05)

चित्रा 6
चित्रा 6: MSCs की CFU परख शुरू में अलग-अलग घनत्व पर चढ़ाया और 14 दिनों के लिए incubated (- एसडी, एन = 10 * / मतलब है)।

प्रकोष्ठों पालन सेल आसंजन (%)
तल पर प्रकोष्ठों 187,667 ± 1208 62.47
पाड़ कोशिकाओं पर 312,333 ± 1208 37.53

तालिका 1:। तीन प्रतियों के लिए दो प्रयोग स्वतंत्र करने के लिए गोजातीय मैट्रिक्स पर आसंजन की क्षमता प्लेट पकवान के नीचे और पाड़ पर पालन कोशिकाओं का पालन कोशिकाओं तालिका में प्रस्तुत trypsinization.The डेटा से बरामद होने के बाद hemocytometer द्वारा गिना रहे थे अनुरूप मानक विचलन ±

Discussion

मानव एमनियोटिक झिल्ली (चित्रा 1) से प्राप्त किया गया है कि स्टेम कोशिकाओं को एक तंतुप्रसू-जैसे आकृति विज्ञान, mesenchymal कोशिकाओं के समान (चित्रा 2) से पता चला है और मुख्य MSCs थे। इसके अलावा, प्रवाह cytometry assays के इन कोशिकाओं hematopoietic वंश मार्कर (CD34, CD45) (चित्रा 3) के लिए mesenchymal सेल मार्कर (CD73, CD90, और CD105) के लिए सकारात्मक और नकारात्मक रहे थे कि पता चला। इसके अलावा, इस काम में पृथक पूर्वाह्न-hMSCs CFUs (चित्रा 6) के गठन की क्षमता मौजूद है। इसी तरह, इस रूप में पृथक mesenchymal स्टेम सेल (चित्रा 5) osteoinductor biomaterial (चित्रा 4) के लिए देते हैं, और पाड़ पर पैदा करने की क्षमता को बनाए रखा।

इन कारणों के लिए, इस काम में इस्तेमाल किया गया था कि Macroporous हड्डी biomaterial पर हूँ-hMSCs की संस्कृति विधि घायल अस्थि ऊतक के भीतर कोशिकाओं डालने और इसकी विभिन्न प्रेरित करने के लिए एक अवसर का प्रतिनिधित्व करता हैosteoblastic वंश को ntiation। इस संस्कृति प्रणाली NKB एक osteoconductive andosteoinductive सामग्री 8 क्योंकि अस्थिकोरक फेनोटाइप और osteoblastic भेदभाव प्रक्रिया को बनाए रखने के लिए osteoblastic inductors के अलावा आवश्यकता नहीं है। ऐसे मानव प्लेसेंटा के रूप में कचरे के ऊतकों का उपयोग करते हैं, अक्सर आक्रामक तरीके या कम सेल उपज शामिल है कि अन्य स्रोतों के साथ तुलना में, MSCs में अंतर करने की क्षमता के साथ स्टेम कोशिकाओं की आबादी तक पहुँचने के लिए एक सरल और नैतिक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।

कोशिकाओं ऊपर की सतह सामग्री पर सूक्ष्म जन में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, क्योंकि प्रस्तावित संस्कृति विधि में विवो प्रणालियों के लिए extrapolated किया जा सकता है, और कोशिकाओं उपनिवेश और उपयुक्त ऊष्मायन बार के बाद पूरे biomaterial सतह का पालन करें। इस तकनीक को लागू करने के लिए जब इसके अलावा, परिष्कृत अभिकर्मकों, उपकरण और प्रक्रियाओं के रूप में अच्छी तरह से मौजूदा तरीकों के विपरीत, सूक्ष्म द्रव्यमान cultureas कर रहे हैं की आवश्यकता नहीं हैसामग्री पर सेलुलर विभाज्य की धीमी और स्थिर बयान कोशिकाओं को प्राथमिकता प्लेट के नीचे के साथ biomaterial के साथ बातचीत है, और नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए। यह है कि वे सतह पर या pores के भीतर कर रहे हैं अगर वे परवाह किए बिना सामग्री में एकीकृत कर रहे हैं जब कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम से आवश्यक पोषक तत्वों है कि यह सुनिश्चित करता है के रूप में एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु, संवर्धन कोशिकाओं से पहले पूर्व गीला सामग्री का इस्तेमाल होता है। यह प्रेरित और osteoblastic भेदभाव बनाए रखने के लिए बाह्य कारकों के अलावा बचा जाता है, क्योंकि अंत में, एक osteoinductive biomaterial का उपयोग इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। तकनीक की सीमा है कि यह गोजातीय मैट्रिक्स के osteoinductive क्षमता पर आधारित है; हालांकि, प्रस्तावित संस्कृति प्रणाली 200 माइक्रोन के लिए 20 की एक ताकना वितरण के साथ किसी भी झरझरा सामग्री के लिए extrapolated किया जा सकता है। इसलिए, इस काम में प्रस्तुत प्रक्रिया विभिन्न सामग्रियों टी में mesenchymal स्टेम सेल संवर्धन के लिए एक वैकल्पिक तरीका हैटोपी विशेष रूप से हड्डी के उत्थान के लिए, ऊतक इंजीनियरिंग के लिए कार्यरत हैं।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम छात्रवृत्ति और Consejo Nacional डी Ciencia y के Tecnologia (CONACyT No.49887), Facultad डे Medicina-UNAM DGAPA IN201510 और DGAPA IN216213 द्वारा प्रदान की जाने वाली वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं; जैविक सामग्री के साथ मदद के लिए इन्सटीटूटो Nacional डी Perinatología की साल्वाडोर कोरिया; Nukbone दान के लिए और Biocriss, एसए डे सी वी। इसके अलावा आईएनजी करने के लिए धन्यवाद। आईआईएम, UNAM की हेक्टर मार्टिनेज और तकनीकी सहायता के लिए CINVESTAV के एम एन सी रामोस गोंजालेज।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sterile phosphate buffered saline GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10010023 cell culture
penicillin-streptomycin GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10378016 cell culture
FBS GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 26140111 cell culture
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 11965118 cell culture
collagenase type II GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 17101015 cell culture
3 mM calcium chloride SIGMA_ALDRICH C5670 cell culture
trypsin/0.5 mM EDTA solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES R001100 cell culture
Trypan Blue solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 15250061 cell culture
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC- CD90, BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD34 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC-CD45 BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD105 BD Pharmigen 562245 cytomery
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Pharmigen BD FACSCalibur cytomery
alamarBlue (AB) LIFE TECHNOLOGIES DAL1025 proliferation cell assay
SUNRISE-reader TECAN, Germany Sunrise proliferation cell assay

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References

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