Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.
Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.
वहाँ जोड़ी और एक ऊतक ororgan में एक घाव incapacitating हो सकता है और कुछ मामलों में, घातक सकता है क्योंकि चिकित्सा विज्ञान की themain उद्देश्यों की tissuesis एक के उत्थान। इस संदर्भ में, स्वास्थ्य कार्यकर्ताओं और शोधकर्ताओं लगातार नए चिकित्सकीय alternativesto क्षतिग्रस्त ऊतकों की वहाँ जोड़ी-उत्थान की प्रक्रिया को बढ़ावा देने के प्रदान करने की तकनीक, तरीकों और उपकरणों खोज रहे हैं। इस सेल वंश, ऊतक पुनर्जनन प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि इसलिए, जैव चिकित्सा विज्ञान बहिर्जनस्तरीय, mesodermal, और endodermal को अलग करने के लिए कारण इसकी क्षमता के लिए, mesenchymal स्टेम सेल (MSCS), विशेष रूप से वयस्क स्टेम कोशिकाओं के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया है सेल प्रजातियों हालांकि, MSCs के साथ एक वास्तविकता चिकित्सा बनाने के लिए, MSCs की thetherapeutic क्षमता का लक्षण वर्णन मेजबान ऊतक में MSCs के वांछित व्यवहार गारंटी है कि biomaterials और सेलुलर scaffolds के उपयोग से नया सेल कल्चर तकनीक के कार्यान्वयन के साथ किया जाना चाहिए।
<pवर्ग = "jove_content"> हड्डी पुनर्जनन में MSCs के साथ एक संस्कृति के कार्यान्वयन में काबू पाने के लिए मुख्य चुनौती आम तौर पर नियोजित किया गया है माइक्रोमीटर से मिलीमीटर से लेकर pores के adistribution के साथ एक झरझरा संरचना प्रस्तुत करता है जिसमें चयनित biomaterial, पर सेल आसंजन सुरक्षित करने के लिए है लेकिन अक्सर कोशिकाओं के व्यवहार में परिवर्तन है कि परिष्कृत अभिकर्मकों, उपकरण, और प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। इन प्रक्रियाओं के नहीं, बल्कि इस तरह के मानव के रूप में या विवो assays में खुले परिसर प्रणालियों में एक्सट्रपलेशन और कार्यान्वयन के लिए इन विट्रो आकलन के लिए उपयुक्त हैं। ऐसे झरझरा हड्डी सामग्री के रूप में यादृच्छिक topographies, सेल आसंजन सुनिश्चित करने पर ध्यान केंद्रित है कि तकनीक, संस्कृति कुओं के नीचे करने के लिए सामग्री के आसंजन द्वारा अध्ययन किया और कोलेजन और agarose पॉलिमर नियोजित किया गया है। इन तरीकों के लिए, सतह पर वरीयता प्राप्त थे कि कोशिकाओं pores में और ऊपर की सतह पर बनाए रखा गया। हालांकि, इस पहलू एक में vivo में सुनिश्चित नहीं किया जा सकता हैbiomaterial आसपास के शरीर के तरल पदार्थ झरझरा scaffolds पर वांछित साइट से कोशिकाओं को खींच सकता है, जिसमें प्रणाली, आधुनिक उपकरणों की आवश्यकता है लेकिन इन विट्रो assays 5 में osteoblastic मार्करों की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है जो अल्ट्रासोनिक उत्तेजना, का उपयोग है। निरंतर संस्कृतियों का उपयोग मध्यम संस्कृति में पोषक तत्वों की एक सजातीय वितरण की गारंटी जो बायोरिएक्टर, की आवश्यकता है; इस वजह से यह तकनीक और उपकरणों की दीवारों से मध्यम पालन में प्रयोग किया जाता है कि प्रवाह की दर को मध्यम संस्कृति की जगह हालांकि, जब संवर्धित कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण प्रतिशत खो दिया है। इन मुद्दों संस्कृति के इस प्रकार के और कोशिकाओं 7 के लिए पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए समय के लिए आवश्यक है कि सेलुलर बड़े पैमाने पर वृद्धि हुई है। इस प्रकार, इस काम में प्रस्तुत कार्यप्रणाली कोशिकाओं के एक शीर्ष सतह सामग्री पर सूक्ष्म जन में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं क्योंकि इन विवो प्रणालियों के लिए extrapolated किया जाना चाहिए कि एक तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है, और उपयुक्त के बादऊष्मायन बार खाया, प्रारंभिक सेलुलर द्रव्यमान का 60% पालन किया है। NKB एक osteoconductive और osteoinductive scaffolds के 8, विधि है, क्योंकि इसके अलावा, इस तकनीक osteoblastic inductors के (जैसे, dexamethasone, एस्कॉर्बिक एसिड, या बीटा-glycerophosphate) या osteoblastic भेदभाव और अस्थिकोरक phenotype के रखरखाव के लिए प्रेरित करने के लिए अल्ट्रासोनिक उत्तेजनाओं के अलावा आवश्यकता नहीं है क्षतिग्रस्त हड्डी के ऊतकों में कोशिकाओं डालने और osteoblastic वंश को भेदभाव प्रेरित करने के लिए इस काम representsapossibility में प्रस्तुत Macroporous हड्डी biomaterial पर मानव एमनियोटिक झिल्ली (पूर्वाह्न-hMSCs) से MSCs की संस्कृति के लिए।मानव एमनियोटिक झिल्ली (चित्रा 1) से प्राप्त किया गया है कि स्टेम कोशिकाओं को एक तंतुप्रसू-जैसे आकृति विज्ञान, mesenchymal कोशिकाओं के समान (चित्रा 2) से पता चला है और मुख्य MSCs थे। इसके अलावा, प्रवाह cytometry assays के इन कोशिकाओं hematopoietic वंश मार्कर (CD34, CD45) (चित्रा 3) के लिए mesenchymal सेल मार्कर (CD73, CD90, और CD105) के लिए सकारात्मक और नकारात्मक रहे थे कि पता चला। इसके अलावा, इस काम में पृथक पूर्वाह्न-hMSCs CFUs (चित्रा 6) के गठन की क्षमता मौजूद है। इसी तरह, इस रूप में पृथक mesenchymal स्टेम सेल (चित्रा 5) osteoinductor biomaterial (चित्रा 4) के लिए देते हैं, और पाड़ पर पैदा करने की क्षमता को बनाए रखा।
इन कारणों के लिए, इस काम में इस्तेमाल किया गया था कि Macroporous हड्डी biomaterial पर हूँ-hMSCs की संस्कृति विधि घायल अस्थि ऊतक के भीतर कोशिकाओं डालने और इसकी विभिन्न प्रेरित करने के लिए एक अवसर का प्रतिनिधित्व करता हैosteoblastic वंश को ntiation। इस संस्कृति प्रणाली NKB एक osteoconductive andosteoinductive सामग्री 8 क्योंकि अस्थिकोरक फेनोटाइप और osteoblastic भेदभाव प्रक्रिया को बनाए रखने के लिए osteoblastic inductors के अलावा आवश्यकता नहीं है। ऐसे मानव प्लेसेंटा के रूप में कचरे के ऊतकों का उपयोग करते हैं, अक्सर आक्रामक तरीके या कम सेल उपज शामिल है कि अन्य स्रोतों के साथ तुलना में, MSCs में अंतर करने की क्षमता के साथ स्टेम कोशिकाओं की आबादी तक पहुँचने के लिए एक सरल और नैतिक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।
कोशिकाओं ऊपर की सतह सामग्री पर सूक्ष्म जन में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, क्योंकि प्रस्तावित संस्कृति विधि में विवो प्रणालियों के लिए extrapolated किया जा सकता है, और कोशिकाओं उपनिवेश और उपयुक्त ऊष्मायन बार के बाद पूरे biomaterial सतह का पालन करें। इस तकनीक को लागू करने के लिए जब इसके अलावा, परिष्कृत अभिकर्मकों, उपकरण और प्रक्रियाओं के रूप में अच्छी तरह से मौजूदा तरीकों के विपरीत, सूक्ष्म द्रव्यमान cultureas कर रहे हैं की आवश्यकता नहीं हैसामग्री पर सेलुलर विभाज्य की धीमी और स्थिर बयान कोशिकाओं को प्राथमिकता प्लेट के नीचे के साथ biomaterial के साथ बातचीत है, और नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए। यह है कि वे सतह पर या pores के भीतर कर रहे हैं अगर वे परवाह किए बिना सामग्री में एकीकृत कर रहे हैं जब कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम से आवश्यक पोषक तत्वों है कि यह सुनिश्चित करता है के रूप में एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु, संवर्धन कोशिकाओं से पहले पूर्व गीला सामग्री का इस्तेमाल होता है। यह प्रेरित और osteoblastic भेदभाव बनाए रखने के लिए बाह्य कारकों के अलावा बचा जाता है, क्योंकि अंत में, एक osteoinductive biomaterial का उपयोग इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। तकनीक की सीमा है कि यह गोजातीय मैट्रिक्स के osteoinductive क्षमता पर आधारित है; हालांकि, प्रस्तावित संस्कृति प्रणाली 200 माइक्रोन के लिए 20 की एक ताकना वितरण के साथ किसी भी झरझरा सामग्री के लिए extrapolated किया जा सकता है। इसलिए, इस काम में प्रस्तुत प्रक्रिया विभिन्न सामग्रियों टी में mesenchymal स्टेम सेल संवर्धन के लिए एक वैकल्पिक तरीका हैटोपी विशेष रूप से हड्डी के उत्थान के लिए, ऊतक इंजीनियरिंग के लिए कार्यरत हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम छात्रवृत्ति और Consejo Nacional डी Ciencia y के Tecnologia (CONACyT No.49887), Facultad डे Medicina-UNAM DGAPA IN201510 और DGAPA IN216213 द्वारा प्रदान की जाने वाली वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं; जैविक सामग्री के साथ मदद के लिए इन्सटीटूटो Nacional डी Perinatología की साल्वाडोर कोरिया; Nukbone दान के लिए और Biocriss, एसए डे सी वी। इसके अलावा आईएनजी करने के लिए धन्यवाद। आईआईएम, UNAM की हेक्टर मार्टिनेज और तकनीकी सहायता के लिए CINVESTAV के एम एन सी रामोस गोंजालेज।
sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
3mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
trypsin/0.5mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |