El implante de gel de fibrina en pulmón de ratón para el Estudio de la angiogénesis pulmón específico

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Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012, doi:10.3791/52012 (2014).

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Abstract

Los recientes avances significativos en las técnicas de investigación de células madre y de bioingeniería han hecho grandes progresos en la utilización de biomateriales para regenerar y reparar daños en los tejidos simples en los campos de ortopedia y periodontales. Sin embargo, los intentos para regenerar las estructuras y funciones de los órganos (3D) más complejos tridimensionales tales como pulmones no han tenido mucho éxito debido a que los procesos biológicos de la regeneración de órganos no han sido bien explorados. Se está haciendo evidente que la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, desempeña un papel clave en la regeneración de órganos. Recién formado vasculatures no sólo entregar el oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares que se requieren para la regeneración de órganos, pero también proporcionan señales instructivas para la regeneración de los tejidos locales. Por lo tanto, para regenerar con éxito pulmones en un adulto, es necesario recapitular los microambientes-pulmón específico en el que la angiogénesis unidades de regeneración de los tejidos pulmonares locales. Aunque conventional in vivo ensayos de angiogénesis, tales como la implantación subcutánea de la matriz extracelular (ECM) ricos en hidrogeles (por ejemplo, fibrina o colágeno o geles de Matrigel - mezcla de proteínas ECM secretada por las células del sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm ratón), se utilizan ampliamente para explorar la mecanismos generales de la angiogénesis, la angiogénesis pulmonar específica no ha sido bien caracterizado porque los métodos para la implantación ortotópica de los biomateriales en el pulmón no han sido bien establecidos. El objetivo de este protocolo es introducir un método único para implante de gel de fibrina en la superficie de pulmón de vivir ratón adulto, lo que permite la recapitulación exitosa de anfitrión angiogénesis pulmonar derivado en el interior del gel. Este enfoque permite a los investigadores a explorar los mecanismos por los que el microambiente-pulmonar específica controla la angiogénesis y la regeneración alveolar en condiciones normales y patológicas. Desde el lanzamiento biomateriales implantados y suministrar señales físicas y químicas a l adyacentetejidos ung, la implantación de estos biomateriales en pulmón enfermo potencialmente pueden normalizar los tejidos enfermos adyacentes, permitiendo a los investigadores a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares.

Introduction

El objetivo general de este protocolo es la introducción de un método para implantar gel de fibrina en la superficie del pulmón de ratón adulto, que permite a los investigadores caracterizar los mecanismos moleculares de vascular pulmonar y el desarrollo alveolar y aprovechar este conocimiento para desarrollar materiales biomiméticos capaz de recapitular vascular pulmonar fisiológica y la formación alveolar para tratar diversas enfermedades pulmonares.

Más de 35 millones de estadounidenses sufren de enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis pulmonar. Estos pacientes tienen síntomas de larga duración crónicas respiratorias como dificultad para respirar, opresión en el pecho, tos persistente y cansancio, que deterioran significativamente su vida diaria 1-3. A pesar de una gran cantidad de esfuerzo para desarrollar terapias eficaces para estas enfermedades de los pulmones, en la actualidad no existe una cura; Por lo tanto, la calidad de vida de estos pacientes es pobre y económica y los costos humanos son high 4-7. En la actualidad, el trasplante de pulmón es la única manera de salvar a los pacientes con enfermedades pulmonares crónicas en fase terminal. Sin embargo, debido a la escasez de donantes de trasplante, de alto costo, complicaciones graves, y la baja tasa de supervivencia 8-11, el trasplante no es un enfoque óptimo. Rápidos progresos recientes en las técnicas de ingeniería de tejidos ha permitido a los investigadores bioingeniería pulmón implantable por repoblar descelularizado pulmonar completo con varios tipos de células progenitoras o células madre pluripotentes inducidas (iPS) células 12,13. Sin embargo, estos pulmones bioingeniería son funcionales en animales huéspedes sólo durante varias horas después 12,14,15 implantación. Utilizando biomateriales para regenerar las complejas estructuras y funciones de los pulmones ha sido también bastante éxito. Esto puede deberse a que los procesos biológicos fundamentales que rigen la regeneración pulmonar de adultos no han sido bien explorado. En el pulmón, la formación del sistema vascular es uno de los acontecimientos más tempranos y más importantes duriel desarrollo y la regeneración 16-21 ng. Vasculaturas recién formado en el pulmón no sólo entregar oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares necesarios para la formación de órganos, sino que también proporcionan señales reguladoras instructivos a las células circundantes 22-25. Por lo tanto, la angiogénesis juega un papel clave en alveolarization regenerativa en pulmones adultos 24,26,27. Además, la angiogénesis desregulada contribuye a enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) 28, la displasia broncopulmonar (DBP) 21-23, y fibrosis pulmonar 29. Por lo tanto, para desarrollar estrategias más eficientes para la ingeniería de los pulmones o el tratamiento de enfermedades pulmonares crónicas, es necesario comprender los mecanismos fundamentales de la angiogénesis pulmonar específica.

Cada órgano muestra las propiedades mecánicas y químicas únicas, que pueden diferir entre las condiciones fisiológicas y patológicas 30-33. Estos microenviron órgano-específicamentos regulan los comportamientos de las células endoteliales y orquestan formación de la red vascular de una manera específica de órgano 24,34-36. Por lo tanto, para desarrollar estrategias más eficientes para la regeneración de pulmón, el mecanismo subyacente a la angiogénesis pulmonar específica necesita ser entendido. Mientras ensayos de angiogénesis in vivo convencionales tales como la implantación subcutánea de hidrogel se han utilizado ampliamente para la investigación de la angiogénesis 37-39, esos métodos no recapitulan la angiogénesis específico de órgano. Recientemente, un nuevo método para implantar Matrigel en un molde elástico en el pulmón de ratón ha sido desarrollado y demostrado con éxito para reclutar vasos sanguíneos y células epiteliales del pulmón en los geles 22. Este enfoque único permitirá a los investigadores explorar el mecanismo de la angiogénesis-pulmón específico, así como las interacciones entre los vasos sanguíneos y las células pulmonares no vasculares en condiciones fisiológicas y patológicas. Desde 1) Matrigel no es adecuado para la aplicación clínica; 2) el correomolde lastic utilizado para lanzar el gel puede afectar a las interacciones entre los hidrogeles y tejido pulmonar anfitrión y 3) el molde elástico en el pulmón potencialmente causa un deterioro de la función pulmonar y el dolor durante la respiración, como un enfoque más clínicamente relevante, una matriz de fibrina 3D que contiene factores angiogénicos (factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) / factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)) ha sido implantado en el pulmón de ratón sin poner en el molde elástico, y se ha recapitulado éxito anfitrión angiogénesis pulmonar derivados. Gel de fibrina, fibrillas de polímeros generados a partir de fibrinógeno escindido por trombina, es conocido para atrapar una variedad de factores angiogénicos como bFGF y VEGF para acelerar la angiogénesis in vivo 40,41. Debido a su capacidad regenerativa y la naturaleza biodegradable 42, gel de fibrina se utiliza ampliamente en el campo de la ingeniería de tejidos.

Este artículo presenta un enfoque novedoso y único para implante de gel de fibrina en la superficie pulmonar de adult vivirt ratón y demuestra que anfitrión angiogénesis pulmonar derivado se recapitula el interior de los geles en vivo. Este método, que permite a los investigadores estudiar la angiogénesis pulmonar específica, es probable que conduzca al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares y avanzar significativamente los esfuerzos para regenerar con éxito pulmón adulto.

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Protocol

NOTA: El estudio in vivo en animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo del Hospital Infantil de Boston (Números de Protocolo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Todos los fármacos utilizados en este protocolo son de grado farmacéutico y estos medicamentos se preparan en condiciones estériles.

1. Preparación del gel de fibrina

  1. Preparar gel de fibrina que contiene VEGF y bFGF.
    1. Descongelar las soluciones madre de fibrinógeno y trombina que se almacenan a -80 ° C hasta la temperatura ambiente (25 ° C).
    2. Añadir la trombina (concentración final: 2,5 U / ml), CaCl 2 (concentración final: 45 mM), VEGF (concentración final: 0-100 ng / ml) y bFGF (concentración final: 0-100 ng / ml) a la fibrinógeno solución (concentración final: 12,5 mg / ml en 0,9% sodium solución de cloruro 43-45) en un tubo de 1,5 ml.
    3. Mezclar suavemente con la pipeta.
    4. Pipetear suavemente 200 l de la mezcla en un plato de plástico estéril de una forma gota a gota utilizando puntas de pipeta p200.
    5. Incubar las gotas a 37 ° C durante 30-60 minutos hasta que se solidifican.
      NOTA: El gel solidificado se puede mantener en el plato de plástico sellada a temperatura ambiente (25 ° C) durante varias horas antes de la implantación (Figura 1a).
  2. Recorte el gel de fibrina en aproximadamente 3 x 3 x 3 cubos mm utilizando pequeñas tijeras quirúrgicas antes de la implantación.

2. Preparación del ratón

  1. Anestesie ratón adulto (8-12 semanas) mediante inyección intraperitoneal (IP) de inyección de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) y confirmar que el ratón se anestesia adecuadamente por pellizcos del dedo del pie del ratón.
    1. Use ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar la sequedad durante el experimento.
  2. Fu Shaver sobre el lado izquierdo de la caja torácica del ratón.
  3. Realizar intubación endotraqueal del ratón.
  4. Coloque el ratón en la intubación de pie en ángulo de 70 ° y mantenga pulsado el ratón en lugar enganchando sus incisivos superiores sobre una banda pequeña de goma situado en la parte superior del soporte.
  5. Retraer la lengua suavemente a un lado el uso de fórceps romos.
  6. Visualizar la laringe con la ayuda de un microscopio de cuello de cisne iluminador de fibra óptica.
  7. Insertar catéter endotraqueal elástico (21 G) en la tráquea.
  8. Confirme que el ratón está respirando espontáneamente de una manera suave (regular 100-150 respiraciones / min, sin respiración paradójica o superficial).
  9. Coloca el ratón en posición prona con el microscopio de disección.
  10. Mecánicamente ventilar el ratón usando un ventilador de roedores (150 respiraciones / min y 7 ml / kg de volumen corriente).
  11. Cuente costillas para localizar el espacio intercostal entre el 4 y 5 de la costilla.
  12. Crear un campo estéril sobre el área by limpiar a fondo con alcohol y povidona-yodo. Cubra el campo quirúrgico adecuadamente con un paño quirúrgico estéril.

3. Ratón Cirugía

  1. Después de la inyección local de bupivacaína al 0,25% (200 l) en la piel, hacer una incisión en la piel transversal (aproximadamente 1 cm de longitud) sobre el espacio intercostal usando tijeras de disección.
  2. Después de la inyección de bupivacaína al 0,25% (200 l) en el músculo intercostal, hacer una incisión músculo entre el 4 ° y 5 ° costilla utilizando finas tijeras pequeñas.
  3. Insertar un retractor de disección entre las costillas para visualizar completamente el pulmón izquierdo.
    1. Raspe un área pequeña (1 x 1 mm cuadrado) de la pleura visceral del centro del pulmón izquierdo utilizando unas pinzas finas.
    2. Aplique una leve presión sobre el área con un hisopo de algodón estéril hasta que el sangrado y fugas de aire están completamente controlados.
    3. Ponga una pequeña cantidad de mezcla fresca de fibrinógeno / trombina (cola de fibrina) (paso 1.1.2. 20 & #181; l) sobre la zona usando punta de la pipeta p200.
  4. Con cuidado, coloque un gel de fibrina (paso 1.2) usando unas pequeñas pinzas sobre el área (Figura 1b).
    1. Confirmar que el gel está bien fijada en la zona durante los movimientos respiratorios del pulmón.
  5. Asegúrese de que no hay ni fugas de aire masiva ni hemorragia del pulmón.
  6. Cerrar incisiones (capas musculares y de la piel) con sutura absorbible, que no tienen que ser eliminados.
  7. Aspirar la cavidad torácica usando 27 G aguja y jeringa de 1 ml para prevenir el neumotórax.
  8. Terminar la ventilación mecánica.

4. Recuperación Ratón

  1. Asegúrese de que el ratón está respirando espontáneamente de una manera suave (regular 100-150 respiraciones / min, sin respiración paradójica o superficial).
  2. IP inyectar 1 ml de pre-calentado 0,9% de NaCl para evitar la deshidratación.
  3. Deje que el ratón para recuperar en la plataforma de agua caliente que circula.
  4. Retire la endotracheal tubo después de confirmar que el ratón tiene respiración estable.
  5. Inyectar Meloxicam (5 mg / kg, inyección subcutánea (SC), durante 3 días como analgésico postoperatorio.
  6. Vigilar los movimientos del ratón cuidadosamente en un mínimo de intervalos de 15 min hasta que es esternal (capaz de rodar sobre su estómago y permanecen en posición vertical) y consciente.
  7. Después de la recuperación, devuelva el ratón a una nueva jaula aislada de ratones sin necesidad de cirugía.
  8. Supervisar el sitio quirúrgico para detectar signos de infección (enrojecimiento, inflamación, secreción), funciones biológicas básicas de animales (alimentos y la ingesta de agua, micción, defecación, aumento de peso corporal), así como los signos clínicos de dificultad (piloerección, locomoción reducida) al día siguiente a la procedimiento quirúrgico.

5. La recolección del pulmón

  1. 7 a 30 días después de la implantación, la eutanasia el ratón usando CO 2 a través de fuente de gas comprimido.
  2. Hacer una incisión entre la punta del apéndice xifoides y el esternónmuesca (esternotomía mediana) y toda la cosecha de pulmón con el gel implantado para el análisis histológico y bioquímico mediante la reducción de la tráquea y la disección de todas las conexiones al corazón, los pulmones y la tráquea.
  3. Fijar gel implantado con pulmón con una solución de paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ºC, incrustar en compuesto OCT, y tomar las secciones de paso de serie de 30 micras de espesor.
  4. Realizar histológico (hematoxilina y eosina) y los análisis inmunohistoquímicos (marcador endotelial: CD31, marcador epitelial: proteínas acuaporina (AQP) 5 y surfactante (SP) -B) usando el microscopio confocal 22,37,40.
  5. Compilar pilas de secciones ópticas (30 m de espesor) para formar imágenes tridimensionales de endotelial de pulmón y las células epiteliales de la imagen 3D utilizando el software de análisis 37.
  6. Cuantificar áreas proyectadas de los vasos sanguíneos de nueva formación con software de análisis 46.

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Representative Results

Para examinar si la formación vascular anfitrión de pulmón derivado se recapitula en el interior de los biomateriales implantados en el pulmón, geles de fibrina complementan con gran factores angiogénicos VEGF y bFGF (0, 10 y 100 ng / ml cada uno) fueron implantados en la superficie de la que viven los pulmones del ratón como informó utilizando Matrigel 22. Los geles de fibrina 47 que contienen estos factores de crecimiento angiogénicos se fabricaron como se muestra en la Figura 1a. Después de la toracotomía, una pequeña área de la superficie del pulmón izquierdo se raspó usando fórceps y el gel de fibrina fabricado se implantó en el pulmón del ratón adulto usando una pequeña cantidad de pegamento de fibrina, que es aprobado por la FDA y ampliamente utilizado como un sellante eficaz para detener fugas de aire y reducir el sangrado en cirugía pulmonar 48,49 (Figura 1b). La mayoría de los ratones se recuperaron sin síntomas respiratorios graves (por ejemplo, neumotórax, dificultad respiratoria). Siete días después de la implantación, los ratones fueron sacrificados y los pulmones eran harvested. Gel de fibrina implantado se incorporó en el pulmón de acogida 7 días después de la implantación (Figura 1c). Reconstrucción 3D de imágenes de fluorescencia confocal ha demostrado que las células endoteliales CD31-positivas derivadas del huésped formadas redes vasculares dentro de los geles de 7 días después de la implantación de una manera dependiente de la dosis de VEGF / bFGF (figura 2a, c). Tipo I (AQP5 positivo) y tipo II (SP-B positivo) células epiteliales del pulmón también fueron reclutados largo de los vasos sanguíneos recién formados dentro de los geles que fueron suplementados con mayores concentraciones de VEGF y bFGF (cada uno de 100 ng / ml) (Figura 2a) . Tinción H & E de secciones histológicas reveló que otros tipos de células huésped también migran en el gel de 7 días después de la implantación (Figura 2b). Estos hallazgos sugieren que anfitrionas redes vasculares pulmonares regenerativas derivadas de éxito se construyen dentro de los geles de fibrina que se complementan con factores angiogénicos y se implanta en la superficie de mou adultoSE pulmón.

Figura 1
Figura 1:. (A) de gel de fibrina preparado antes de la implantación (b) gel de fibrina implantado sobre la pleura visceral raspado del pulmón izquierdo (puntas de flecha) (c) Implantado gel de fibrina (puntas de flecha) incorporado en el pulmón de acogida 7 días después de la implantación.. Las barras de escala 1 mm.

Figura 2
Figura 2: (a) micrografías de fluorescencia que muestra la formación de las redes vasculares (CD31 positivo; verde) y tipo reclutado I (AQP5-positiva; magenta) o tipo II (SP-B positivo; magenta) células epiteliales del pulmón dentro del gel de fibrina complementados con diversas concentraciones de VEGF y bFGF (0, 10 y 100 ng / ml cada uno) 7 días después de la implantación. Las líneas discontinuas indican la interfaz entre el gel de fibrina implantado y de pulmón host. Barra de escala:. 20 micras (b) Microfotografía de luz de la tinción de H & E mostrando infiltración de células huésped en el gel de fibrina 7 días después de la implantación. Las flechas indican la interfaz entre el gel y el pulmón host. Barra de escala: 20 m (c) Gráfico que muestra las áreas proyectadas de los vasos sanguíneos de nueva formación en los geles de fibrina que se complementan con diversas concentraciones de VEGF y bFGF (0, 10 y 100 ng / ml cada uno) 7 días después de la implantación..

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Discussion

Este artículo presenta un nuevo método para implantar biomateriales en la superficie de pulmón de vida del ratón adulto. Con este sistema, la angiogénesis derivada de pulmón de acogida se recapitula con éxito dentro del material. Este sistema permite a los investigadores a explorar la diafonía entre las células endoteliales, otras células (por ejemplo, células epiteliales, células mesenquimales, células inmunes) y diversos componentes de ECM que son necesarios para la angiogénesis local de 50-53 y regeneración alveolar 24,54. Aunque la implantación subcutánea de hidrogel convencional in vivo se ha utilizado ampliamente para la investigación de la angiogénesis 37-39, esos métodos no recapitulan la angiogénesis específico de órgano. Este sistema, en el que hidrogel se implanta directamente en la superficie del pulmón, permitirá a los investigadores a explorar los roles del microambiente pulmonar específica en la angiogénesis y la regeneración alveolar en pulmón de ratón adulto. Estos geles pueden ser fabricados de diversos BIOMATE ECM-ricariales (por ejemplo, colágenos, fibrinas) que se pueden complementar con diversos factores químicos (por ejemplo, factores angiogénicos, factores de crecimiento) 55,56, células progenitoras y / o células iPS. Además de los factores químicos, fuerzas mecánicas también controlan la angiogénesis 23,37. La rigidez de los cambios de gel de fibrina en un fibrinógeno de manera dependiente de la concentración 57 y la manipulación de la concentración de fibrinógeno puede afectar la angiogénesis no sólo a través de señales químicas, sino también a través de señales físicas 58,59. Por lo tanto, las propiedades fisicoquímicas de los geles de fibrina pueden necesitar ser optimizado cuidadosamente para recapitular la angiogénesis fisiológica específica de órgano en el futuro. La curación de heridas después de raspar la pleura visceral también produce un coágulo de fibrina endógena, que incluye varios tipos de células huésped y promueve el proceso de curación y regeneración de tejidos. Este coágulo natural puede interactuar con el gel de fibrina exógenamente implantado, y por lo tanto controlar angiogénesis en el gel implantado. Fluorescently fibrinógeno marcado puede permitir a los investigadores distinguir entre coágulo de fibrina natural y gel de fibrina implantado y explorar estos mecanismos. Aunque este es un poderoso método para caracterizar la angiogénesis en los pulmones del ratón adulto, la aplicación para el estudio del desarrollo de pulmón y enfermedades en ratones recién nacidos probablemente presentan desafíos técnicos.

El objetivo final de este estudio es reclutar vasos sanguíneos funcionales en geles de fibrina implantados en pulmones enfermos y de utilizar la matriz como un dispositivo médico para restaurar las estructuras funcionales de pulmón. Posibles comunicaciones entre las células huésped y el vascular y estructuras alveolares dentro de los geles así como la funcionalidad de estas estructuras deben explorarse en futuros experimentos. Dado que los niveles de VEGF en los pulmones están disminuidos en pacientes con TLP 60 y el enfisema 61, añadiendo VEGF a la matriz puede mejorar el reclutamiento de los vasos sanguíneos en los impl matrizrealizado una apuesta inicial en estos pulmones enfermos. Propiedades mecánicas también difieren entre los pulmones sanos y enfermos 23,62. Por ejemplo, la expresión de metaloproteinasas de la matriz y la lisil oxidasa, que controlan la degradación y reticulación de los colágenos, respectivamente, se altera en diversas enfermedades pulmonares incluyendo EPOC y fibrosis pulmonar 63-67. En pulmones enfermos, ciertos linajes de células progenitoras endoteliales de pulmón y células epiteliales se agotan 68. Por lo tanto, la manipulación de estos factores (factores angiogénicos, ECMs, ECM) de rigidez o implantar geles de fibrina complementados con células progenitoras 69 es probable que conduzca a la formación de vasos sanguíneos funcionales dentro de la matriz y la recuperación de la función pulmonar en varias condiciones patológicas. Dado que los factores químicos pueden complementarse dentro de los geles de fibrina para modular la angiogénesis local, este sistema también se puede utilizar explorar señales ambientales específicas que pueden normalizar pulmones enfermos en enfermedades pulmonares crónicas. En resumen, este artículo presenta un método para implante de hidrogel de fibrina en la superficie de pulmón de ratón vivo, que permite a los investigadores caracterizar la angiogénesis pulmonar específica in vivo. Modificación de diversos factores (por ejemplo, transcurso del tiempo, las concentraciones y combinaciones de factores angiogénicos, varios tipos de hidrogeles, propiedades fisicoquímicas de hidrogeles) en este sistema, dará a conocer los mecanismos de la angiogénesis y la regeneración en el pulmón. Por lo tanto, este sistema avanzará significativamente el conocimiento científico de la biología vascular básica, ingeniería de tejidos, así como la medicina pulmonar.

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Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por fondos de la American Heart Association (AM), el Departamento de Defensa de Estados Unidos (BC074986) y del Hospital Infantil de Boston Facultad beca Desarrollo Profesional (TM, AM). Los autores agradecen a Amanda Jiang y Jiang Elisabeth para la asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibrinogen from human placenta Sigma F4883 For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma Sigma T9549 For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164 R&D 493-MV For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF R&D 3139-FB For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific INC RIS 100 For intubation
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-565-35 For intubation
21 G Elastic catheter B.Braun 4251652-02 For intubation
MiniVent Ventilator Harvard Apparatus CGS-8009 For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope Fisher Scientific 12-070-515 For surgey
Absobable suture Ethicon PDP304 Surgical suture
Antibody against CD31 BD Biosciences 553370 Immunohistochemistry
Antibody against AQP5 Abcam AB78486 Immunohistochemistry
Antibody against SP-B Abcam AB40876 Immunohistochemistry

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References

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