사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

Immunology and Infection
 

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Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. J. Vis. Exp. (93), e52065, doi:10.3791/52065 (2014).

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Abstract

플라크 분석은 세포 배양 물에서 분리 된 플라크 (감염성 단위 및 셀룰러 데드 존)의 계산을 통해 감염성 virons 항 바이러스 물질의 직접적인 정량 가장 정확한 방법 중 하나로 남아있다. 여기에서 우리는 기본적인 플라크 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다, 그리고 : 서로 다른 오버레이 기술은 플라크 형성과 생산에 영향을 미칠 수있는 방법에 대해 설명합니다. 일반적 아가 로스 또는 카르복시 메틸 셀룰로오스 등의 고체 또는 반고체 오버레이 기판은, 액상 성장 배지 통해 무차별 감염을 예방, 바이러스 확산을 제한하는데 사용되어왔다. 고정화 오버레이 이산 가산 초점 및 후속 플라크 형성의 형성을 허용하는 즉시 주변의 단층 세포에 감염을 제한. 전통적인 오버레이를 사용하여 고유의 어려움을 극복하기 위해, 미결정 셀룰로오스 및 카르복시 메틸 셀룰로스 나트륨을 이용하는 신규 한 액체 오버레이 점점 표준 교체로 사용되어왔다플라크 분석. 액체 오버레이 플라크 분석은 쉽게 전통적인 기법에 따라 표준 6 또는 12 웰 플레이트 형식 중 하나를 수행하고 특별한 장비를 필요로 할 수 없습니다. 그것의 액체 상태 응용 ​​프로그램 및 제거 이후의 용이성, 미세 배양 플레이트 형식은 다른 방법으로 큰 규모 바이러스 적정에, 신속 정확하고 높은 처리량의 대안으로 활용 될 수있다. 비 가열 점성 액체 폴리머의 사용은 작업을 간소화 할 수있는 기회를 제공 시약, 인큐베이터 공간없이 시약 가열 또는 유리와 같은 전통적인 또는 높은 봉쇄 실험실에서 사용되는 운영 안전성이 요구되는 증가를 절약합니다. 액체 오버레이는 또한 특정 열 불안정한 바이러스에 대한 기존의 오버레이보다 더 민감한 증명할 수 있습니다.

Introduction

가능한 바이러스 샘플의 정확한 분리 및 정량 지속적으로 바이러스학의 지속적인 연구의 목표였다. 먼저 1, 2를 개발 한 수단이 질적, 양적 동물 바이러스 역가를 계산하기 위해 1952 년 플라크 분석의 출현까지이지 않았다. 이 기술은 처음 적응 이전에 식물 생물학 1, 2에서 스톡 박테리오파지의 역가를 계산하기 위해 사용 된 파지 분석에서 수정되었습니다. 바이러스의 정량화를위한​​ 대체 수단이 보낸 같은 면역 형광 및 투과 전자 현미경, 가변 저항 펄스 감지 (TRPS)로, 개발 및 채택되었지만, 계측법 재조합 리포터 시스템을 유동하고 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR) 이러한 방법은 복제 가능 virons 1,3를 확인하고 정량하는 데 실패. 기술과 기술의 발전은 수정과 풍경을 변경하기 위해 계속하는 동안, plaqu전자 분석은 전염성 용균 virons 1,4에 대한 바이러스 농도를 결정하는 황금 표준을 나타 내기 위해 계속합니다.

플라크 분석 동안, 숙주 세포의 합류 단층 직렬 5-100 비리 사이 전형적 가산 범위로 희석 된 미지 농도의 용균 바이러스에 감염된다. 감염된 단일 층은 무차별 바이러스 전파시 액체 매질의 기계적 또는 convectional 흐름 중 하나를 통해 확산되는 바이러스 감염을 방지하기 위해 고정화 오버레이 배지로 덮여있다. 아가 로스, 메틸 셀룰로오스 또는 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC) 등의 고체 또는 반고체 오버레이 전통적으로 사용되었지만, 액상 오버레이는 아비셀 5-7 신규 한 액체 오버레이 개발 점점 매력적인 대안이되고있다. 오버레이 될 수있는 전통적인 오버레이 대 액체 이용하는 플라크 분석법 APPL 여러 가지 장점을 가지고실온 및 애플리케이션 및 제거에 염기성으로 상당히 쉽다. 액체 오버레이 온난화를 필요로하지 않기 때문에, 섬세하고 열 불안정한 바이러스는 플라크에 쉽게 증명할 수 있습니다.

초기 감염 및 고정화 오버레이, 개인 플라크, 또는 세포 사멸의 영역의 응용 프로그램 후, 바이러스 성 감염과 복제가 주변 단층에 제약을 개발하기 시작합니다. 감염된 세포는 복제 용균 감염 사이클을 계속해서 점점 더 뚜렷하고 분리 된 플라크의 결과 감염을 전파 할 것이다. 사용 된 바이러스의 성장 동역학 및 숙주 세포에 따라 보이는 플라크 일반적 2~14일 내에 형성 할 것이다. 세포 단층을 용이하게 육안으로 플라크를 식별하기 위해 다음 표준 명 시야 현미경으로 카운트되거나,보다 통상적으로 중성 적색 또는 폭력적인 결정에 의해 고정 및 대조있다. 사용할 수 플라크 카운터 얼룩의 다양한 각을 제공하는 일이 있습니다EIR 특정 장점과 단점. 크리스탈 바이올렛은 전형적으로 혼합 된 형태가 존재할 때 아주 작은 플라크의 식별을 허용하는 신속하고 뚜렷한 카운터 염색을 제공하는 컬렉션의 시점과 오버레이의 고정 / 제거 후에 추가된다. 중립 빨간 알 수없는 바이러스 나 복제 반응 속도로 작업 할 때 특히 유용합니다 플라크 형성을 개발의 실시간 감시를 허용, 초기 응용 프로그램과 오버레이 일정한 접촉의 장점이있다. 그러나 우리는 중립적 인 빨간색을 사용하는 경우 염색은 일반적으로 별개 아니라는 것을 발견했다. 노란색 컬러 염료 얼룩은 어두운 파란색과 바이러스 플라크 오버레이의 제거와 같은없이 카운트 할 수있는 세포를 살아 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를, 여러 가지 이점을 제공한다 중립 빨간색. MTT에 의해 제공되는 라이브와 죽은 세포 사이의 높은 콘트라스트 또한 이전 시점으로 포인트 포스트 감염에 작은 반점의 검출을 허용스토리지 여전히 오버레이 (8)의 제거를 필요 않는다. 크리스탈 바이올렛 단순히 물과 알코올의 용액 제, 혼합 된 플라크 형태 감도의 높은 정도를 제공 할 수있는 바와 같이 프로토콜은 우리가 잘 여러 가정을 이용되므로 입증을 위해, 우리는 바람직한 단순화 카운터 스테인으로 선택한 특성화 된 바이러스.

감염된 세포 단일 층을 고정하고 염색 한 후, 플라크는 밀리리터 당 플라크 형성 단위 (PFU)의 관점에서 바이러스 재고 샘플을 역가하기 위해 계산됩니다. 5-100 플라크가 기준으로 사용하여 음성 대조군, 카운트 사이 로그 강하는, 플레이트의 크기에 따라, 일련의 희석액 사이에 주목되어야한다. 통계적으로 샘플은 샘플을 비교하는 3를 복제 할 때 계산 매 100 패 10 %에 의해 달라질 수 있습니다. 바이러스 역가를 결정하는 플라크 어 세이를 사용하는 장점은 w 감염성 바이러스 입자의 실제 수를 정량 할 수있는 능력에 달려샘플을 ithin. 여러 비리가 잠재적으로 하나의 세포를 감염시킬 때, virons 대 단위의 용어는 플라크 적정 1,2 중에 사용됩니다.

플라크 형태는 크게 다른 성장 조건에서 바이러스 종에 따라 다를 수 있습니다. 그들 문제의 바이러스의 성장 및 독성 인자에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수있는 플라크 크기, 선명도, 테두리 정의 및 분포는 모두 유의해야한다.

기본 플라크 분석 원칙은 또한 적응 및 초점 형성 분석법 (유리 지방산)의 사용과 같은 다른 방법으로, 다수의 수정 될 수있다. 유리 지방산은 플라크 형성을 검출하는 세포 용해 및 대조 염색에 의존하는 것이 아니라 직접 태그 항체 통해 세포 내 바이러스 성 단백질을 탐지하는 기술을 면역 염색을 이용하지 않는다. 증가 된 감도, 가장 중요한 비 용균 바이러스 모두 별개 정량화하는 능력을 감염 후 배양 시간을 감소하고,장점은 유리 지방산을 사용합니다. 널리 사용되는 반면, 기존의 플라크 분석 대 유리 지방산의 중요한 제한 요소는 적절한 항체의 필요성과 실제 감염 virons 4 대 바이러스 단백질 서브 유닛에 대해서만 조사 할 수있는 능력에있다.

본 연구의 목적을 위해, 우리는 고전 플라크 어 세이에 논의 제한되며 신규 액체 미결정 셀룰로오스 오버레이와 함께, 전통적인 고체 및 반고체 오버레이 (아가 로스 및 CMC)의 사용을 설명한다.

Protocol

세포 및 시약 1. 준비

  1. 100 % 컨 플루 - 하루 전에 문제의 바이러스에 대한 분석, 판 적절한 숙주 세포 (표 1, 2) 90시에.
  2. dH보다 2 O. 10 %의 포름 알데히드의 고정 솔루션을 준비 예에서, 14.44 ml의 증류수 H 2 O DH (2 O)와 36 %의 주식 포름 알데히드 5.56 ml의 혼합.
    참고 : 사용하여 적절한 안전 취급 방법 및 환기 포름 알데히드를 사용하여.
  3. 크리스탈 바이올렛 염색을 준비 : 1 % 크리스탈 바이올렛 (CV) 20 % 에탄올 및 dH보다 2 O.
  4. 배 플라크 매체 (2 배 농도 의존성 세포 유형, 표 2 참조)를 준비한다. 모든 시약은 멸균하지 않은 경우 0.2 μm의 필터를 사용하는 필터.
  5. 고정화 오버레이의 준비 (표 3)
    1. 액체 오버레이를 들어, dH보다 2 O.에서 아비셀의 멸균 2.4 % 용액을 응집을 방지하기 위해, 토륨 물을 함유하는 플라스크에 분말을 추가급속 교반 막대와 혼합되어에서, 천천히 아비셀을 부어 실온 (RT)에서 빠르게 저어. 이 솔루션은 교반 막대가 균질화하기에 너무 점성 증명하면, 심지어 균질화을 보장하기 위해 무거운 교반> 30 분 동안 플라스크 셰이커로 전환합니다.
      NOTE : 스톡 솔루션은 낮은 농도로 제조 될 수 있지만, 용액은 분리 및 균질화를 위해 리믹스 될 필요가있을 것이다. 아비셀의 협력 솔루션은 0.6-3 %에 이르기까지 사용할 수 있습니다.
    2. 균질화 한 후, RT 밀봉 솔루션 및 저장을 압력솥.
    3. 아가로 오스 및 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC) 오버레이를 들어, dH보다 2 2 % CMC 0.6 % 아가로 오스의 O의 원액을 준비합니다. 솔루션으로 가져 교반 막대 및 오토 클레이브 또는 전자 레인지 섞는다.

2. 희석 및 감염

  1. 날은 도금 후, 시각적으로 분석을 시작하기 전에 세포의 포화 상태와 가능성을 확인합니다. 표준 셀룰러 형태의 확인차 ~ 90 % 컨 플루 언트 단일 층으로 존재한다.
  2. 전염성 샘플의 10 배 용액을 희석을 수행합니다. 희석제 (표 2)와 같은 바이러스 전파의 세포 성장 미디어를 사용합니다. 당해 바이러스의 역가 예상에 기초하여 필요한 희석 수를 다르지만 항상 독립적 플라크 식별의 세포 생존 및 지원을 보장하기 위해 감염되지 않은 대조군 샘플을 사용한다.
  3. 희석액에서 1 시간 (표 1)에 45 분 동안 세포를 감염. 가능한 낮은 부피를 유지하는 것은 단층 (표 4)으로 바이러스의 접촉을 최대화하면서, 셀을 커버하는 접종원의 충분한 양을 사용한다. 조심스럽게 바위 판은 매 20 분 범위를도 보장하고 건조로부터 세포 단일 층을 방지합니다.
  4. 배 플라크 매체 및 immobiliz 1 믹스 : 감염 후 1을 사용하여 웰 (표 2)에 직접 접종 매질을 고정의 적절한 용적을 오버레이선택의 오버레이를 보내고 (CMC, 아가로 오스 또는 아비셀). 부드럽게 섞어 바위.
    1. 0.6-1.2 % 아비셀 오버레이 매체의 작동 용액을 얻기 위해 2.4 % RT 스톡 아비셀 - 가온 배 플라크 매체 및 1.2 1 : 액체 오버레이를 들어, 하나 섞는다.
    2. 0.3의 최종 아가 / 오버레이 농도를 구하는 온도 평형을 30 분 동안 56 ° C의 수욕 중에서 가온 배 플라크 매체의 한 혼합물을 가열하여 0.6 % 아가로 오스의 원액, 장소 : 아가 오버레이를 들면, 1을 사용 %.
    3. CMC의 경우, 2 % 스톡 용액을 준비하고, 아가 로스 오버레이에 대해 기재된 바와 같이 치료.
    4. 단층에 오버레이를 적용 할 때, 항상 단일 층의 손상을 방지하기 위해 56 ° C의 물에 뜨거운 아가 로스 또는 CMC 평형화. 이 솔루션은 따뜻 확인하지만, 세포 사멸이 감소 바이러스 역가를 방지하기 위해 뜨거워 없습니다. 대부분의 아가로 오스 오버레이, 42 ° C 이하로 응고 시작 빠르게 작동 및 / 또는 처리하는 동안 응고를 방지하기 위해 작은 배치를 준비합니다.
  5. 오버레이 첨가 한 후, 명확하게 구별되어 가산 플라크를 생성하는 판을 배양한다. 플라크 형성은 바이러스에 따라 2-14일 분석되고 표 1를 취할 수 있습니다.
    참고 : 액체 중첩 된 플레이트가 인큐베이터에 배치되면, 그것들을 이동하지 마십시오. 배양 기간 동안 액체 오버레이의 움직임 번짐 플라크가 발생합니다. 아가로 오스와 CMC 오버레이 반고체하고 이동하거나 플라크 개발을 모니터링하는 광학 현미경 정기적으로 점검 할 수있다.

3. 고정 및 염색 세포

  1. 세포를 고정 부어 또는 아비셀 오버레이 대기음, 및 (6 웰 플레이트에 대해 <1 1 ㎖ 당 웰)을 밤새 30 분 동안 10 % 포름 알데히드 용액을 사용하여 세포를 고정한다.
    1. 아가로 오스 또는 CMC를 들어, 직접 1 시간 하룻밤에 대한 오버레이에 포름 알데히드 용액을 추가합니다.
      NOTE : 샘플이 고정액에 장시간 동안 유지 될 수는 구비하지증발이 단층을 왜곡 할 수있는 건조하지.
  2. 앞서 염색 및 고정 후, 포름 알데히드를 버리고 주걱으로 수동으로 물을 실행 중 하나와 아가로 오스와 CMC에 대한 반고체 플러그를 제거합니다. 염색하기 전에 잔류 오버레이 / 정착액을 제거하기 위해 물 아비셀 플라크를 씻어.
  3. 염색 들어, ~ 15 분 동안 크리스탈 바이올렛 용액 최소량 함께 셀을 커버. 락 플레이트 필요한 경우도 범위를 확인합니다.
  4. 조심스럽게 물 크리스탈 바이올렛 얼룩을 씻어. 일단, 고정 스테인드, 향후 분석을 위해 무기한 저장 플라크를 건조.

4. 바이러스 역가를 결정

  1. 같은 희석 기술적 반복 실험의 평균을 가지고, 각 웰에 플라크를 계산합니다. 큰 판 형식의 경우 100 패 5보다 적은 수의 이상과 할인 우물. 플라크의 크기와 형태에주의하십시오. 음성 대조군은 균일 한 단일 층을 가져야하고기준 대조군으로 사용할 수있다.
  2. 희석 및 총 희석 계수의 역수에 대한 플라크의 평균 수를 고려하여 재고 샘플의 바이러스 역가를 결정한다.

식 (1)

주 : 예를 들어, 30, 32 플라크는 1 × 10 -7 희석 [31 (평균) / 10-7 (희석) × 0.4 ㎖ (접종)] 7.75의 역가를 얻을 것 × 10 8 PFU의 반복 실험에 대한 계산 / ㎖.

Representative Results

정확하게 바이러스 역가를 평가하기 플라크 분석의 능력은 다양한 요소에 의존한다 : 적절한 숙주 세포의 선택, 적절한 미디어 세포 및 바이러스 생존력 성장 조건, 고정화 바이러스 전파 및 바이러스 잠복기의 정확한 결정이 별개의 충분한 시간을 허용하도록 그리고 셀 수있는 플라크 형성.

샘플 서로 다른 유형에서 오버레이 선택, 배양 기간, 플라크 형태 :이 연구를 위해 세 가지 대표적인 가정 바이러스의 차이를 설명하기 위해 선택되었다. 베네수엘라 말 뇌염 (VEEV)는 말의 종과 인간의 중요한 질병의 원인과 Togaviridae의 가족을 대표 할 수있는 (+) ssRNA 바이러스 성 모델로 선정되었다. 인플루엔자 B 대만 변형, 분할 (-) 주로 인간을 감염 ssRNA 바이러스는 오르 쏘 믹소 바이러스과 (orthomixoviridae)를 나타냅니다. 리프트 밸리 열 바이러스 (RVFV), (-) 주로 절지 동물을 감염 ssRNA의 절지 동물 탄생 바이러스,반추 동물과 인간은 Bunyaviridae 가족의 대표로 선정되었다.

RVFV (도 1)의 경우, 역가가 72 시간 감염 후의 대해 나란히 배양 하였다 CMC, 아가, 또는 아비셀 오버레이를 이용하여 12 웰 플레이트 형식 RVFV의 재조합 약독 MP12 균주의 스톡 용액으로부터 결정 하였다 (HPI). 에서 10-4 10-7까지 희석을 보여주는 대표적인 판은 CMC를 사용하여 패널 A. 플라크에서 볼 아가로 오스 오버레이는 잘 정의 된 원형 테두리, 작은 분명하고, 별개의 플라크를 보여 주었다 할 수있다. 액체 오버레이 플라크는 약간 더 풍부하고 CMC 플라크를 아가 로스와 비교하여 큰이었고, 덜 뚜렷한 경계를 제공했다. 바이러스 역가가 오버레이 모두가 동등하게 수행하여 패널 B에 비교 하​​였다.

reproduc을 결정하는 큰 샘플 크기와 함께 MP12위한 오버레이 중 명확한 시각적 비교를 얻기 위해서는ibility은 6 웰 플레이트는 세중 (그림 2)에서 상용화에 박차를 가하고 있었다. 6 웰 플레이트 포맷에서, CMC 오버레이의 사용은 서로의 크기는 차이가 없었다 아가 오버레이 또는 액체, 하나보다 작은 플라크를 보였다. 바이러스 역가가 세 오버레이 (패널 D)과 비슷하지만, 아가로 오스와 액체 오버레이에 형성된 플라크 인해 증가 된 크기를 계산하기 쉬웠다.

현저하게 변화 (그림 3A) 다른 오버레이 중 RVFV, VEEV 역가와 플라크 형태와는 달리. 플라크 크기 및 감도 (패널 B)의 비용으로, 12 웰 플레이트 포맷을 사용하는 경우 CMC 오버레이에 형성된 플라크는 선명하고 뚜렷한 형태를 보여 주었다. CMC는 대조적으로, 아가 로스 및 액체 오버레이 사용 VEEV 복제 저급 바이러스 억제 및 증가 된 감도를 나타내는 상당히 큰 플라크 결과. 만 AP에 CMC 대 아가로 오스를 비교할 때이 이전에 확인되었다조리개는 후아 레즈 등. 사에 의해 출판. 아가로 오스와 액체 오버레이 CMC보다 큰 플라크를 생성하는 동안, 플라크가 제대로 국경을 정의 가장 큰 국경 확산을 제공하는 액체 오버레이, 12 잘 형식으로 계산하기 어려운했다. 플라크는 6 웰 플레이트 (도 4)에서 상용화에 박차를 가하고 때, 큰 6 웰 포맷의 관점에서 CMC 오버레이 우수한 증명 아가 로스, 12 웰 형식으로 차별화하기 어려웠다 명백히 큰 플라크 및 액체 오버레이의 문제를 부정 플라크 정의와 민감하게 (그림 4D).

비교 RVFV 또는 외부 단백질 분해 효소의 요구 사항으로, plaquing 때 VEEV는, 인플루엔자는 몇 가지 독특한 도전을 제공합니다. 아가로 오스의 브랜드를 다른만큼 약간의 수정이 될 때 큰 변화가 언급 한 바와 같이 서로 다른 오버레이 선택에 인플루엔자 바이러스의 민감도는 물론 과거에 설명되어 있습니다EN 9를 사용했다.

흥미롭게도 인플루엔자 B 대만 균주, 오버레이로 CMC의 사용은 계산하기 어려운과 (그림 5A) 안정적으로 점수를 어려웠다 현저하게 작은 플라크를 초래. 아가 오버레이의 사용은 가장 플라크 (패널 C)를 제공하고, (증가 단층 생존에 가능성으로 인해) 더 어두운 배경 얼룩 결과, 액체 오버레이의 사용 (패널 B에 직접 비교 명확하고 선명 플라크를 보였다 ).

아가 로스와 CMC 고체 및 반고체 오버레이를 통해 액체 폴리머의 뚜렷한 장점은, 제거 및 응용 프로그램의 용이성에있다. 반고체 오버레이 난방을 필요로하며, 처리 및 제거 할 때 응고가 문제가 될 수 있습니다. 이러한 장점을 활용하고 RVFV위한 높은 처리량 방식 아비셀를 이용하는 실용성을 결정하기 위해, 96 웰 플레이트 형식은 다양한 오버레이 concentrati에서 상용화에 박차를 가하고시켰다기능 (그림 6). RVFV MP-12의 경우, 희석 아비셀 모두 0.6 및 1.2 %의 최종 농도에서 4 번씩 수행 하였다. 오버레이 응용 프로그램 및 제거 재현성의 높은 수준을 보여, 반복 실험 중 또는 언급 농도 사이의 명백한 차이, 간단한 증명했다. 득점 할 때, 플라크는 RVFV에 대한 높은 처리량 방식으로 액체 오버레이를 사용의 가능성을 보여주는, 육안으로 구별하고 셀 수 있었다.

그림 1
그림 1 :. 12 잘 접시를 활용 RVFV 플라크 오버레이 비교 Veros 12 웰 플레이트에 2.5 × 10 5 세포에서 도금과 MP12의 같은 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 200 μL에 감염되었다. 감염 0.3 % 아가로 오스를 1.5 ml의 오버레이, 아비셀 0.6 %, 또는 1 % CMC (최종 후 다패널 A. 플라크에서 증명 카운트와 패널 B에 titered 된대로 oncentrations), 직접 오버레이를 비교하기 위해 적용되었다.

그림 2
그림 2 :. 6 웰 플레이트를 활용 RVFV 플라크 오버레이 비교 Veros 6 웰 플레이트에 5 × 10 5 세포에서 도금과 MP12의 같은 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 400 μL에 감염되었다. 패널 AC 기술 한 바와 같이 패널에 입증 된 바와 같이 0.3 % 아가 로스 세 ml의 오버레이, 0.6 % 아비셀, 또는 1 % CMC가 직접 오버레이를 비교하기 위해 적용하고, B 및 C. 분리 실험과 동일하게 수행 하였다 플라크는 계산 및 패널 D (N = 3)에서 titered.

그림 3
그림 3 : <12 웰 플레이트를 활용 strong>을 VEEV 플라크 오버레이 비교. Veros 12 웰 플레이트에 2.5 × 10 5 세포에서 도금 VEEV TC-83 백신 균주의 같은 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 200 μL에 감염되었다. 패널 A. 플라크에서 입증 된 바와 같이 감염 후 0.3 % 아가로 오스를 1.5 ml의 오버레이, 아비셀 0.6 %, 또는 1 % CMC는, 패널 B.에서 카운트 하였다 titered 직접 오버레이를 비교하기 위하여 적용된

그림 4
그림 4. 6 웰 플레이트를 활용 V의 EEV 플라크 오버레이 비교 Veros 6 웰 플레이트에 5 × 10 5 세포에서 도금 400 μL가 VEEV TC-83의 동일한 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 감염되었다. 입증 된 바와 같이 감염 후 0.3 % 아가 로스 오버레이 3 ㎖, 0.6 % 아비셀, 또는 1 % CMC 직접 오버레이를 비교하기 위하여 적용된C를 카운트 패널 D에서 titered 플라크와, (N = 3) - 패널 기술 한 바와 같이 패널에, B와 C. 분리 실험을 동일하게 수행 하였다.

그림 5
그림 5 : 인플루엔자 플라크 오버레이 비교 MDCK 세포를 6 웰 플레이트에 5 × 10 5 세포에서 도금 및 인플루엔자 B 대만의 동일한 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 접종의 400 μL에 감염되었다.. FBS는 바이러스 성 융합에 필요한 특정 프로테아제 억제 통해 인플루엔자 전파를 억제 할 수 없음 소 태아 혈청 (FBS)이, 성장 배지 또는 오버레이에 사용되지 않았다. TPCK-트립신은 숙주 세포와 바이러스의 융합 및 진입을 용이하게하기 위해 이전에 애플리케이션 오버레이 모두에 첨가 하였다. 감염 후, 0.3 % 아가 로스 오버레이 3 ㎖, 0.6 % 아비셀, 또는 1 % CMC를 직접 비교하기 위해 적용된C, 패널 D에 카운트 titered 플라크와 (N = 3) - 패널에 기재된 바와 같이 패널 A, B 및 C. 별도 실험에서 입증 된 바와 같이 오버레이 동일하게 수행 하였다. 평균은 CMC 플라크 걸리는 동안 그들은 확산 테두리와 매우 작은 플라크 크기를 보여 그들이 안정적으로 계산하기 어려운 입증했다.

그림 6
그림 6 :. 높은 처리량 플라크 오버레이 Veros의 96 웰 플레이트에 4 번씩, 1 시간 동안 RVFV MP12 같은 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 접종 50 μL에 감염되었다, 잘 ​​당 3 × 10 4 세포에서 도금. 오버레이를 들어, 아비셀 0.6 및 1.2 %의 최종 농도는 높은 처리량으로, 패널 A 및 B에서 액체 오버레이의 이용 가능성 및 재현성을 결정하기 위해 상용화에 박차를 가하고 있었다.

RVFV VEEV 인플루엔자 B
셀 타입 베로 베로 MDCK
감염 기간 1 시간 1 시간 45 분
배양 시간 삼일 이일 삼일

표 1 : 플라크 분석 접종 조건 및 셀 유형

RVFV VEEV 인플루엔자 B
셀형 베로 베로 MDCK
성장 타입 DMEM 1 DMEM 1 DMEM 2
플라크 미디어 2xEMEM 2xEMEM 2xEMEM B

1. 둘 베코 변형 이글 보통 10 % 소 태아 혈청, 1 % L 글루타민, 1 % Penicllin / 스트렙토 마이신이 보충.
2. 둘 베코 변형 이글 보통 1 % L 글루타민, 1 % Penicllin / 스트렙토 마이신, 0.2 % 소 혈청 알부민, 0.025 % HEPES, DEAE 덱스 트란 50ug / ㎖로 보충.
5 % FBS (25 ㎖), 1 %의 최소 필수 아미노산 (5 ㎖), 1 % 나트륨 피루 베이트 (5 ㎖), 1 % L - 글루타민 (5 ml)로 보충 된 최소 필수 A. 배 미디어 (500 ㎖), 2 % 펜 / 스트렙토 (10 ㎖).
0.2 % 소 혈청 알부민, 1 %의 최소 필수 아미노산 (5 ㎖), 50ug / ㎖, 0.025 % HEPES, DEAE 덱스 트란, 트립신 TPCK 보충 된 최소 필수 B. 배 미디어 (500 ㎖) *
* 준비 직전에 25 당 1 μl를 추가나누어지는 2 μg의 TPCK - 트립신의 / ㎖ 주식 ml의 당신은 플라크에 아가와 함께 섞어 사용하는 것입니다.

표 2 : 상패 및 바이러스 / 세포 성장 MEDIAS

RVFV VEEV 인플루엔자 B
셀 타입 베로 베로 MDCK
감염 기간 1 시간 1 시간 45 분
배양 시간 삼일 이일 삼일

너무 오래 불임이 유지되는했을 때 오버레이 솔루션은 만료되지 않습니다.

표 3 : 오버레이 증권

6 잘 12도 96 웰
세포의 # /도 5 × 10 5 2.5 × 105 3 × 104
innoculum의 볼륨 (μL) (400) (200) (50)
오버레이의 양 (㎖) 3 1.5 0.100

표 4 : 플레이트 형식

Discussion

조건이 크게 다를 수 있음으로 성공적인 플라크 분석을위한 가장 중요한 요소는 문제의 특정 바이러스 성 문화에 대한 프로토콜의 최적화에있다. 고려해야 할 주요 포인트는 명확하게 플라크를 차별화하기 위해 문제의 바이러스, 적절한 바이러스 성 성장 조건, 충분한 희석 범위와 세포의 호환성을 개최하고, 문제의 세포와 바이러스에 대한 올바른 오버레이 선택 및 염색.

VEEV 및 RVFV 모두 동일한 숙주 세포 유형의 많은 이용 매우 유사한 조건 하에서 증가하는 동안, 플라크 형태학 및 성장 동역학의 차이는 상당히 다를. 전통적으로 출혈열 바이러스 및 alphaviruses에 대한 전파 및 표시 세포주로 사용 된 플라크 분석을위한 베로 세포를 사용하는 경우, VEEV는 일반적으로 RVFV보다 높은 역가에 성장하고 48 HPI 4에서 큰 균일 한 플라크를 개발, 복제 반응 속도를 증가하는 방법을 보여줍니다, 10-12. VEEV 달리 RVFV 72 HPI을 요구하고 전형적으로 훨씬 크기가 작고 가변적 플라크를 보여준다.

RVFV에 반대하고 VEEV에서​​, 인플루엔자 바이러스는 매우 숙주 세포 특정 조직 문화를 통해 전파하기가 어려울 수 있습니다. 인플루엔자 바이러스의 경우, 바이러스 진입과 융합은 일반적으로 숙주 세포의 α - 시알 산 표면 수용체와 결합을 통해 표적 세포에 진입을 매개 바이러스 당 단백질 hamagglutinin (HA)와 세포 표면 수용체의 결합에 의해 개시된다. HA는 모든 인플루엔자 바이러스의 막 봉투에 존재하고, 특정 숙주 세포 프로테아제에 의해 서브 유닛의 HA1과 HA2로 절단을 필요로 삼량 체 당 단백질이다. 더욱 문제를 복잡하게하려면 다음 절단 사이트는 종종 바이러스 균주 (13) 사이에 다를 수 있습니다. 특정 조직으로 제한됩니다 HA를 절단 할 수있는 단백질 분해 효소의 발현으로, AR을 프로테아제즉 종종 선택된 숙주 세포 (13)에 바이러스 융합 및 진입을 용이하게하기 위하여 세포 배양 배지에 첨가 하였다. 바이러스 HA 14,15의 단백질 분해 활성을 통해 (모든 트립신 불활 혈청의 부재하에) 다중 사이클 복제를 용이 : TPCK-트립신 MDCK와 베로 세포 모두의 세포 배양에 사용되는 일반적으로 사용되는 프로테아제의 일례이다.

이 연구와 다른 사람에서 알 수 있듯이, 바이러스 라이프 사이클의 차이는 서로 다른 클래스와 바이러스 종에 상당한 차이와 오버레이 선택, 판 형식 및 수집 시간을, 영향을 미칠 수있다. 우리의 연구에서, 아가로 오스 오버레이 바이러스 및 세포 유형의 넓은 범위 사이에서의 유틸리티를 강화, CMC 또는 RVFV 및 인플루엔자 B 바이러스 모두에 대해 액체 오버레이 중보다 높은 역가에서 명확 플라크를 보여 주었다. 크게 고체 플러그와 간단한 얼룩 제거에 도움을 아가로 오스의 낮은 최종 농도를 사용. CMC는 전체 페이지를 보여인플루엔자 B 바이러스에 대한 세 가지 시험 바이러스 및 생산 매우 작고 뚜렷하지 플라크의 오버레이로서 oorest 효능. 전체적인 CMC가 가장 바람직하지 않은 특성을 입증하지만, 빠르게 성장하고 역가 단지 최소한 감소에 플라크 크기를 줄이기 위해 나타나는처럼 매우 독성 바이러스, 유리한 증명할 수에서의 사용. 액체 오버레이는 사용의 용이성을 증가 준비하는 매우 간단했다는 점에서 가장 다양한 것으로 판명하고, 선택한 바이러스 모두에 걸쳐 아가 로스에 비교했다. 더 높은 처리량을 96 웰 플레이트 형식, 응용 프로그램 및 제거에서 기존의 오버레이로 응고로 인해 억제하고, 정확하고 일관된 결과를 제공하지 않았습니다. 플레이트가 이전에 특징 복제 반응 속도와 바이러스로이 적응을 제한, 수집 지점까지 이동할 수 없습니다로 액체 오버레이를 사용하는 고려 사항은 불투명 한 색상과 플라크 형성을 모니터링 할 수 없음에있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 658 160
12-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 665 180
96-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 655 180
96-2ml deep well plate USA Scientific C15046314 For serial dilutions
DMEM Quality Biologicals 112 013 101 Cell Media/Diluent
2x EMEM for plaques Quality Biologicals 115 073 101 Warm to 37 °C
MEM 100x  Cellgro 25 025 Cl
Sodium Pyruvate  Cellgro 25 000 Cl
Penicillin Streptomycin Gibco 15140 122
L-Glutamine Gibco 25030 081
HyClone FBS  Thermo Scientific SH30910.03 Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min
Bovine Serum Albumin Sigma Aldritch A7030-50G
Trypsin TPCK Sigma Aldritch T1426-50mg Make aliquots/Avoid freeze thawing
HEPES  Gibco 15630-080
DEAE-Dextran Sigma Aldritch D9885-10G
Crystal Violet Sigma Aldritch C3886-25G
Formaldehyde Solution Sigma Aldritch F8775-500ml
Ethanol denatured Reagent Grade Sigma Aldritch 362808-1L
Avicel RC-591 NF FMC BioPolymer USA RC-591 NF Shake vigorously when reconsitiuting  for >30 min to homogenize
UltraPure Agarose  Invitrogen 16500-100
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity  Sigma Aldrich C4888

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References

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