Пористого кремния Микрочастицы для доставки миРНК терапии

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Доставка остается основной проблемой для терапевтического реализации малых интерферирующих РНК (миРНК). Этот протокол предусматривает использование многофункционального и биосовместимого доставки миРНК платформы, состоящей из аргинина и микрочастиц пористого кремния полиэтиленимина привитые.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shen, J., Wu, X., Lee, Y., Wolfram, J., Yang, Z., Mao, Z. W., Ferrari, M., Shen, H. Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics. J. Vis. Exp. (95), e52075, doi:10.3791/52075 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Малые интерферирующие РНК (киРНК) являются двухцепочечные молекулы РНК, которые могут подавлять экспрессию генов. В последние годы, siРНК, были разработаны в качестве нового поколения биопрепаратов, которые показывают терапевтический потенциал для будущего использования в клинической практике 1-5. Тем не менее, успешная реализация миРНК терапии остается значительной проблемой, из-за ухудшения нуклеазами, плохое внутриклеточного поглощения, низкой эффективности трансфекции и неэффективного освобождения из эндосом / лизосом 5. Многие из этих препятствий могут быть преодолены путем разработки платформ доставки, которые могут безопасно и эффективно доставки миРНК в пораженной ткани. По сравнению с вирусными перевозчиков, невирусные платформы обеспечивают ряд преимуществ, таких как безопасность, низкая стоимость и простота кроя. В частности, катионных наночастиц, таких как полимеры и липиды, которые оказались полезными для миРНК доставки 3.

Ранее мы разработали дисковидные DRмкг система доставки, называемый многоступенчатый вектор (MSV). Эта платформа основана на последовательных стадиях, в котором одно транспортное средство освобождается от другой. На первом этапе автомобиль микрочастиц изготовлены из биоразлагаемого пористого кремния (PSI), в то время как второй этап транспортные средства наночастицы, заполненные препаратов или контрастных агентов 6,7. Наночастицы, которые встроены в PSI материала, постепенно выпущен как деградирует Si 8. Преимущество использования Si частиц является то, что морфология и поверхностные характеристики могут быть легко адаптированы для достижения оптимального биораспределение и высвобождение лекарственного средства. В последнее время успешное использование MSV платформы для доставки миРНК липосом в опухолевую ткань была показана в яичника и рака молочной железы мыши модели 9, 10.

В этой работе мы изготовили универсальную систему доставки для миРНК на основе принципов в MSV платформы. Эффективность этой системы доставки ранее было показано намичисле различные Серна молекул 11. Система поликатион функционализованную пористый кремний (PCPS) перевозчик, состоящий из Пси привитого полиэтиленимином (PEI) и аргинина (Arg). PEI может помочь в формировании электростатических взаимодействий с миРНК, а Arg и PSI может служить, чтобы уменьшить токсичность PEI, как ранее организованы показы 11. Кроме того, присутствие PEI может помочь в внутриклеточного поглощения и эндосом побег, а микрочастицы пси включить защиту миРНК и замедленное высвобождение. Частицы PSI постепенно разрушаются в физиологических условиях, в результате чего в формировании Arg-PEI / миРНК наночастиц (рис 1), которые имеют ярко выраженный морфологию и узкое распределение по размерам 11. Для получения подробной информации об устойчивости системы PCPS / миРНК, пожалуйста, обратитесь к исследовании Shen и др., 11. Это PCPS платформа отличается от обычного MSV, начиная со второй наночастицы этап изначально не Пресент в носителе, но формируются с течением времени, как первой стадии носитель ухудшает 11, 12. миРНК загрузки эффективность, цитотоксичность и молчания генов эффективность системы лечащего врача была оценена в пробирке. Эффективность трансфекции измеряли с помощью миРНК против атаксии телеангиэктазии мутировал (ATM) онкоген, который участвует в репарации ДНК 10. Ранее подавление ATM, как было показано, чтобы уменьшить рост опухоли в модели рака молочной железы 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PCPS Получение частиц

  1. Окислите без функционализированных частиц пористого кремния в 30% -ном растворе перекиси водорода при 95 ° С в течение 2 ч. Aminate окисленные частицы в 2% (3- аминопропил) триэтоксисилана раствора в изопропиловом спирте в течение 2 дней при 65 ° С при осторожном перемешивании.
  2. Центрифуга раствор в течение 30 мин при 18800 х г и промыть частицы два раза в изопропиловом спирте и трижды в этаноле, с использованием ультразвука краткое приостановить осадок. Оставьте частиц в растворе этанола при выполнении шага 1,3 и 1,4.
  3. Добавить известный объем суспензии частиц (например, 10 мкл) в 10 мл изотонных разбавителем и подсчета частиц с помощью анализатора частиц подсчета, чтобы определить концентрацию частиц в маточном растворе.
  4. Активируйте кислотной группы L-аргинина (0,1 нмоль) с N - (3-диметиламинопропил) - -ethylcarbodiimide гидрохлорид N '(EDC, 0,1 нмоль) / N
  5. Кратко разрушать ультразвуком фондовый частиц раствор и добавить 1000000000 частиц в L-аргинина решения и оставить реакцию 18 ч при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
  6. Активировать первую группу аспарагиновой кислоты N - (трет-бутоксикарбонил) -L-аспарагиновой кислоты (Boc-Asp-OH, 1 нмоль) с EDC (0,1 нмоль) / NHS (0,1 нмоль) в 20 мл этанола в течение 4 ч при 4 ° С при осторожном перемешивании.
  7. Растворите 50 мг полиэтиленимин в 10 мл этанола и добавляют раствор к смеси Boc-Asp-OH. Пусть реакцию проводили в течение 24 ч при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
  8. Активация второй группы аспарагиновой кислоты в раствор Boc-Asp-OH / PEI с EDC (0,1 нмоль) / NHS (0,1 нмоль) при 4 ° С в течение 6 ч при осторожном перемешивании.
  9. Чтобы получить PCPS частицы, добавляют раствор частиц с шага 1,5 в раствор Вос-Asp-OH / PEI с шагом 1,8. Оставляют реакционную протекать в течение 18 ч при комнатной температуре при осторожном ст irring.
  10. Центрифуга раствор в течение 30 мин при 18800 х г и мыть раствора частицы три раза с этанолом, с использованием ультразвука краткое приостановить осадок.

2. PCPS частиц Характеристика

  1. Измерение размера частиц с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM).
    1. Поместите каплю суспензии частиц (10000 частиц / мкл в этаноле) на чистой двуокиси кремния SEM образца заглушки и дайте высохнуть при комнатной температуре под вакуумом.
    2. Измерьте SEM изображения на 8 кВ с 3-5 мм рабочее расстояние с использованием детектора в-линзы.
  2. Измерение дзета-потенциал частиц с использованием системы анализатора частиц.
    1. Смешайте 10 мкл суспензии частиц (10000 частиц / мкл) в этаноле с 1 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4).
    2. Загрузите образец в сложенных клеток капилляров и измерения дзета-потенциала в соответствии с инструкциями изготовителя.
ле "> 3. Загрузка миРНК в PCPS частиц

  1. Высушите частицы PCPS (от стадии подготовки PCPS частиц 1,9) в вакууме O / N.
  2. Добавить Серна (4 мкг) в нуклеазы без воды (20 мкл) в высушенных частиц PCPS и соникатные кратко. Используйте следующую частицу отношений миРНК: 2 × 10 5 частиц / 0,2 мкг миРНК, 4 × 10 5 частиц / 0,2 мкг киРНК, 6 × 10 5 частиц / 0,2 мкг миРНК, 8 × 10 5 частиц / 0,2 мкг киРНК, 10 × 10 5 частиц / 0,2 мкг миРНК и 12 × 10 5 частиц / 0,2 мкг киРНК.
  3. Инкубируют в течение 3 часов при 4 ° С на качалке (1000 оборотов в минуту), чтобы обеспечить св зывание с миРНК частиц.

4. Оптимизация соотношения частиц миРНК / PCPS

  1. Добавить погрузки ДНК красителя 20 мкл PCPS / контроля частиц миРНК с другой частицей соотношениях миРНК (см загрузку миРНК в PCPS частиц).
  2. Загрузите СэмPles в 2% агарозном геле, содержащем ДНК из геля пятно.
  3. Выполнение электрофореза при постоянном напряжении 120 В в течение 20 мин в проточной буфера.
  4. Анализ гель с приобретением изображения и программного обеспечения для анализа.

5. Выпуск миРНК от лечащего врача частиц

  1. Смешайте 20 мкл PCPS / контроля частиц миРНК с другой частицы к миРНК отношений (см шаг 3) в додецилсульфата натрия (SDS, 2%) и дать постоять в течение 1 ч при комнатной температуре.
  2. Добавить загрузки ДНК краситель для образцов.
  3. Образцы груз в 2% агарозном геле, содержащем ДНК из геля пятно.
  4. Выполнение электрофореза при постоянном напряжении 120 В в течение 20 мин в проточной буфера с использованием ДНК-электрофореза и источник питания.
  5. Анализ гель с приобретением изображения и программного обеспечения для анализа.

6. конфокальной микроскопии из PCPS частиц

  1. Добавить 5 мкл PCPS / люминесцентных частиц миРНК управления (10 × 10 5 частиц / 0.2 мкг миРНК / 20 мкл) с покровным стеклом.
  2. Визуализация слоев частиц с помощью конфокальной микроскопии.

7. Характеристика Arg-PEI / управления миРНК наночастиц

  1. Для ухудшить кремния материал и образуют Arg-PEI наночастиц / управления миРНК, добавить PCPS / миРНК частицы (10 × 10 6 частиц лечащего врача / 2 мкг миРНК) к 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером и встряхивают (1000 оборотов в минуту) при 37 ° С в течение 2 дней.
  2. Центрифуга образца в течение 30 мин при 18800 х г и собирать надосадочную жидкость.
  3. Измерить размер образующихся Arg-ПЭИ / миРНК наночастиц с динамического светорассеяния (DLS).
    1. Смешайте 10 мкл супернатанта с 1 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) и поместить в полиэтиленовый кювете.
    2. Измерьте размер частиц с использованием системы анализатора частиц в соответствии с инструкциями изготовителя.
  4. Определить размер и морфологию образующегося Arg / PEI-миРНКнаночастицы с атомно-силовой микроскопии.
    1. Взять 10 мкл супернатанта и места на кремниевой пластине.
    2. Визуализация частиц с атомно-силовой микроскопии (АСМ).

8. Культура клеток

  1. Культура MDA-MB-231 рака молочной железы человека клетки в клеточной культуральной среде, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина в 5% СО 2, 95% влажности и 37 ° C.

9. конфокальной микроскопии живых клеток с PCPS частиц

  1. Пластина клеток в культуре 2-а скользит при плотности посева от 3 ​​х 10 5 клеток / лунку в течение 24 ч.
  2. Добавить PCPS частицы, загруженные с флуоресцентной управления миРНК (10 × 10 5 частиц / 0,2 мкг частиц соотношение миРНК, 50 нМ миРНК) в клетки.
  3. Запишите кино клеток с конфокальной микроскопии (поставляется в комплекте с камерой, 5% СО 2, 95% влажности и 37 ° С) в течение 12 ч следующего выставке частицуверен.

10. конфокальной микроскопии фиксированных клеток с PCPS частиц

  1. Пластина клеток в культуре 2-а скользит при плотности посева от 3 ​​х 10 5 клеток / лунку в течение 24 ч.
  2. Добавить PCPS частицы, загруженные с флуоресцентной управления миРНК (10 × 10 5 частиц / 0,2 мкг частиц соотношение миРНК, 50 нМ миРНК) в клетки и инкубировать в течение 1 дня, 7 дней и 10 дней.
  3. Промыть клетки дважды фосфатно-буферным раствором, а затем закрепить их в 4% растворе параформальдегида в течение 10 мин.
  4. Промыть клеток фосфатно-буферным раствором.
  5. Клетки проницаемыми с 0,1% октил этоксилат фенола в течение 10 мин и затем промыть их три раза забуференным фосфатом солевым раствором.
  6. Блок клетки с альбумина из бычьей сыворотки (10 мг / мл) в фосфатном буферном солевом растворе в течение 10 мин при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
  7. Для визуализации фибриллярного актина, инкубировать клетки с флуоресцентно меченных фаллоидином (1 мкл / 40 мклблокирующим раствором) в течение 20 мин при комнатной температуре при осторожном перемешивании, а затем промыть в солевом растворе с фосфатным буфером.
  8. Удалить слайды из рамы и добавить antifade реагента с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для визуализации ядро.
  9. Добавить покровного стекла на вершине и получать изображения клеток с конфокальной микроскопии.

11. проточной цитометрии клеток с PCPS / люминесцентных управления миРНК частиц

  1. Пластина клеток в 6-луночный планшет при плотности высева 3 х 10 5 клеток / лунку в течение 24 часов.
  2. Добавить PCPS частиц, нагруженных флуоресцентные управления миРНК (10 × 10 5 частиц / 0,2 мкг частиц с отношением миРНК, 50 нМ миРНК) к клеткам и инкубируют в течение 24 ч.
  3. Промыть клеток фосфатно-буферным раствором и очистить их с клеточным скребком.
  4. Хранить клеток в забуференном фосфатом физиологическом растворе с 2% фетальной бычьей сыворотки до анализа. Использование необработанных клеток в качестве отрицательного контроля.
  5. Выполните потока CYtometry.

12. Жизнеспособность клеток с PCPS частиц и PCPS / контроля миРНК частиц

  1. Пластина клеток в 96-луночный планшет с при плотности клеток 3 × 10 3 клеток / лунку в течение 24 ч.
  2. Лечить клеток с PCPS частиц (1,5 × 10 5 / лунку и 6 × 10 5 / лунку) или частицы миРНК PCPS / управления (10 × 10 5 частиц / 0,2 мкг частиц соотношение миРНК, 10 нм и 100 нм миРНК) в течение 48 ч и 72 ч. Использование необработанные клетки и клетки, обработанные с фосфатным буферным раствором (того же объема, что и добавленных частиц) в качестве контрольной группы. Пробирной каждый образец в трех экземплярах.
  3. Выполните анализ клеточной пролиферации в соответствии с инструкциями изготовителя.
  4. Представление данных в виде среднего ± стандартное отклонение.

13. Вестерн-блот клеток с PCPS / ATM мутировал миРНК частиц

  1. Пластина клеток в 6-луночного планшета при плотности клеток 2 × 10 5 клеток / жELL в течение 24 часов.
  2. Инкубируйте клетки с PCPS / управления миРНК (50 нМ) частиц или лечащего врача / ATM миРНК (50 нм) частиц в течение 72 часов. Использование необработанных клеток в качестве контроля.
  3. Лизиса клеток с использованием реагента экстракции белка с добавлением ингибитора протеазы коктейль.
  4. Центрифуга клеточных лизатов в течение 10 мин при 14000 х г и извлечения супернатанта.
  5. Определить концентрацию белка с белком количественного анализа в соответствии с инструкциями изготовителя.
  6. Добавить загрузки образца буфера (5 мкл 2-меркаптоэтанола / мл буфера) к образцам и нагревают их в течение 6 мин при 99 ° С.
  7. Загрузка образцов белка (20 мкг / мл) в 12% SDS-полиакриламидном геле в рабочем буфере и выполнять электрофореза в полиакриламидном геле (1 ч, 120 В) с помощью электрофореза и источник питания.
  8. Передача гель в буфере передачи (с 20% метанола) на нитроцеллюлозную мембрану (1 ч, 100 В) с помощью электрофореза иисточник питания.
  9. Блок мембрану с 5% сухого молока в течение 1 часа.
  10. Выдержите мембрану с первичными антителами ATM (от кролика) в блокировании решения (начиная с шага 13,9) в соотношении 1: 1000 разбавления O / N.
  11. Промыть мембраны с фосфатным буферным раствором, содержащим 0,1% полиэтиленгликоль монолаурат сорбитана, а затем инкубируют его с вторичным антителом (анти-кроличий) в блокирующем растворе (из стадии 13,9) при разведении 1: 2500 в течение 1 часа.
  12. Промыть мембраны с фосфатным буферным раствором, содержащим 0,1% полиэтиленгликоль монолаурат сорбитана и обнаружения полос белка с Вестерн-блот-реагента обнаружения с помощью захвата изображения и программное обеспечение для анализа.
  13. Для контроля загрузки, мыть мембрану и повторите шаги 13.9-13.12 помощью β-актина первичного антитела (от мышей, 1: 10000 разбавления) и вторичного антитела (анти-мышь 1: 4000 разведение).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол описывает использование невирусной системы доставки для безопасного и эффективного миРНК трансфекции. Результаты СЭМ показывают, что частицы лечащего врача имеют цилиндрическую форму и имеют диаметр 2,6 мкм (фиг.2А). Частицы положительно заряженный с дзета-потенциал приблизительно 8,21 (фиг.2В), тем самым позволяя электростатического связывания с отрицательно заряженными нуклеотидов. Конфокальных изображений различных слоев частиц лечащего врача, показывают, что флуоресцентный контроль миРНК загружен внутри пористых частиц кремния (фиг.2с). Формирование и выпуск Arg-PEI / миРНК наночастиц из частиц PSI была подтверждена DLS и АСМ. Распределение размера частиц в диапазоне от 70-120 нм, со средним размером 94 нм (фиг 2D). АСМ изображения показывают, что наночастицы имеют сферическую форму (фиг 2E).

РатиO частиц в миРНК был оптимизирован с помощью электрофореза в агарозном геле, чтобы обеспечить высокую аффинность связывания (фиг.3А). Широкий спектр частицы с коэффициентами миРНК был использован (2 × 10 5, 4 × 10 5, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 5 и 12 × 10 5 /0.2 мкг миРНК). Результаты показывают, что миРНК может связываться плотно частиц, когда количество частиц выше 8 × 10 5. Соотношении 10 × 10 5 лечащего врача / 0,2 мкг миРНК был выбран для дальнейших экспериментов. Кроме того, миРНК был успешно освобожден от носителя при обработке ДСН, как показано на фиг.3В.

Далее, подвал интернализации люминесцентных частиц миРНК управления лечащего врача / оценивалась в MDA-MB-231 клеток. Конфокальные снимки, сделанные после 24 часов лечения, показывают, что частицы эффективно усваивается клетками (рис 4 фиг.5 показывает, что 89% клеток были усвоены лечащего врача / миРНК частицы после 24 ч инкубации. Кроме того, процесс интернализации был записан в течение 12 ч (видео 1). Эти результаты показывают, что частицы лечащего врача может эффективно доставлять в клетки миРНК. Долгосрочное накопление миРНК внутрь клеток также была оценена с помощью конфокальной микроскопии. В 7-й день и 10 день миРНК был еще обнаруживается внутри клеток (рисунок 6).

Одним из наиболее важных факторов, которые следует учитывать при разработке системы доставки миРНК является безопасность носителя 13. PEI, как известно, образуют polyplexes с миРНК, помощь в клеточного поглощения и выпуска триггер эндосом / лизосом. Тем не менее, PEI может оказывать токсическое действие, благодаря наличию положительно заряженных первичных аминогрупп в основной цепи 14,15. Например, ПЭИ связывания с гликокаликса на поверхности клетки может привести к FOия больших кластеров 16. Чтобы устранить эту заряда, вызванного токсичностью, PEI был ковалентно конъюгированный с аргинина через линкер моста, чтобы уменьшить количество первичных аминогрупп. Жизнеспособность клеток оставались более 95% после 48 ч и 72 ч, когда частицы и миРНК были использованы в концентрации до 6 × 10 5 / лунку и 100 нМ соответственно (7А). Далее, трансфекции эффективность киРНК против онкогена ATM была оценена в MDA-MB-231 клеток. Западные результаты блот показывают, что уровни белка банкоматов уменьшается после лечения с PCPS / ATM миРНК (7В). Полученные результаты свидетельствуют о платформе PCPS является безопасным и эффективную систему доставки для миРНК.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое представление пористого кремния (PCPS) частиц поликатиона функционализованную. сильный> аргинин (Arg) -polyethylenimine (PEI) / Малые интерферирующие РНК (киРНК) наночастицы образуются после деградации кремния (Si).

Фиг.2
Рисунок 2. Характеристика PCPS частиц. (А) сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) изображение PCPS частиц. (В) Зета потенциал PCPS частиц. (C) Конфокальные изображения различных слоев частиц управления миРНК PCPS / люминесцентные. Распределение (D) Размер аргинина Arg-пей / контроля миРНК наночастиц, освобожденных из микрочастиц пористого кремния. (E) Атомно-силовая микроскопия (АСМ) изображения Arg-PEI / контроля миРНК наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

ve_content "FO: Keep-together.within-страницу =" всегда "> Рисунок 3
Рисунок 3. агарозном геле с целью оптимизации системы доставки PCPS / миРНК. (А) аффинность связывания между частицами лечащего врача и контролировать миРНК. Полосы представляют несвязанного Серна. (В) миРНК выпуск после инкубации с 2% SDS в течение 1 часа. Полосы представляют собой общее Серна (несвязанного и связанного). Пример 1: миРНК; образец 2: 2 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг миРНК; Примеры 3: 4 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг миРНК; Примеры 4: 6 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг миРНК; Образец 5: 8 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг миРНК; Образец 6: 10 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг миРНК; Примеры 7: 12 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг киРНК.

75 / 52075fig4.jpg "/>
Рисунок 4. конфокальной микроскопии изображения PCPS / люминесцентных частиц миРНК (красный) MDA-MB-231 клеток (24 ч инкубации). Ядро и фибриллярного актина визуализировали с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, голубой ) и фаллоидином (зеленый), соответственно. Три различные слои были обследованы (верхняя, средняя и базальной). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Количественный анализ проточной цитометрии флуоресцентных MDA-MB-231 клетки после инкубации с PCPS / контрольных частиц флуоресцентного миРНК. Необработанные клетки использовали в качестве отрицательного контроля. 89% клеток были усвоены частиц.

igure 6 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52075 / 52075fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Конфокальные изображения люминесцентные управления миРНК (красный) внутри MDA-MB-231 клеток. Клетки инкубировали с PCPS / люминесцентных частиц контроля миРНК на 1 день, 7 дней и 10 дней. Затем клетки визуализировали с конфокальной микроскопии. Ядро и фибриллярного актина визуализировали с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, голубой) и фаллоидином (зеленый), соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Жизнеспособность клеток и генной глушителей в пробирке. () Жизнеспособность анализ клеток инкубировали с PCPS частиц и PCPS / контроль миРНК частиц (SCR). Эксперимент проводили в поездкисиликатное, и результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Необработанные клетки (пробел) и клетки инкубировали с PBS использовали в качестве контролей. (B) Вестерн-блот из PCPS / атаксия телеангиэктазия мутировал (ATM) миРНК частицы. Клетки подвергали воздействию PCPS / контроля миРНК (SCR) частиц и PCPS / ATM миРНК частиц. Необработанные клетки (макет) были использованы в качестве контроля. β-актина использовали в качестве контроля нагрузки.

Видео 1 . Время-зависимое поглощение лечащего врача / люминесцентных частиц контроля миРНК в живых MDA-MB-231 клеток. видео было записано в течение 12 ч после экспозиции клеток с частицами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описан способ успешной доставки и трансфекции в клетки миРНК. В частности, доставки миРНК достигается с помощью многофункционального платформу, состоящую из поликатиона функциональными частиц PSI. Использование миРНК терапии имеет большой потенциал, например, лечение рака, как и различные онкогены могут быть направлены с высокой специфичностью. Таким образом, существует потребность в разработке средств доставки миРНК, которые могут смягчить проблемы миРНК терапии. В заключение, мы наметили протокол, который показывает перспективы для безопасного и эффективного предоставления миРНК. Тем не менее, есть некоторые ключевые факторы, которые должны быть приняты во внимание при выполнении описанной методики. Например, важным фактором при получении частиц лечащего врача, чтобы справиться с миРНК тщательно, чтобы избежать деградации нуклеазами. В частности, чистые перчатки и РНКазы трубы и вода должна быть использована в любой момент времени при работе смиРНК. Если трансфекции миРНК эффективность низка, спрей, который удаляет загрязнения РНКазы может быть использован для распыления перчатки и рабочие зоны. Кроме того, если трансфекции была неудачной, миРНК должны быть испытаны с коммерческой реагента для трансфекции, чтобы определить, является ли проблема вызвана миРНК или частиц. Еще одним важным фактором для успешной реализации PCPS / миРНК системы доставки, чтобы заботиться при выполнении центрифугирования и стиральные шаги. А именно, супернатант должен быть полностью отброшены, чтобы удалить избыток реагентов, которые необходимы во всех стадий получения частиц.

Важным преимуществом системы PCPS / доставки миРНК является безопасность. Несколько миРНК трансфекции агенты имеют высокую катионный заряд, что способствует клеточной токсичности 13,15. В самом деле, большинство коммерческих протоколов, показывают, что реагенты должны быть инкубировали с клетками в течение всего лишь нескольких часов, чтобы избежать гибели клеток. Напротив, CEзаполняет могут подвергаться воздействию частиц лечащего врача в течение нескольких дней без каких-либо признаков токсичности, как это видно из результатов жизнеспособности клеток. Частицы лечащего врача может связываться миРНК с высоким сродством из-за присутствия ПЭИ. Однако заряд индуцированный токсичность PEI предотвращается уникальной настройки доставки платформы. Особенно ковалентного связывания Arg к PEI и инкапсуляции PEI внутри Si поры способствовать уменьшению токсичности. Другим преимуществом PCPS платформы является то, что миРНК трансфекции может происходить в присутствии сыворотки. Другие существующие методы, как правило, требуют использования бессывороточной среде для культивирования клеток, таким образом, добавление дополнительных шагов в процессе трансфекции и потенциально мешать обычных сигнальных путей клетки.

Дополнительным преимуществом системы PCPS является то, что он не требует какой-либо модификации молекул миРНК. В то время как некоторые современные методы требуют выполнения сложных шагов сопряжения для стабилизации Серна или позволяют Cellular интернализация 13, система PCPS опирается на простого смешивания для миРНК нагрузки. Связывание с PEI и поры в материале Si обеспечить защитную среду для миРНК, тем самым уменьшая контакт с нуклеаз. Частицы лечащего врача можно хранить в течение длительных периодов времени, как высушенного материала или в изопропиловом спирте. Кроме того, если частицы PCPS / миРНК лиофилизируют они могут храниться в течение не менее трех месяцев при 4 ° С. Лиофилизированные частицы лечащего врача должно быть приостановлено в РНКазы свободной воды непосредственно перед трансфекцией, и не должны быть сохранены в растворе. И, наконец, разрешение на PCPS платформы замедленное высвобождение миРНК, как сообщалось ранее 11, следовательно, увеличение временного периода, в котором генов-мишеней остаются подавлено. Соответственно, после того, как клеточной интернализации, частицы Si, постепенно деградируют, что приводит к образованию наночастиц Arg-ПЭИ / миРНК. Впоследствии, миРНК медленно высвобождается в цитоплазму, где он может связываться с MesseNger РНК (мРНК), тем самым оказывая биологическую активность. Хотя, лечащие врачи частицы обеспечивают несколько преимуществ по сравнению с существующими методами доставки миРНК, ограничение техники является то, что микрочастицы, не являющиеся функциональными PSI требуется в качестве исходного материала. В то время как частицы могут быть синтезированы с использованием фотолитографии и электрохимического травления 17, эти методы не являются легкодоступными во всех учреждениях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich 408727 Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006 Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH Sigma-Aldrich 408-468 99%
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763 30 wt. % in H2O
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 339741 100.00%
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 ≥99.7%
Ethanol Sigma-Aldrich 459844 ≥99.5% 
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma-Aldrich 03449 ≥99%
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A7030-10G Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA  Sigma-Aldrich Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T9650 For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379 Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 For Western blot
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 For making phosphate buffer 
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 71640 For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG Sigma-Aldrich A4416 Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672 98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid Greiner Bio-One 655182 96-well plate
10x Tris-Glycine Liquid Li-Cor  928-40010 Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS  Santa Cruz Sc-281692 Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G5421 Proliferation assay
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP399-500 10x Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) Fisher Scientific  MT-15-017-CM Cell culture media, 1x solution
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass Fisher Scientific 12-530C 
Methanol Fisher Scientific  A412-1 For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes Fisher Scientific  14-377-010  For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant Fisher Scientific 14-754-34 Spray for removing RNAse contamination
Agarose Fisher Scientific BP165-25 Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI  Invitrogen P36935 Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379 Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102 Visualization of RNA
Negative Control siRNA Qiagen 1022076 Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555 Qiagen 1027294 Fluorescent control siRNA
Cell scraper Celltreat 229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates Thermo Scientific 130184 6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) Thermo Scientific 84788 Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) Thermo Scientific 78430 Protease inhibitor cocktail, use at 1x
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific  78501 Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R Thermo Scientific 75002440 Centrifuge
Beta Actin Antibody  Thermo Scientific  MA1-91399 β-actin primary antibody (from mouse) for western blot
6x TriTrack DNA Loading Dye Thermo Scientific R1161 DNA loading dye
Nuclease-Free Water  Life Technologies AM9938
Non-Fat Dry Milk Lab Scientific M0841 For Western blot
2-well BD Falcon culture slides  BD Biosciences 354102 2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent GE Healthcare Life Sciences RPN2106 Western blot detection reagent
BA Membranes GE Healthcare Life Sciences 10402096 Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb Cell Signaling 2873S ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling  7074 Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot 
Folded capillary cells Malvern  DTS 1061 For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line ATCC HTB-26 Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-rad 456-1043  For Western blot
Biorad PowerPac HC Bio-rad 164-5052 Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-rad 161-0732 Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell Bio-rad 170-4405 Electrophoresis equipment for DNA agarose gel 
Mini-PROTEAN Tetra cell Bio-rad 165-8000 Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software Bio-rad 170-8265 Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer Ted Pella  16007 Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R Eppendorf 22670107 Shaker 
Isoton II diluent Beckman Coulter 8546719 Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076 Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles  Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS Malvern Particle analyzer system for size and zeta potential 
Scanning Electron Microscope FEI Particle size and shape 
Atomic Force Microscope Bruker Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope Olympus Visualization of fixed and live cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6, (6), 443-453 (2007).
  2. Rolland, A. Gene medicines: the end of the beginning. Adv Drug Deliv Rev. 57, (5), 669-673 (2005).
  3. Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61, (10), 850-862 (2009).
  4. Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109, (2), 259-302 (2009).
  5. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 129-138 (2009).
  6. Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141, (3), 320-327 (2010).
  7. Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29, (3), 377-384 (2008).
  8. Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102, (10), 3540-3549 (2014).
  9. Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19, (7), 1806-1815 (2013).
  10. Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9, (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
  11. Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7, (11), 9867-9880 (2013).
  12. Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35, (1), 423-431 (2014).
  13. Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267, (1), 44-53 (2010).
  14. Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19, (7), 1448-1455 (2008).
  15. Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58, (14), 1523-1531 (2006).
  16. Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212, (3), 223-231 (1985).
  17. Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5, (11), 815-821 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics