Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue. J. Vis. Exp. (97), e52076, doi:10.3791/52076 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Las células vivas banco de energía metabólica en forma de grasas e hidratos de carbono y el uso de esta energía para la biosíntesis, transporte de membrana y el movimiento. Parte de la energía se obtiene en el citosol a través de la conversión de los azúcares de la dieta directamente en ATP durante la glucólisis. Sin embargo, la principal fuente de producción de ATP en una célula es aprovechada dentro de la mitocondria a través de la cadena respiratoria mitocondrial 1. La arquitectura de las mitocondrias proporciona la orientación espacial necesaria para la producción de ATP eficaz y eficiente. Las mitocondrias poseen una doble membrana separadas por un espacio intermembrana y junto con la matriz, el compartimento mitocondrial más interior, la casa de los componentes y coordinar las reacciones químicas implicadas en la generación de ATP. La membrana interna contiene una serie de complejos de proteínas unidas a la membrana que comprenden la cadena respiratoria así como la ATP sintasa, el complejo de proteína que trae ADP y Pi juntos para la formación de ATP. La posadamembrana del ER se dobla en crestas y los electrones se pasan a lo largo de los complejos de la cadena respiratoria por medio del citocromo c, un portador de electrones soluble que se mueve entre los complejos dentro del espacio intermembrana. Como los electrones se mueven, la oxidación de equivalentes reductores se produce y los iones de hidrógeno se bombea desde la matriz al espacio intermembrana. Como consecuencia de la alta concentración de iones dentro del espacio intermembrana, un gradiente electroquímico construye lo que resulta en un potencial de membrana a través de la membrana mitocondrial interna (Δψ) 2. El oxígeno es el aceptor final de electrones de la cadena de transporte de electrones y iones de hidrógeno fluya a través de las ATP sintasas desde el espacio intermembrana de nuevo a la matriz, y al hacerlo directamente causar la formación de ATP. Este proceso tal como se describe en su totalidad se conoce como la fosforilación oxidativa. Los pliegues de las crestas aumentan el área de superficie de la membrana interna, lo que permite el transporte de electrones máxima y la producción de ATP dentro decada mitocondria. Las proteínas, enzimas y otras moléculas implicadas en la fosforilación oxidativa se derivan de ambos genes nucleares y mitocondriales. Las mitocondrias contienen su propio ADN circular, que codifica para 13 proteínas así como ARNt y ARNm necesarias para la producción de ATP 3. Sin embargo, se requieren muchas más proteínas y por lo tanto son nuclear codificada. La mayoría de estas proteínas codificadas en el núcleo están dirigidos a la matriz mitocondrial mediante el uso de presecuencias en el extremo N-terminal de la proteína precursora, y su importación es impulsado en parte por Δψ 4,5.

Más allá de contribuir a la bioenergética de una célula, las mitocondrias también influyen en importantes procesos metabólicos tales como TCA y beta-oxidación, la señalización celular a través de la regulación de calcio, así como un papel clave en la apoptosis 6. En concreto, durante los momentos de estrés celular, las proteínas Bcl-2 la familia que residen en o interactúan en la membrana externa mitocondrial puede causar mitocondrialpermeabilidad de la membrana exterior (MOMP) 7,8. Durante MOMP, el citocromo c y otras proteínas se liberan en el citosol, y junto con varias proteínas citosólicas forman un complejo llamado el apoptosome 9,10. El apoptosome activa las caspasas que van a escindir las proteínas celulares y el ADN durante la fase de ejecución de la apoptosis. Tan pronto como se produce MOMP, ΔΨ se derrumbó y la producción de ATP se detuvo. Por lo tanto la función mitocondrial, como apoptosis se inicia se ve comprometida y los cambios en ΔΨ puede ser correlacionada con la salud mitocondrial y celular 12. Mientras que la apoptosis es un punto final en muchos modelos de la enfermedad, la función mitocondrial y cambios a ΔΨ también puede proporcionar información valiosa acerca de originación y / o progresión de la enfermedad. Por ejemplo, los cambios estructurales y funcionales mitocondriales se han documentado durante el curso de enfermedades neurodegenerativas 13,14.

En la primera parte del protocolo, isomento de las mitocondrias intactas que conservan su ΔΨ se describe. Células HEK-293T fueron expuestas a diferentes concentraciones y combinaciones de TNF-α recombinante, IL1-β e IFN-γ para inducir apoptosis. Estas citoquinas fueron elegidos porque son frecuentes a ser alta en muestras sépticos humanos primarios 15 y la vía extrínseca de la apoptosis puede ser desencadenada por la interacción de unión a su receptor TNF-α 6. Puesto que hay variaciones sutiles necesarias para aislar las mitocondrias funcional a partir de tejidos primarios en comparación con células cultivadas, y porque mucha investigación utiliza animales, el protocolo también describe cómo aislar las mitocondrias a partir de hígado y médula espinal de antero esclerosis lateral (ALS) modelo de ratón.

La segunda parte del protocolo fue desarrollado para monitorear a las perturbaciones del potencial de membrana mitocondrial usando un colorante fluorescente sensible al potencial con un lector de placa fluorescente. Diferencias entre el estado celular (es decir, sanos vs. poco saludable) se diferencian por la cuantificación de la fuerza de ΔΨ de mitocondrias aisladas en conjunción con agentes de desacoplamiento, inhibidores de la cadena respiratoria, inhibidores de complejos y ionóforos, todos los cuales causan la disipación del potencial de membrana mitocondrial. El saludable las mitocondrias, mayor es el cambio en ΔΨ tras el tratamiento con inhibidores mitocondriales, por lo tanto, la respuesta de las mitocondrias se puede utilizar como un indicador de la función mitocondrial (dys).

El uso de mitocondrias aisladas en lugar de en la evaluación in situ de función ofrece evidencia definitiva de que una patología o tratamiento modula directamente los cambios en el orgánulo 16-18. Si bien existen métodos en la literatura para aislar las mitocondrias a partir de células cultivadas, que son vagos 17 y / o utilizan equipo especializado 16. Este protocolo describe en detalle el método de aislamiento y esfácilmente adaptable a otras líneas celulares, incluyendo el tejido primario y culturas 13,14,19,20. Muchos estudios mitocondrias aisladas utilizan los mismos desacopladores e inhibidores mitocondriales utilizados en este protocolo, pero con un electrodo de Clark (figura 21 es un ejemplo representativo de muchos trabajos en la literatura), que a su vez es una pieza muy específica y especializada de los equipos. Además, este método tradicional tiene limitaciones tales como un bajo rendimiento y alta complejidad 22,23 y requiere una cantidad sustancial de las mitocondrias (~ 500 g / reacción). En este protocolo, el fluorescente potencial de membrana TMRE sonda de detección se utiliza en conjunción con un lector de placas fluorescente, que es una máquina estándar en muchos laboratorios. TMRE es ampliamente considerado ya que rápidamente entra en las células y las mitocondrias aisladas y se puede utilizar en concentraciones bajas 24. Múltiples reacciones rápidamente se pueden configurar en tándem y lotes analizados mediante este protocolo. Además, la reacción des requieren una pequeña cantidad mucho de las mitocondrias aisladas (~ 10 g / reacción). Al requerir menos material, muestras de tejido o cultivo de células más pequeñas se pueden utilizar como punto de partida para el aislamiento de las mitocondrias, más repeticiones o reacciones se pueden configurar, y material potencialmente suficiente para otros experimentos mitocondrias aisladas, tales como la producción de ATP, el consumo de oxígeno, o la importación ensayos son posibles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los experimentos con animales se ajustaban a los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por la Universidad de Wake Forest Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Las parejas reproductoras para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de ratón se obtuvieron de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). De tipo salvaje (WT) hembras y machos SOD1G93A no transgénicos [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fueron criados para generar ratones SOD1G93A y WT littermates no transgénicos que fueron utilizados en los experimentos.

1. Modelos de Investigación

  1. Cultivo celular
    1. Mantener las células de riñón embrionario humano (HEK-T293) células en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado térmicamente, 1% de penicilina-estreptomicina, y 1% de L-glutamina, a 37 ° C en 5% de CO 2.
    2. Se cultivan las células en frascos T75 y deje que alcancen el 90% de confluencia.
    3. Llevar a cabo la división celular a través de tripsinización (0.25% de tripsina-EDTA) durante 3-5 min a 37 ° C en 5% de CO 2
    4. Aspirar los medios de comunicación y volver a suspender el sedimento celular en medio de cultivo.
    5. Células de semillas en el frasco o placa apropiada 7 x 10 4 células en un frasco T75 48 horas antes de citoquinas tratamiento. Esto debería dar ~ 70% de la densidad en el momento del tratamiento.
    6. Células dejan a estos suero 24 horas más tarde mediante la aspiración de los medios de comunicación y su sustitución por el mismo volumen de medio libre de suero (DMEM, estéril).
    7. Preparar el TNF-α, IL1-β e IFN-γ, desde polvo liofilizado con agua ultra pura en concentraciones de trabajo de 5 pg / l, 10 ng / l, y 10 ng / l, respectivamente, y añadirlos a los pozos / frascos.
    8. Suero Treat células de hambre mediante la adición de citoquinas solubilizadas directamente a los medios de cultivo de células de matraces apropiados. Los tratamientos consistieron de citoquinas individuales, un cóctel de todos los 3 (en lo sucesivo "* 3"), o sterile agua como control (denominado como "0").
    9. Incubar las células tratadas durante 24, 48 o 72 hr antes de la evaluación y la cosecha.
  2. Evaluación de la viabilidad de la célula
    1. Hacer una solución de 5 mg / ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) en 1X PBS.
    2. Para placas de 12 pocillos, añadir 100 l de solución de MTT a cada pocillo y agitar suavemente para asegurar una distribución uniforme.
    3. Incubar las placas durante 15 minutos-1 hora a 37 ° C en el 5% de CO 2, y se les presentarán bajo un microscopio para detectar la presencia de coloración púrpura. Si no está presente púrpura, agitar de nuevo y permiten a las células se incuban en intervalos de 5 minutos hasta que se observa de color púrpura. La cantidad de tiempo necesario debe ser determinado por cada investigador.
    4. Usando una pipeta de repetición, añadir 700 l de MTT disolvente (HCl 4 mM y 0,1% de NP40 en isopropanol) a cada pocillo y la placa de roca (s) a temperatura ambiente durante 5-10 minutos, o hasta que todo el color púrpura había dejado las células . Si púrpurael color no sale de las células, agregar un adicional de 200 l de disolvente y continuar a girar.
    5. Para el análisis, tomar 100 l de cada pocillo y colocar en una placa de 96 pocillos y leer en un lector de placas utilizando 570 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm, 595 nm, sin embargo también es aceptable siempre y cuando las lecturas se toman a una configuración coherente.
  3. Modelo Animal de ALS
    1. Todos los experimentos con animales se ajustaban a los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por la Universidad de Wake Forest Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Las parejas reproductoras para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de ratón se obtuvieron de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). De tipo salvaje (WT) hembras y machos SOD1G93A no transgénicos [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fueron criados para generar ratones SOD1G93A y WT littermates no transgénicos que fueron utilizados en los experimentos.
    2. Realizar genotipado con cebadores estándar contra SOD1 mutante 25.

2. Aislamiento de las mitocondrias

NOTA: Es importante trabajar con rapidez y mantener todo en hielo durante todo el procedimiento.

  1. Preparación de tampón de aislamiento mitocondrial (MIB), tampón de aislamiento de la médula espinal (SC MIB) y tampón experimental (EB)
    1. Preparar las siguientes soluciones madre antes de tiempo para MIB y EB.
    2. Hacer 1 M Tris / MOPS disolviendo 12,1 g de base Tris en 70 ml de H 2 O. Añadir MOPS secos para conseguir el pH a 7,4. Ajuste el volumen al 100 final ml. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C.
    3. Hacer 1 M Kphos mezclando 80,2 ml de K 2 HPO 4 y 19,8 ml de KH 2 PO 4. Guarde a temperatura ambiente.
    4. Hacer 0,2 M EGTA / Tris mediante la adición de 3,8 g de EGTA a 10 ml de H 2 O. Añadir 1 M Tris / MOPS hasta disueltos, ~ 30-40 ml. Ajuste a 50 ml, filtro estéril y se almacena a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que el pH será ~ 6,7.
    5. Hacer 1 M glutamato haciendo 10 ml deSolución de ácido glutámico 1 M. Se esteriliza con filtro y almacenar 4 ° C.
    6. Hacer 1 M Malate haciendo 10 ml de solución de ácido málico 1 M. Añadir Tris / MOPS 50 mM. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C.
    7. Hacer MIB a una concentración de sacarosa 200 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, y 1 mM EGTA / Tris. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C.
    8. Hacer SC MIB a una concentración de sacarosa 250 mM, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, KCl 10 mM, 1,5 mM de MgCl 2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, y cóctel inhibidor de la proteasa.
    9. Hacer EB a una concentración de 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM de glutamato, malato 2,5 mM, 1 mM de fosfato de K, pH 7,4, y 10 mM EGTA / Tris. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C.
  2. Preparativos de los equipos antes de recoger las células.
    1. Enjuague un pequeño recipiente de vidrio y homogeneización maja tres veces con agua estéril y colocar en hielo.
    2. Reúna los elementos necesarios, tales como un taladro estándar, scra celularpers, 1,5 ml, 15 ml y 50 ml tubos y soluciones.
  3. Aislamiento Las mitocondrias
    1. Las células cultivadas
      1. Para cada tipo de muestra, utilizar dos matraces T175 de células.
      2. Asegurar que las células son ~ 90% de confluencia y el uso en experimentos de control, o la placa y tratar como se describió anteriormente en el paso 1.2.
      3. En la parte superior del banco, los medios de comunicación Aspirar y lavar las células adherentes dos veces con 15 ml de 1x PBS cada vez.
      4. Aspirar el tampón y raspar frascos para eliminar las células adherentes del fondo del matraz.
      5. Añadir 15 ml de 1x PBS a cada frasco, remolino, y transferir a los distintos tubos de 15 ml cónicos y lugar en el hielo.
      6. Una vez raspado se realiza, centrifugar los tubos durante 5 min a 700 xg, 4 ° C utilizando una centrífuga de mesa usando un rotor de cubeta oscilante.
      7. Sobrenadantes Aspirar y resuspender cada sedimento en 1 ml de MIB.
      8. Combinar ambas suspensiones y transferir a un pequeño recipiente de vidrio para la homogeneización.
      9. Añadir MIBal recipiente hasta que alcanza el tampón de primera línea. Homogeneizar las células con la mano del mortero conectados a un taladro a velocidad media durante tres pasadas. Asegúrese de que el buque se encuentre en el hielo durante este paso, no para quitar la mano del mortero por encima del líquido y usar una velocidad constante con pases continuos.
      10. Transferir la solución homogeneizada a un tubo cónico de 50 ml.
      11. Aspirar la solución en una jeringa de 3 ml usando un manómetro 18 de la aguja 1 ½ pulgadas y expulsar de nuevo en el tubo cónico en hielo con un calibre de 27 ½ pulgadas aguja. Tener cuidado para expulsar la solución contra la pared interior del tubo como para utilizar esa fuerza para disrupción de la membrana celular.
      12. Repita los pasos de jeringas para un total de cinco veces.
      13. Transferir la solución a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar durante 5 min a 600 xg, 4 ° C en una centrífuga de mesa usando un rotor de cubeta oscilante.
      14. Retire con cuidado el sobrenadante y distribuir entre los tres tubos de 1,5 ml.
        NOTA: Mitochondria son en el sobrenadante después de esta primera, spin-baja velocidad, mientras que las membranas celulares y las células intactas se sedimentan.
      15. Tubos de centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min.
      16. Sobrenadantes Aspirar y combinan las pastillas en 100 l MIB y colocan inmediatamente en hielo.
        NOTA: Las mitocondrias son en el sedimento después de este giro de alta velocidad. Las mitocondrias normalmente mantienen su potencial de membrana para ~ 2-3 ion hielo después de aislamiento y son más estables como una solución madre concentrada en MIB.
    2. Las mitocondrias aislamiento a partir de tejido de ratón
      1. Anestesiar el ratón, según el protocolo del IACUC. Establecer un vaporizador en el 5,0% para inducir la anestesia. Confirmó que el animal está anestesiado por la falta de reflejo para pizca pie o reflejo de parpadeo cuando el ojo se acerca o golpeó con un hisopo de algodón. Mantenga el ratón bajo anestesia durante todo el procedimiento quirúrgico manteniendo el vaporizador entre 1,5% y 2,0%.
      2. Excise el hígado y la médula espinal de cada animal y el lugar por separado en el hielo frío PBS 1x - / - para retirar cualquier sangre.
      3. Para el hígado, el tejido transferir a un plato de pesaje en hielo y cortar en trozos finos usando una cuchilla de afeitar fresco durante 1 min.
      4. Añadir el tejido y el tampón apropiado (MIB para el hígado o SC MIB para la médula espinal) al recipiente hasta que alcanza el tampón de primera línea. Homogeneizar los tejidos con la mano del mortero con la mano durante cinco pases. Asegúrese de que el buque se encuentre en el hielo durante este paso, no para quitar la mano del mortero por encima del líquido y usar una velocidad constante con pases continuos.
      5. Transferencia de los homogeneizados para limpiar tubos de 15 ml.
      6. Tubos de centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 750 xg, 4 ° C durante 10 min.
      7. Guarde los sobrenadantes en tubos limpios y colocarlos en hielo.
        NOTA: Las mitocondrias son en el sobrenadante después de esta primera, spin-baja velocidad, mientras que las membranas celulares y las células intactas se sedimentan.
      8. Vuelva a suspender los pellets de la médula espinal in 500 l de SC MIB.
      9. Vuelva a homogeneizar cada tres veces, sólo llenar el vaso medio camino con SC MIB este momento.
      10. Transferir la nueva homogeneizado a un tubo nuevo.
      11. Centrifugar la en un rotor de ángulo fijo a 750 xg, 4 ° C durante 10 min.
      12. La combinación de estos nuevos sobrenadantes, que contienen más mitocondrias, con el primer sobrenadante de cada muestra.
      13. Tubos de centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min.
      14. Sobrenadantes Aspirar y volver a suspender los pellets de hígado en 500 l de MIB y los pellets de la médula espinal en 50 l SC MIB y colocar inmediatamente en hielo.
        NOTA: Las mitocondrias son en el sedimento después de este giro de alta velocidad. Las mitocondrias normalmente mantienen su potencial de membrana para ~ 2-3 ion hielo después de aislamiento y son más estables como una solución madre concentrada en MIB.
      15. Realizar un ensayo de concentración de proteína para estimar la concentración de las mitocondrias en solución. Siga las instruccioness para el uso de un kit de ensayo de proteína comercial o método similar 26. Las concentraciones típicas de las mitocondrias son: frascos T175 rendimientos 2 ~ 2 mg / ml, 1 hígado de ratón ~ 3-5 mg / ml, y 1 médula espinal de ratón ~ 1-3 mg / ml.
  4. C Ensayo citocromo utilizando un I + D de rata / ratón citocromo c Quantikine Kit ELISA (adaptado del protocolo proporcionado por el fabricante).
    1. Inmediatamente antes de la creación de las reacciones, diluir las mitocondrias a / ml concentración de trabajo de 0,5 mg de EB y distribuir mitocondrias diluido en tubos de 1,5 ml para las reacciones (típicamente 30-50 l de mitocondrias por tubo).
    2. Añadir ya sea EB o DMSO, a 1% del volumen total, a la mitocondria diluidos y se incuban las reacciones en la mesa de laboratorio durante 7-10 min. Estas reacciones son estables hasta por 30 minutos a temperatura ambiente si se necesita un plazo más largo.
    3. Mitocondrias precipitado mediante centrifugación en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min y cuidadosoLy separar el sobrenadante y colocar cada uno en un separadas tubos de 1,5 ml.
      NOTA: Los tubos pueden ser o bien se congeló a -20 ° C para su posterior análisis o usarse inmediatamente.
    4. Determinar la liberación de citocromo c por una comparación de la concentración de citocromo c en el sedimento y el sobrenadante 27.
      1. Preparar las muestras mediante la solubilización de los pellets en el volumen original de la reacción con 0,5% TX-100 en 1X PBS.
      2. Para cada muestra, preparar 2 pocillos de la placa ELISA, uno para el pellet ahora solubilizado y uno para el sobrenadante de la reacción por adición de 100 l de citocromo c conjugado (usar directamente fuera de la botella), además de 100 l de 0,5% Tx- 100 en 1X PBS, y luego, de la muestra de pellets o sobrenadante.
      3. Agite suavemente la placa a temperatura baja (nivel 2-4) durante 20 segundos para mezclar, cubrir e incubar durante 1 hora, 37 ° C.
      4. A continuación, lavar la placa cuatro veces con tampón de lavado diluido de acuerdo con la Productoresinstrucciones de er. Retire el exceso de solución golpeando los pozos en una toalla de papel.
      5. A continuación, añadir 150 ml de 1: 1 A + B solución de desarrollo a cada pocillo e incubar la placa durante 20-30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
      6. Por último, añadir 50 l de solución de parada a cada pocillo y tomar lecturas de absorbancia a 540 nm usando un lector de microplacas. Calcular la cantidad de la liberación del citocromo c mediante la comparación de la cantidad de citocromo c en el sedimento vs. sobrenadante para cada reacción.

3. Evaluación de la función mitocondrial (Dys)

  1. Inmediatamente antes de las reacciones se configuran, diluir las mitocondrias a 0,5 mg / ml concentración de trabajo con EB y se coloca en tubos de 1,5 ml para las reacciones (típicamente 30-50 l de las mitocondrias se utilizan por tubo).
  2. Tratamientos mitocondriales
    1. Añadir tratamientos adecuados (control EB, 1 mM FCCP mezcla con 50 nM valinomicina, 10 mM rotenona, 5 oligomicina mu M, 2 mM de KCN, o 200 mM ADP, concentraciones finales) para separar las reacciones en 1/10 del volumen total de las mitocondrias diluidas. Se incuban las reacciones sobre la mesa de laboratorio durante 7 min.
      NOTA: Se debe tener cuidado al manipular estas sustancias como la ingestión accidental o absorción a través de la piel podría ser perjudicial.
    2. Diluir TMRE, reconstituida en agua estéril a una concentración de trabajo de 100 mM y se almacenaron a -20 ° C, a 2 M y añadir un volumen igual al volumen de reacción mitocondrial.
    3. Se incuban las reacciones sobre la mesa de laboratorio durante 7 min.
    4. Mitocondrias precipitado mediante centrifugación en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min.
    5. Medio de carga del volumen de sobrenadante de cada muestra en una placa de 396 pocillos y se lee la fluorescencia.
      NOTA: longitudes de onda de excitación y emisión de TMRE deben optimizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el volumen y la placa que se utilizará parael ensayo. El uso de un 384 pocillos placa estándar negro con 25 l de 1 mM TMRE (concentración final de reacción) se obtuvo la señal más fuerte utilizando longitudes de onda de excitación / emisión   485 nm / 535 nm.
    6. Calcular el pliegue diferencia en fluorescencia entre el control (EB) y cada tratamiento dividiendo el valor de fluorescencia relativa (RFU) obtenido a partir del lector de placas para la muestra experimental por el RFU de la muestra de control.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El tratamiento de células HEK-293T con 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, y 75 ng / ml de IFN-γ (* 3) durante 24-48 hr conduce a cantidades progresivas de la muerte celular (Figura 1A ). La viabilidad celular se evaluó mediante ensayos de MTT y consistentemente demuestra que no es de ~ 10% de disminución en la viabilidad celular con el tratamiento 24 hr y ~ disminución del 20% con el tratamiento 48 hr. Las células tratadas con concentraciones similares (100 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, y 75 ng / ml de IFN-γ) producir resultados similares de muerte celular en 48 horas, y el tratamiento con citoquinas individuales revela que la disminución de viabilidad se debe a combinatoria afecta (Figura 1B). Los datos de viabilidad en la Figura 1B representan la media +/- desviación estándar de 3 experimentos separados, cada uno por triplicado, y la estanqueidad de las barras de error muestran la reproducibilidad de los datos. La cantidad de citocinas se puede ajustar en este protocolo de tratamiento a más elucidate la contribución de cada citoquina sobre la muerte celular, y las citocinas adicionales u otros factores también podrían incluirse, siempre se ejecutan como controles apropiados.

Aislamiento de las mitocondrias a partir de células y tejidos ha sido descrito en la literatura desde la década de 1940 28,29. La premisa para el procedimiento es la disrupción celular seguido por centrifugación diferencial, donde se sabe que las mitocondrias de crudo para sedimentar en ~ 10.000 x g. Muchos protocolos que utilizan mitocondrias aisladas requieren membranas dobles intactos que pueden mantener su potencial de membrana, por lo que es necesario para evaluar la integridad una vez que el aislamiento es completa. Durante el desarrollo del protocolo de aislamiento de las mitocondrias de las células HEK en cultivo, se utilizó un ensayo de citocromo c para indicar si se obtuvieron las mitocondrias intactas. Uso de citocromo c disponible comercialmente kits de ELISA, las mitocondrias se cuantificaron después de aislamiento y se diluyeron en EB, y luego o bien EB o DMSOañaden y las reacciones a incubar en la parte superior del banco. Entonces, mediante la separación de las mitocondrias de los alrededores de sobrenadante, se utilizó el análisis de contenido de citocromo c de ambas fracciones como un indicador para la membrana mitocondrial intacto; si la mayoría de citocromo c se retiene en el pellet mitocondrial continuación, las mitocondrias se considerarán intactas, mientras que si más del 15% de la citocromo c se encuentra en el sobrenadante, a continuación, las mitocondrias fueron considerados inadecuados para los estudios funcionales. Como se ve en la Tabla 1, el protocolo descrito rendimientos ~ 12% la liberación del citocromo c y ~ 15% cuando las mitocondrias aisladas son pre-tratados con DMSO. Resultados similares han sido reportados previamente para mitocondrias aisladas de otras líneas de células o tejidos de animales 19,20,27. Alternativamente, la integridad mitocondrial también se puede evaluar con TMRE, que se utilizó durante el aislamiento de las mitocondrias de hígado de ratón y la médula espinal. Durante developme inicial protocolo de aislamientont, ensayos evaluaron las mitocondrias aisladas de hígado y médula espinal de ratones normales, mitocondrias sanas. Para cada muestra, ΔΨ se evaluó mediante la comparación de la señal fluorescente de las mitocondrias aisladas tratados con EB a las incubadas con FCCP + valinomicina (Tabla 2). Una proporción de fluorescencia entre mitocondrias de> 1 tratadas y no tratadas fue utilizada como una indicación de las mitocondrias sanas, intactas.

Una vez que se han desarrollado protocolos de aislamiento mitocondrias exitosas, las mitocondrias aisladas de control, las células no tratadas y * 3 de citoquinas células tratadas, o se analizaron los ratones normales y SOD1. Mitocondrias HEK de ambos grupos fueron tratados con diversos desacopladores y los inhibidores y ΔΨ medidos por los cambios en la absorción de TMRE. La diferencia veces en el control EB tratada mitocondrias para desacoplador / inhibidor mitocondrias tratadas indica una diferencia en la fuerza de ΔΨ entre los dos grupos (datos representativos y calculations en la Tabla 3). Por otra parte, el porcentaje de disminución de las células no tratadas a * 3 células tratadas significan que la salud mitocondrial se vio afectado por los tratamientos de citoquinas, corroborando los datos de viabilidad celular (Figura 2). Evaluación de la fuerza a través de ΔΨ TMRE captación usando mitocondrias aisladas de hígado y médula espinal de cuatro ratones individuales normal, de control, en comparación con cuatro ratones con ELA indican que la salud del tejido también se puede evaluar usando este protocolo. Como se ilustra por las diferencias de plegado y disminuciones porcentuales en ΔΨ, la comparación de EB-tratamiento y FCCP + valinomicina-tratamiento de las mitocondrias de animales control y avanzado de la enfermedad son significativamente diferentes (Tabla 4; véase también referencia 13 y 14).

Figura 1
Figura 1: La muerte celular induced * 3 por tratamiento es progresivo en el tiempo y mayor que con los tratamientos de citoquinas individuales. Las células HEK-293T (A) fueron tratados durante 24 o 48 horas y la muerte celular se midió usando un ensayo MTT. Los valores se normalizaron a control, las muestras no tratadas y los datos representan mediciones por triplicado para n = 3, +/- la desviación estándar. (B) células HEK-293T fueron tratados con citoquinas individuales o un cóctel (* 3) durante 48 horas y la muerte celular evaluada mediante ensayo de MTT. Los datos representan n = 5 para cada uno de citoquina individual y n = 6 para * 3, +/- la desviación estándar.

Pellet (AU) El sobrenadante (AU) % De liberación de citocromo c
0 0,818 0,115 12.6 ± 2.27
DMSO 0,793 0,142 15,3 ±; 2.23

Tabla 1:. La retención de citocromo c en mitocondrias aisladas de células cultivadas datos representan la media de n = 4, +/- la desviación estándar.

hígado 1 hígado 2 médula espinal 1 médula espinal 2
RFU EB 97830 94132 339716 290154
F / V 435188 461299 385366 482480
proporción 4.45 4.9 1.13 1.66
EB = búfer experimental y F / V = ​​+ FCCP valinomicina.

Tabla 2:. Medida de ΔΨ de las mitocondrias aisladas de tejidos normales de ratón Dos animales separados se utilizan para aislar las mitocondrias de hígado y la médula espinal en tándem (por ejemplo, hígado y la médula espinal 1 1 son del mismo animal).

EB oligo podredumbre KCN ADP F / V
RFU 0 4844 12507 12734 9925 10892 4844
* 3 6517 13639 12435 10235 13154 6517
Diferencia Fold 0 N / A 2.58 2.63 2.05 2.25 2.65
* 3 N / A 2.09 1.91 1.57 2.02 2.18
% De disminución 0 vs. * 3 18.94 27.41 23.35 10.24 17.67
EB = búfer experimental; oligo = oligomicina; pudrirse = rotenona; KCN = cianuro de potasio, y F / V = ​​+ FCCP valinomicina.

Tabla 3: Los datos brutos y los cálculos de celda culture aislado experimentos mitocondrias.

Figura 2
Figura 2: mitocondrias aisladas de citoquinas de las células tratadas han disminuido el potencial de membrana. Porcentaje de disminución de ΔΨ de 0 vs. * 3 para cada tratamiento en comparación con el control, tal como se calcula en la Tabla 2. Los datos representan las medias de las reacciones duplicadas para n = 3 (oligomicina, rotenona, y FCCP / valinomicina) o n = 2 ( KCN y ADP) +/- desviación estándar. * = Estadísticamente significativos los valores de p basado en cálculos de diferencias de plegado; p = 0,03, 0,01, y 0,05 para oligomicina, rotenona y FCCP / valinomicina, respectivamente.

Médula Espinal Hígado
Doble Diferencia Control 1,54 ± 0,48 3,20 ± 1,56
SOD1 1,10 ± 0,30 3.12 ± 1.75
% De disminución 28.1 2.48
p-valor 0.03 0.41

Tabla 4: mitocondrias aisladas de médula espinal de ratones SOD1 han disminuido el potencial de membrana según la evaluación de FCCP + valinomicina datos representan la media de 4 animales por grupo..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El tratamiento de células HEK-293T con citoquinas recombinantes hace que cantidades moderadas de la muerte celular durante 48 hr (Figura 1). La cantidad de muerte celular inducida por el tratamiento TNF-alfa es similar a los estudios reportados previamente 30 y la viabilidad celular disminuye después de la co-administración de múltiples citoquinas que son mayores que las cantidades acumulativas con cualquier citoquina sola también es coherente con la literatura 31,32. La capacidad de ajustar las cantidades y tipos de tratamientos de citoquinas, así como la comparación de cócteles a citoquinas individuales hacen de este modelo de cultivo celular atractivo para el estudio de los efectos específicos de la exposición de citoquinas en células renales. Además, los resultados son muy reproducible y fácil de lograr (Figura 2). Consideraciones a tener en cuenta incluyen la confluencia de las células. Por ejemplo, las células tratadas en 100% de confluencia no responden tan bien a las mismas concentraciones de citoquinas cuando se trató a 70-80% confluencia. Por otra parte, el número de pasos que las células han pasado por debe ser seguido, como respuesta de las células posiblemente podría haber sido influenciado en la cultura durante demasiado tiempo (más de 8-12 semanas desde la descongelación). Mientras que el tratamiento de las células cultivadas con citoquinas disminución de la viabilidad celular y la salud mitocondrial posteriormente, es de ninguna manera un modelo de sepsis per se. Sin embargo, el uso de un modelo más clínicamente relevantes, tales como el empleo de células renales primarias aisladas de ratones y / o tratamiento con citocinas secretadas de forma natural a partir de células estimuladas THP1 33, es una extensión natural de esta obra. Dada la brecha en la comprensión de la insuficiencia renal durante la sepsis, tales modelos de cultivo celular y evaluación de la mitocondria podría proporcionar una visión inicial de los mecanismos, así como una plataforma preliminar para probar la eficacia de compuestos farmacéuticos como tratamientos preventivos o de intervención.

Mitocondrias aisladas de células cultivadas o tejidos de origen animalpermitirse la capacidad de evaluar rápidamente el impacto de los tratamientos celulares o progresión de la enfermedad en la salud mitocondrial. Los protocolos de aislamiento y de evaluación no son exigentes técnicamente para llevar a cabo, y podrían ser fácilmente modificados para su uso con otras líneas de células o tejidos primarios. El MIB y EB utilizada para cada tipo de muestra son buenas recetas de partida que se pueden ajustar según sea necesario si una célula o tejido tipo particular tiene diferentes requisitos. Por ejemplo, la adición de BSA libre de ácidos grasos es normalmente necesario para el uso con las neuronas, como incluido con el protocolo de la médula espinal 15,34. El método de interrupción de la célula también se puede modificar mediante el uso de más expulsiones de jeringa o el cambio de la homogeneización a mano en lugar de usar un taladro, o viceversa. Además, re-homogeneización de la primera residuo de centrifugación, como se hace en el procedimiento de la mitocondria de la médula espinal, puede ser necesario para obtener una cantidad satisfactoria de las mitocondrias. Un buen indicador de que un protocolo de aislamiento produce mitochondri viablesa es el uso de la citocromo c ELISA. Este ensayo es una alternativa rápida y fácil a análisis de transferencia Western de la liberación del citocromo c y es también una evaluación útil de la liberación del citocromo c de las mitocondrias después del tratamiento con péptidos u otros compuestos 19,27. Alternativamente, TMRE se puede utilizar durante el desarrollo del protocolo, pero es importante para evaluar las mitocondrias aisladas de una muestra que se sabe que es saludable. Además, cuando el aislamiento de las mitocondrias a partir de tejidos de ratón que no se describen de forma rutinaria en la literatura, mitocondrias de hígado pueden servir como un control positivo, así como utilizado para establecer una línea de base. Por ejemplo, como en este protocolo, los hígados de todos los animales, tanto durante el desarrollo del protocolo, así como experimentos fueron también extirpados y usados ​​para el aislamiento de las mitocondrias. Otra consideración para una preparación es la cantidad de mitocondrias obtenidos al final del procedimiento de aislamiento. Si la concentración de las mitocondrias es 1 mg / ml o menoslos resultados del ensayo pueden resultar poco fiables (observaciones no publicadas VDGM). O bien la cantidad de material de partida, MIB receta o el método de interrupción debe ser optimizado antes de pasar a ensayos funcionales. Una vez que se alcanza un protocolo de aislamiento de éxito, las mitocondrias también se pueden utilizar en otros ensayos tales como el contenido total de ATP y la generación de ATP 13,14.

El protocolo de la función de las mitocondrias aquí descrito permite la medición indirecta de la absorción mitocondrial de la TMRE potencial de detección de colorante usando un lector de placas fluorescente estándar. Después de las mitocondrias se han aislado y los productos químicos apropiados añadido, que se incuban con TMRE y luego sedimentaron. Mediante el tratamiento de células o animales enteros y aislar las mitocondrias antes de ΔΨ evaluación, variables de confusión como el transporte resistente a múltiples fármacos o flujo ATP se evitan. A continuación se analiza la cantidad de fluorescencia en el sobrenadante con el entendimiento de que la saludable la mitocondriael más fuerte su ΔΨ y por tanto más absorción de TMRE. Como resultado, la cantidad de fluorescencia en el sobrenadante debe ser menor en la mitocondria más saludables y no saludables en las mitocondrias. Mediante la inclusión de una EB-único tratamiento, la diferencia pliegue de fluorescencia entre este control y las mitocondrias desacopladas se puede calcular. Otra importante control con cada conjunto de reacciones correr es TMRE solo. El resultado de este control ofrece una lectura fluorescente máximo posible. Dado que la TMRE añadió a las reacciones se recién diluido, existe una variabilidad inherente. Por ejemplo, TMRE de sólo lectura de ~ 20.000, 25.000 y 30.000 se lograron en varias ocasiones durante el desarrollo del protocolo. Si la TMRE de sólo señal es mucho mayor que cualquiera de las muestras de las mitocondrias tratadas y / o si las mitocondrias tratadas no son significativamente diferentes de los no tratados, a continuación, el aislamiento de las mitocondrias junto era más probable no exitosa. La disminución en ΔΨ tal como se mide por una relación obtenidaal seguir este protocolo es similar a las cantidades reportadas previamente para el control, las células sanas 2,35. Comparación de los cambios ΔΨ de las mitocondrias aisladas de control de, células HEK-293T no tratadas y * 3 citoquinas de las células tratadas demostró que la disminución de la viabilidad celular observada en ensayos de MTT se traduce en disminución de la función mitocondrias. Este ensayo de lector de placa podría ser utilizado fácilmente con mitocondrias aisladas de cualquier fuente y utilizados para examinar modelos de enfermedades como la ELA, como se ha demostrado aquí 13,14.

Varios estudios han utilizado tintes fluorescentes-mitocondria específica para detectar MOMP, que eran importantes en la génesis de este ensayo lector de placas. Sin embargo, esos estudios o bien utilizan células enteras para detectar compuestos que bloquean o inducir MOMP 35.36, explorar nuevos ΔΨ detección tintes 2 o identificar otros formatos como la citometría de flujo en un microchip 37. Este protocolo es único, ya que describe anunciométodo etailed para aislar y utilizar las mitocondrias para investigar rápidamente los efectos del tratamiento de células enteras a través de la respuesta a los compuestos ΔΨ alteran conocidos. Este protocolo utiliza una variedad de desacopladores e inhibidores, e indica que cualquiera de ellos sería adecuado para evaluar la salud mitocondrial. Así, mientras este particular centros de investigación sobre los cambios mitocondriales debido al estrés celular o disfunción celular progresiva, el protocolo podrían también ser utilizados para explorar los cambios en el metabolismo mitocondrial a través de la utilización de compuestos específicos y / o la adición de fuentes de electrones, tales como succinato y NADH .

Consideraciones importantes al realizar la evaluación de las mitocondrias aisladas incluyen la coherencia en los volúmenes de tratamiento, manteniendo las mitocondrias en las MIB y diluirlas en EB inmediatamente antes de los tratamientos van a ser creado, y el uso de las mitocondrias dentro de 3 horas de aislamiento para garantizar su ΔΨ todavía siendo mantenido. Laelección de TMRE sobre otros tintes fluorescentes de mitocondrias específicas tales como JC-1 fue debido a la capacidad de utilizar pequeñas concentraciones y simplicidad de análisis de fluorescencia utilizando una sola longitud de onda. Este método podría llevarse a cabo de manera similar usando microscopía fluorescente 2,38 o citometría de flujo 37, sin embargo el uso de un lector de placas de toma menos tiempo y requiere menos 35 optimización. Además, este protocolo es mucho menos exigente técnicamente, más rápida de realizar, y más fácilmente reproducible en comparación con el uso de un electrodo de Clark 22 (Del Gaizo Moore, observaciones no publicadas). Titulando cantidades de cada tratamiento mitocondrial puede proporcionar más información sobre la función mitocondrial y la optimización de las concentraciones se debe realizar. El volumen total de las reacciones mitocondriales se puede ajustar a la habitación de la cantidad de muestra obtenida durante el aislamiento, así como el número de reacciones de tratamiento necesarias. Si es posible, una cantidad estándar de 50 μ; L se utiliza; sin embargo, tan poco como 20 l de mitocondrias produce resultados fiables.

Mientras ΔΨ se correlaciona con el consumo de oxígeno, el ensayo presentado, no mide directamente el consumo de oxígeno. Mientras la sonda de detección de oxígeno fluorescente tal como MitoExpress se han desarrollado, presumiblemente para evitar algunas de las caídas de la utilización de un electrodo de Clark antes citada, el precio por reacción y el requisito de grandes cantidades de mitocondrias por ensayo siguen siendo limitante. Por lo tanto, el uso de TMRE y desacopladores ΔΨ clásicos o inhibidores tiene varias ventajas. Una vez más, el análisis por lotes de múltiples muestras o múltiples tratamientos / muestra, reproducibilidad, menor requerimiento de material de partida y / o menor cantidad de mitocondrias aisladas requerido por reacción render este protocolo atractivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-glutamic acid Sigma G1251 Can use the potassium salt instead.
malic acid Sigma M8304 Can use the potassium salt instead.
KH2PO4 Sigma P0662
K2HPO4 Sigma P3786
EGTA Sigma E3889
Trisma base Sigma T6066
MOPS Sigma M3183
CCCP Sigma C2920 Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
Valinomycin Sigma V0627 Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucrose Fisher S5-500
KCN Mallinckrodt 6379 Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenone Sigma R8875 Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin Sigma O4876 Highly toxic. Made in ethanol.
ADP Sigma A2754
TMRE Sigma 8717-25mg Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEM Gibco 11965-084 1x regular (high glucose).
Pen/Strep Invitrogen 15140-155
L-glutamine Fisher SH3002101 Store aliquots at -20 °C
FBS Lonza 14-501F US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTA Sigma T4049
DMSO SIgma D2650
Protien Assay Dye (5x) Bio-Rad 500-0006 Any protein assay can substitute.
BSA Fisher BP1600-100 Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powder Sigma M2128 Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40) Sigma NP40S
Recombinant Human IL-1B Gibco PCH08014 Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alpha Gibco PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma Gibco PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-) Sigma D8537 Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit R&D systems DTC0 Human for HEK-293T cells. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
  2. Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
  3. Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
  4. Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
  5. Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
  6. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  7. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
  8. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
  9. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
  10. Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
  11. Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
  12. Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. (2011).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
  14. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
  15. Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
  16. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
  17. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
  18. Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
  19. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
  20. Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
  21. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
  22. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
  23. Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
  24. Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  27. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
  28. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  29. Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
  30. Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
  31. Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
  32. Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
  33. Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
  34. Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  35. Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
  36. Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
  37. Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
  38. Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics